不同產(chǎn)地牛膝ISSR遺傳多樣性研究*

李曼，齊大明，王鑫源，李詢，邢冰，楊朝帆，董誠明

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450046

牛膝（Achyranthes bidentata B1.）為莧科牛膝屬多年生草本植物，以干燥根入藥，為常用大宗藥材品種之一，主產(chǎn)于河南溫縣、河南武陟、內(nèi)蒙古赤峰、河北安國等地，有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，繁殖方式主要是種子繁殖，種子分為秋子和蔓薹子?，F(xiàn)有研究表明，不同產(chǎn)地牛膝在化學(xué)成分含量方面存在差異［1-4］。近年來，對于牛膝的研究也多集中在化學(xué)、藥理等方面［5-9］，關(guān)于分子標(biāo)記研究牛膝遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的報(bào)道較少［10-11］。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記（intersimple sequence repeat，ISSR）具有穩(wěn)定、多態(tài)性高、簡便及易操作等優(yōu)點(diǎn)，被視為理想的遺傳標(biāo)記方法［12］。目前ISSR已在多種動植物的親緣關(guān)系、種質(zhì)鑒定等研究方面得到應(yīng)用［13］。本研究應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記法，分析不同產(chǎn)地牛膝的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，對牛膝規(guī)范化種植及資源開發(fā)等方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材采集內(nèi)蒙古、河北、河南等地的牛膝種子；牛膝經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為莧科植物牛膝（Achyranthes bidentata B1.）。采集信息見表1。

表1 采集信息表

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器NanoDropTMOne超微量紫外分光光度計(jì)（美國賽默飛公司）；超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；C1000 TouchTM梯度PCR儀（美國伯樂公司）；JW-2018H冷凍高速離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；DYCP-31E型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）；GelDoc XR+凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）；LDZM-80KMS型立式蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；BCD-215KS型冰箱（青島海爾股份有限公司）；迷你掌上離心機(jī)（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；微量移液槍（德國艾本德有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑DNA提取試劑盒（批號:CW0531M）、2×Es Taq MasterMix（Dye）、Gold View I型核酸染色劑、DM2000、DM15000、2×Es Taq MasterMix（Dye）等（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；瓊脂糖、Tris［三（羥甲基）氨基甲烷］（北京索來寶科技有限公司）；10×Lodding Buffer［寶生物工程（大連）有限公司］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA的提取及檢測取保存的牛膝樣品，采用植物試劑盒方法提取基因組DNA。將所得的DNA溶液分別裝入滅菌后離心管中，于 -20℃保存。將保存的DNA用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓130V，電泳40min。在GelDoc XR+凝膠成像儀上成像，保存DNA檢測結(jié)果。

2.2 PCR引物的篩選、ISSR-PCR擴(kuò)增及檢測

參考牛膝、川牛膝以及莧科植物等［10，14-15］研究文獻(xiàn)中出現(xiàn)的引物，以及加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條ISSR引物序列，隨機(jī)選取2個(gè)牛膝樣品模板DNA，采用最優(yōu)ISSR-PCR體系中的擴(kuò)增條件，從ISSR引物中篩選出16條反應(yīng)體系較穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶較清晰且多態(tài)性較多的引物，最優(yōu)引物序列見表2。PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，含有DNA樣品1μL，引物1μL，2×Es Taq MasterMix（Dye）10μL，加ddH2O至體積20μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變形5 min，95℃變性1 min，52～57℃退火1 min，72℃總延伸5 min，共35個(gè)循環(huán)，4℃保存。PCR產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液中電泳40 min，電壓為130V。Marker為2 000 bp。電泳后，在GelDoc XR+凝膠成像儀上拍照并保存DNA檢測結(jié)果。

2.3 數(shù)據(jù)分析根據(jù)樣品ISSR擴(kuò)增譜帶信息，按照鄒喻萍等［16］制定的標(biāo)準(zhǔn)，以擴(kuò)增條帶有計(jì)為“1”，無計(jì)為“0”。用Quantity One軟件對圖譜上的條帶進(jìn)行人工標(biāo)記，并導(dǎo)出為0-1矩陣的數(shù)據(jù)。采用POPGENE3.2軟件計(jì)算出遺傳特征值:有效等位基因數(shù)（ne）、觀測等位基因數(shù)（na）、多態(tài)性位點(diǎn)比例（P）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、遺傳分化系數(shù)（Gst）、基因流（Nm）等，進(jìn)行遺傳多樣性分析。用NTSYS2.10軟件對不同產(chǎn)地牛膝進(jìn)行個(gè)體間的UPGMA聚類分析。

表2 最優(yōu)引物序表

3 結(jié)果

3.1 SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果用篩選出的16條引物對6個(gè)采集地的39個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出251條條帶，在多態(tài)性條帶中其有效條帶數(shù)為233條，有效條帶數(shù)占總條帶數(shù)的92.83%。16條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)為8～23條，引物UBC-889擴(kuò)增出的條帶最多為23條；16條引物在所有樣品中所擴(kuò)增出的引物有效條帶數(shù)為8～21條；引物在不同產(chǎn)地牛膝中擴(kuò)增出來的有效條帶數(shù)為0～16條；不同產(chǎn)地牛膝共擴(kuò)增出196條多態(tài)性條帶。PCR擴(kuò)增結(jié)果見表3，引物UBC-834對牛膝的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

3.2 牛膝遺傳多樣性分析對不同產(chǎn)地牛膝進(jìn)行遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表4。由多態(tài)性位點(diǎn)可知，牛膝的遺傳變異情況由低到高為HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HNAG＜HJWZM，變化范圍為19.92%～45.02%；由等位基因數(shù)（na）可知，牛膝的遺傳變異情況由低到高為HJWXM ＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HNAG＜HJWZM，變化范圍為1.199 2～1.450 2；由有效等位基因數(shù)（ne）可知，牛膝的變異情況由低到高依次為HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HJWZM ＜HNAG，變化范圍為1.159 0～1.268 5；由Nei′s基因多樣性指數(shù)（h）得出，牛膝的變異情況由低到高依次為HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HJWZM＜HNAG，變化范圍為0.088 5～0.159 0；依據(jù)香農(nóng)信息指數(shù)（I），牛膝的變異情況由低到高依次為HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HJWZM ＜HNAG，變化范圍為0.126 8～0.237 8。

表3 不同采集地ISSR引物擴(kuò)增條帶結(jié)果

圖1 引物UBC-834對牛膝的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖

對不同產(chǎn)地牛膝的遺傳多樣性進(jìn)行分析評價(jià)可知，香農(nóng)信息指數(shù)（I）、Nei′s基因多樣性指數(shù)（h）、有效等位基因數(shù)（ne）、多態(tài)性位點(diǎn)和等位基因數(shù)（na）對牛膝的變異情況基本一致。

表4 牛膝的遺傳變異分析結(jié)果（±s）

表4 牛膝的遺傳變異分析結(jié)果（±s）

類型 樣本數(shù) 多態(tài)性位點(diǎn)（P）/個(gè)（%）等位基因數(shù)（na）有效等位基因數(shù)（ne） Nei′s基因多樣性指數(shù)（h） 香農(nóng)信息指數(shù)（I ）0.237 8±0.282 1 NMCF 7 93（37.05）1.370 5±0.483 9 1.222 1±0.330 4 0.132 7±0.184 3 0.199 4±0.269 9 HJWZQ 7 87（34.66）1.346 6±0.476 8 1.221 9±0.345 3 0.129 1±0.188 5 0.192 0±0.273 4 HJWZM 9 111（45.02）1.450 2±0.498 5 1.256 4±0.338 1 0.1544±0.1877 0.233 9±0.273 8 HJWXQ 6 95（37.85）1.378 5±0.486 0 1.240 1±0.348 0 0.141 0±0.190 8 0.210 1±0.277 8 HJWXM 3 50（19.92）1.199 2±0.400 2 1.159 4±0.320 2 0.088 5±0.177 9 0.126 8±0.254 7總共39 196（78.09）1.780 9±0.414 5 1.350 9±0.333 3 0.217 0±0.177 1 HBAG 7 109（43.43）1.434 3±0.496 7 1.268 5±0.350 3 0.159 0±0.193 8 0.337 6±0.248 1

3.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析對不同產(chǎn)地牛膝的遺傳結(jié)構(gòu)分析可知，牛膝的總遺傳多樣性指數(shù)（Ht）為0.223 7±0.033 7，種內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)（Hs）為0.134 1±0.013 9，基因分化系數(shù)（Gst）為0.400 3，不同種群間的基因流（Nm）為0.749 2，多態(tài)性位點(diǎn)的比例（P）為196（78.09%），香農(nóng)信息指數(shù)（I）為0.337 6±0.248 1。牛膝種群間的遺傳變異為40.03%，表明不同產(chǎn)地牛膝基因交流程度較高，遺傳分化較小。

3.4 遺傳距離與遺傳一致度對不同產(chǎn)地牛膝進(jìn)行遺傳距離與遺傳一致度分析，結(jié)果見表5。不同產(chǎn)地牛膝之間遺傳一致度為0.789 1～0.950 6、遺傳距離為0.050 7～0.236 9，表明不同產(chǎn)地牛膝間的親緣關(guān)系較近，不同繁殖類型牛膝親緣關(guān)系也相近。

表5 牛膝的遺傳距離與遺傳一致度

3.5 聚類結(jié)果分析

3.5.1 產(chǎn)地聚類分析對不同產(chǎn)地牛膝的遺傳一致度進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖2。系統(tǒng)聚類時(shí)其遺傳一致度為0.79～0.95。由相似系數(shù)0.87處可將牛膝分為2類，第Ⅰ類為HBAG、NMGCF、HJWZQ、HJWZM，第Ⅱ類為HJWXQ和HJWXM。第Ⅰ類繼續(xù)細(xì)分，又可分為2個(gè)亞類，HBAG 和NMGCF為一個(gè)亞類，HJWZQ和HJWZM 為另一個(gè)亞類。由聚類分析可知，河北安國、內(nèi)蒙古赤峰、河南武陟、河南溫縣間的親緣關(guān)系較近，秋子與蔓薹子親緣也較近。

3.5.2 個(gè)體間聚類分析使用Ntsys2.1軟件對6個(gè)采集地的39個(gè)樣品基于遺傳相似性系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類，聚類結(jié)果見圖3。聚類結(jié)果顯示，從相似系數(shù)0.75處劃分，39個(gè)樣品共聚為2類，樣品1-32聚為一類，表明內(nèi)蒙古赤峰、河北安國與河南武陟牛膝的親緣關(guān)系較近；樣品33-39聚為一類，相同產(chǎn)地的牛膝基本聚為一類，也有少數(shù)同一產(chǎn)地的牛膝樣品沒有聚在一類，如樣品13、14交錯(cuò)于樣品1-7之間，表明內(nèi)蒙古赤峰與河北安國的親緣關(guān)系較近；樣品22、24交錯(cuò)于樣品12-21之間，說明河南武陟秋子和蔓薹子的親緣關(guān)系較近；樣品31-36為河南溫縣的秋子和蔓薹子，其樣品相互交錯(cuò)著，表明河南溫縣秋子和蔓薹子的親緣關(guān)系一致。結(jié)合產(chǎn)地聚類和個(gè)體聚類結(jié)果可知，內(nèi)蒙古赤峰、河北安國、河南武陟、河南溫縣牛膝親緣關(guān)系較近，秋子與蔓薹子親緣較近。

圖2 牛膝遺傳聚類UPGMA聚類圖

圖3 個(gè)體間遺傳聚類的UPGMA聚類圖

4 討論

本研究利用ISSR方法對不同產(chǎn)地牛膝進(jìn)行遺傳多樣性分析。由遺傳多樣性分析可知，不同產(chǎn)地牛膝基因交流程度較高，遺傳分化較小，孔德政等［17］對河南省內(nèi)8個(gè)野生牛膝種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示河南省內(nèi)的野生牛膝種群間的遺傳分化較低，種群間的基因交流較高，遺傳多樣性相對較低，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。由遺傳距離進(jìn)行親緣關(guān)系分析，不同產(chǎn)地牛膝之間遺傳一致度為0.789 1～0.950 6、遺傳距離為0.050 7～0.236 9，表明不同產(chǎn)地牛膝間的親緣關(guān)系較近；根據(jù)聚類結(jié)果分析可知，不同產(chǎn)地的牛膝遺傳結(jié)構(gòu)不嚴(yán)格按地理距離劃分，表明不同產(chǎn)地牛膝有較大的基因交流程度，在對產(chǎn)地聚類和個(gè)體聚類時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者結(jié)果相似，河北安國、內(nèi)蒙古赤峰和河南武陟親緣較近，河北安國和內(nèi)蒙古赤峰為近年來新興的牛膝主產(chǎn)區(qū)，由河南焦作道地產(chǎn)區(qū)引種栽培，雖已種植多年，但遺傳變異較小。秋子與蔓薹子因種子的繁殖方式不同對牛膝的生殖、產(chǎn)量等造成差異，但其遺傳物質(zhì)一致，由此遺傳多樣性較小，親緣關(guān)系相近。

ISSR分子標(biāo)記在親緣關(guān)系鑒定、遺傳關(guān)系、種質(zhì)鑒定等方面應(yīng)用較為廣泛。楊正久等［18］采用ISSR分子標(biāo)記，對21份貴州金錢草資源進(jìn)行聚類分析，分為2大類群6個(gè)亞群，貴州野生金錢草具有豐富的遺傳多樣性。巨秀婷等［19］采用ISSR分子標(biāo)記對5個(gè)新疆野生郁金香品種和19個(gè)郁金香栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明野生品種與栽培品種之間遺傳距離較遠(yuǎn)，且大部分栽培品種之間親緣關(guān)系較近，為合理利用野生郁金香種質(zhì)資源提供分子水平的研究基礎(chǔ)。因此，未來可通過分子標(biāo)記方法對牛膝親緣關(guān)系鑒定，結(jié)合不同產(chǎn)地牛膝的質(zhì)量評價(jià)，為牛膝規(guī)范化種植及資源開發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。