基于網(wǎng)絡藥理學探討生脈散治療心律失常作用機制*

呂佳譽，崔向?qū)帲K文革

1.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南250014；2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京100053；3.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東濟南250014

生脈散由人參、麥冬、五味子三味藥組成，最早載于《醫(yī)學啟源》，后世亦稱之為生脈湯、參麥散、生脈飲、定肺湯等。生脈散具有益氣生津、斂陰復脈之效，是治療氣陰兩虛證的經(jīng)典方劑［1］。心律失常是心血管系統(tǒng)常見病癥，嚴重者可危及生命。隨著分子生物學和細胞電生理學技術的發(fā)展，心律失常的機制逐漸明晰，如KCND3鉀離子通道基因與心肌早期復極化有關［2］，SCN5A鈉離子通道蛋白與進行性惡性心律失常及擴張型心肌病［3］相關，連接蛋白43（Connexin-43，Cx43）脫磷酸作用會導致缺血/再灌注損傷心臟的心律失常和心肌細胞凋亡［4］，巨噬細胞的極化通過縫隙連接和KCa3.1激活導致心肌梗死后心律失常和異構復極化［5］，氧化應激可能導致心臟的結構重構和電重構，在心房顫動的發(fā)病機制中具有潛在作用［6］。

網(wǎng)絡藥理學在中醫(yī)藥研究領域的應用發(fā)展為藥物的大數(shù)據(jù)管理、中藥分子機制研究提供方便［7］，且能夠預測中藥復方治療臨床疾病的作用機制，篩選藥物有效成分，節(jié)約藥物研發(fā)費用［8］。生脈散在心血管疾病治療中的運用和研究較多。Ma等［9］發(fā)現(xiàn)生脈散可對急性心肌梗死所致心力衰竭房顫大鼠通過腫瘤壞死因子-β1（tumor necrosis factor-β1，TGF-β1）途徑抑制肌成纖維細胞分化、減少房顫的傳導率和縮短房顫持續(xù)時間，Wu等［10］實驗表明，生脈散可通過改善心肌梗死后心臟結構和減少Cx43的表達，降低心肌梗死大鼠心室顫動閾值等。為了深入探討生脈散治療心律失常的分子機制，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡，分析生脈散治療心律失常的潛在靶點及相關通路，為進一步研究提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生脈飲藥物成分篩選及靶點預測使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）和中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID）檢索生脈散的化學成分，根據(jù)成分毒藥物動力學（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）參數(shù)篩選生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18的主要活性成分，并對主要活性成分在TCMSP和STITCH網(wǎng)站中進行靶點預測，在Uniprot網(wǎng)站確定靶點的簡稱及編號。

1.2 心律失常疾病靶點檢索在TTD、DRUGBANK及DisGeNET 3個常用疾病數(shù)據(jù)庫中以“arrhythmic”作為關鍵詞進行檢索，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中篩選出分值較高的靶點，與另外兩個數(shù)據(jù)庫檢索出的靶點合并，去掉重復值，獲得心律失常疾病靶點。

1.3 生脈飲、心律失常共同靶點獲取及關鍵靶點的篩選將生脈飲的作用靶點和心律失常的疾病靶點錄入VENNY2.0網(wǎng)站并繪制韋恩圖（Venn diagram），獲得心律失常疾病與生脈飲藥物的共同靶點。將所得的共同靶點輸入STRING平臺，建立靶點間的相互作用網(wǎng)絡關系圖，利用STRING數(shù)據(jù)庫篩選出最高置信度（得分0.900）的靶點作為關鍵靶點，得出關鍵成分。

1.4 構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡運用DAVID數(shù)據(jù)庫對生脈散治療心律失常的關鍵靶點進行KEGG和GO通路富集分析，篩選出P＜0.01的重要通路，將成分、靶點、通路運用Excel表格建立對應關系，導入Cytoscape3.2.1并運用Network Analyzer插件對網(wǎng)絡進行分析，構建生脈散-心律失常的“成分-靶標-通路”網(wǎng)絡圖，根據(jù)關鍵參數(shù)自由度（degree）和介數(shù)（betweenness centrlity）進一步篩選關鍵通路。

2 結果

2.1 生脈飲有效活性成分及靶點使用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索人參、五味子的化合物，從TCMID數(shù)據(jù)庫中檢索麥冬的有效成分，將所有化合物根據(jù)設定的ADME參數(shù)篩選入血活性成分。人參22個，五味子8個，麥冬55個，刪除重復項，生脈散主要成分有84個；將人參、五味子、麥冬的成分在TCMSP中進行靶點預測，并在Pubchem網(wǎng)站查找其化合物smile號，在STITCH網(wǎng)站根據(jù)score值篩選其作用靶點，得到預測靶點，人參99個，五味子22個，麥冬59個，去掉重復的靶點，故生脈散作用靶點為127個。

2.2 心律失常疾病靶點結果分析通過對TTD、DRUGBANK及DisGeNET 3個數(shù)據(jù)庫進行“arrhythmia”關鍵詞檢索，TTD數(shù)據(jù)庫檢索到36個靶點，DRUGBANK數(shù)據(jù)庫檢索到108個靶點，DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索到589個靶點，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫選取靶點Score值高于平均值的靶點，共162個，與前兩個數(shù)據(jù)庫中的靶點合并，刪除重復靶點后共獲得心律失常疾病靶點180個。

2.3 共同關鍵靶點獲取結果

2.3.1 生脈飲、心律失常共同靶點韋恩圖使用VENNY2.1在線網(wǎng)頁計算結果并繪制出韋恩圖，得到人參、麥冬、五味子與心律失常各自共同靶點及各自所占比例，顯示出生脈散與心律失常的共同關鍵靶點30個，見圖1。

圖1 生脈散與心律失常交集靶點韋恩圖

2.3.2 關鍵靶點的篩選將2.3.1中篩選出的生脈散與心律失常共同靶點輸入String數(shù)據(jù)庫中，構建靶點間相互作用網(wǎng)絡，見圖2。設置highest confidence為0.9，分析得到23個關鍵靶點，關鍵成分19個，見表1。生脈散有效成分治療心律失常的關鍵靶點，通過Cytoscape3.2.1形成網(wǎng)絡圖，見圖3。

圖2 生脈散治療心律失常靶點功能相關網(wǎng)絡圖

2.4 構建成分-靶點-通路網(wǎng)絡

2.4.1 富集通路分析及重要通路篩選將生脈散治療心律失常的關鍵靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，做KEGG和GO通路分析，得到64個信號通路，根據(jù)P＜0.01篩選出36條重要通路，運用E Chart網(wǎng)站制作氣泡圖，見圖4。點的顏色從綠色到紅色代表P值從小到大，顯示生脈散作用于心律失常通路主要富集于鈣離子信號通路（Calcium signaling pathway）、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosinemonophosphate，cGMP）-PKG信號通路、環(huán)腺苷-3′，5′-磷酸（cyclic adenosinemonophosphate，cAMP）信號通路等，與交感神經(jīng)反射、信號轉導、離子通道等相關。

圖3 生脈散重要成分-靶點網(wǎng)絡圖

圖4 生脈散抗心律失常的通路富集分析

表1 生脈散治療心律失常重要靶點及成分

2.4.2 成分-靶點-通路網(wǎng)絡構建將篩選出的藥物關鍵成分19個，共同關鍵靶點23個，關鍵通路35個，使用Cytoscape 3.2.1軟件構建網(wǎng)絡，見圖5A。使用軟件中的“Network Analyzer”插件進行分析，根據(jù)節(jié)點度值和介數(shù)值顯示ADRB2、ADRA1B、ADRA1A、PTGS2、ADRA1D、ADRB1、CHRM3、CHRM1等靶點度值較高，根據(jù)度值、介數(shù)制作圖5B，以節(jié)點大小代表度值大小，以顏色深淺代表介數(shù)大?。徊⑵渲卸戎递^高的10個關鍵通路列于表2。

表2 生脈散治療心律失常重要通路

3 討論

3.1 中醫(yī)理論探討中醫(yī)學本無心律失常病名，因其臨床常見心悸、胸悶、氣短、驚慌不安等不能自主的自覺癥狀，并結合脈象的參伍不調(diào)，可參照中醫(yī)的“心悸、怔忡”辨證論治［11］。其病因多為外感六淫、七情內(nèi)傷、飲食勞倦、失治誤治、藥物影響等。病機現(xiàn)虛實兩端，虛者為心臟或兼有其他臟腑的氣血陰陽虧虛而致心神失養(yǎng)，實者為風、寒、熱、痰、濕、氣滯和血瘀致心神受擾［12］。生脈散中“人參之甘補氣，麥門冬苦寒，瀉熱補水之源，五味子之酸，清肅燥金”（《內(nèi)外傷辨惑論》），三者合用共奏大補上焦氣陰之功，使得氣充而脈復，故尤適宜于心悸、怔忡之氣陰兩虛者。臨床統(tǒng)計表明，生脈散及其加減、合方在治療各種心律失常方面有效，包括快速性心律失常［13］、緩慢性心律失常［14］、室性早搏［15］、房性早搏［16］、房顫［17］等及合并冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、風濕性心臟病、心肌炎等疾病。

3.2 多成分-多靶點-多通路治療機制本研究通過TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫篩選出生脈散有效活性成分84個，可能治療靶點127個，使用TTD、DRUGBANK及DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索出心律失常疾病靶點共180個，將藥物靶點與疾病靶點進行韋恩圖繪制，獲得兩者共同靶點30個。共同靶點輸入String中，得到生脈散治療心律失常靶點間相互作用網(wǎng)絡，根據(jù)置信度篩選出生脈散治療心律失常的關鍵靶點，如ESR2、SCN5A、CYP1A2、CYP2C19、MAOB、ADRA1A、MAOA、ADRB1、TNF、CHRM2、CHRM1、DRD1等共23個，關鍵成分19個，對關鍵靶點使用DAVID網(wǎng)站中的KEGG和GO通路富集進行分析，獲得64條信號通路，根據(jù)P值篩選，得到鈣離子信號通路（Calcium signaling pathway）、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、心肌細胞的腎上腺素能信號通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）等35條重要通路。通過使用Cytoscape 3.2.1構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡，顯示生脈散具有多成分、多靶點、多通路的復方作用特點，不同靶點和通路共同發(fā)揮藥效，具有治療心律失常的重要潛力。

3.3 重要通路分析房性心律失常可由鈣離子通路信號（Calcium signaling pathway）增加導致，心室重構亦與Ca2+信號系統(tǒng)有關［18］。大量臨床試驗研究表明，交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活是引發(fā)室性心律失常和心臟性猝死的重要機制［19］，心肌間質(zhì)中高濃度的腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺可導致心肌細胞鈣超載和交感神經(jīng)末梢本身的損傷，進而增加惡性心律失常的風險［20］。G蛋白家族與心血管疾病密切相關，G蛋白在心臟表達的亞型有Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13等，參與心肌收縮力、心率、心律等調(diào)節(jié)［21］。腺苷酸環(huán)化酶（adenyl cyclase，AC）是G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）下游的關鍵信號分子［22］，可通過調(diào)節(jié)cAMP的濃度參與多種生理病理過程，Gsα可激活AC，通過ACcAMP-PKA通路介導β-腎上腺素受體的正性頻率作用，還可通過cAMP直接作用于L型鈣離子通道，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放［23］，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)；Giα介導M2-膽堿受體激動劑的鉀離子通道激活，從而參與心率的調(diào)節(jié)。G蛋白偶聯(lián)的信號傳導系統(tǒng)（regulator of G-protein signaling system，RGSs）為作為治療心律失常的重要靶向途徑［24］。cGMP是細胞內(nèi)介導一氧化氮和利鈉肽作用的第二信使，細胞內(nèi)cGMP水平升高，通過cGMP依賴蛋白激酶等發(fā)揮生理作用，PKG1亞型可使細胞內(nèi)鈣離子濃度降低，或使肌肉細胞對Ca2+的敏感性降低而導致平滑肌松弛。唾液分泌（Salivary secretion）受自主神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)刺激而產(chǎn)生，交感刺激導致腺苷酸環(huán)化酶的激活和細胞內(nèi)cAMP的積累，副交感神經(jīng)刺激激活磷脂酶C，導致細胞內(nèi)Ca2+升高，此通路雖與抗心律失常的治療作用關系不甚密切，卻提示藥物可能帶來的不良反應。現(xiàn)在許多抗心律失常藥如普羅帕酮、地爾硫卓等均有口干等不良反應。

3.4 有效成分探討通過Cytoscape 3.2.1軟件構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡及“Network Analyzer”插件進行分析，得到度值及介數(shù)值較高的有效成分包括:豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、蘇齊內(nèi)酯（suchilactone）、山奈酚（kaempferol）、灌木遠志酮A（Frutinone A）、人參皂苷（ginsenoside rh2）、Fumarine、Inermin、Girinimbin、Gomisin R等，其中動物實驗表明山奈酚可通過影響Ca2+轉運蛋白減少應激誘導的室性心動過速的發(fā)作［25］，減少炎癥和氧化應激，抑制血管緊張素II誘導的心臟纖維化和功能障礙［26］；人參皂苷rh2可通過清除大鼠心肌組織內(nèi)ROS、提高抗氧化酶活性，從而降低大鼠體內(nèi)氧化應激水平、改善大鼠心肌損傷［27-28］；β-谷甾醇可通過上調(diào)谷胱甘肽氧化循環(huán)實現(xiàn)對雌性大鼠的心肌保護作用［29］等。有效成分的分子機制，仍有待進一步實驗研究和臨床實踐。