白花蛇舌草多糖對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制作用及機(jī)制研究*

賈羲，王娟，賈文瑞，聶安政

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州450003

肺癌作為世界上最常見的惡性腫瘤之一，目前雖然以手術(shù)、放化療、靶向治療、生物治療等為主的多種綜合治療方法使其療效有所提高，但其5年生存率不足14%［1］。目前化療是治療肺癌主要措施之一，但化療藥品毒性強(qiáng)，甚至降低患者免疫功能。雖靶向藥物的問世給肺癌的治療帶來了新的希望，而靶向藥物的耐藥性、不良反應(yīng)成了困擾臨床工作者的首要問題。因此，選擇一種療效顯著、毒性低的化療藥物尤為重要［2-3］。近年來，中醫(yī)藥在肺癌靶向治療的療程中起著一定的作用，如減輕不良反應(yīng)保證靶向治療療程的完整性、減輕肺癌癥狀改善生活質(zhì)量、增強(qiáng)抗腫瘤療效、逆轉(zhuǎn)靶向藥物耐藥、提高生存率等方面與靶向治療之間都存在明顯的互補(bǔ)性［4-5］。白花蛇舌草是茜草科耳草屬植物白花蛇舌草Oldenlandia diffusa（Willd.）Roxb.的干燥全草，味苦、甘，性寒，具有清熱解毒、活血化瘀、利濕通淋等功效［6］，化學(xué)成分包括有黃酮、蒽醌、甾醇、多糖、萜類和脂肪族類化合物等。在臨床治療中，白花蛇舌草應(yīng)用十分廣泛，常用于多種腫瘤和自身免疫性疾病治療［7］。癌癥方面主要用于肝癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌等，但對(duì)肺癌的研究尚顯不足。而多糖成分在肺癌方面研究尚未大規(guī)模研究［8］，研究者發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草多糖能提高免疫抑制小鼠的免疫功能，對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞株增殖具有一定抑制作用［9］。在體外實(shí)驗(yàn)中，白花蛇舌草的乙醇提取物可以抑制HT-29腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致DNA碎裂，質(zhì)膜不對(duì)稱丟失，線粒體膜電位塌陷，活化Caspase 9和Caspase 3，激活促凋亡基因Bax，并下調(diào)Bcl-2、Cyclin D1、PCNA、CDK4的基因表達(dá)，表明白花蛇舌草可以通過多種途徑對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行抑制［10-11］。此外，白花蛇舌草親脂性提取物和粗多糖對(duì)S-180腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，在抑制腫瘤生長的同時(shí)，白花蛇舌草粗多糖對(duì)化學(xué)藥物如環(huán)磷酰胺所致的免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)損傷具有一定的保護(hù)作用［12］。由此可知，白花蛇舌草在抗腫瘤方面存在廣闊前景。本研究通過建立Lewis肺癌小鼠模型，選取白花蛇舌草多糖為研究對(duì)象，觀察其對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制作用及腫瘤組織中VEGF、HIF-1α、Bcl-2、Bax基因表達(dá)影響，為白花蛇舌草的全面開發(fā)利用提供依據(jù)，也為臨床防止肺癌疾病提供用藥依據(jù)。

1 材料

1.1 瘤株及動(dòng)物L(fēng)ewis肺癌細(xì)胞（Lewis lung cancer cell，LLC），上海斯信生物科技有限公司；SPF級(jí)6～8周齡C57BL/6J小鼠85只，雌雄各半，體質(zhì)量19～22 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（魯）20140007。

1.2 藥物與試劑白花蛇舌草多糖，南京澤郎生物科技有限公司（白花蛇舌草g/水mL為1∶14，超聲提取30～40 min，重復(fù)提取3次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/4，sevage脫蛋白，加入乙醇，使乙醇濃度達(dá)到60%，靜置4 h，析出多糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)56%）；順鉑（DDP），江蘇恒瑞，批號(hào):20181021。白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）試劑盒（批號(hào):E20190115），白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）試劑盒（批號(hào):E20181216），腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor alpha，TNF-α）試劑盒（批號(hào):E20181228），干擾素-γ（Interferon gamma，TFN-γ）試劑盒（批號(hào):E20190117），血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）試劑盒（批號(hào):E20181222），缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）試劑盒（批號(hào):E20181223），基質(zhì)金屬蛋白酶-2（Matrixmetalloproteinase 2，MMP-2）試劑盒（批號(hào):E20190108），均購自蘇州卡爾文生物科技有限公司；Trizol試劑（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào):15596-019）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào):RP1200）。

1.3 儀器全自動(dòng)生化分析儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號(hào):BS200）；高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀，型號(hào):TD5A-WS）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器（美國ABI公司，型號(hào):7900HT）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將肺癌細(xì)胞于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，進(jìn)行培養(yǎng)，傳代，胰蛋白酶進(jìn)行消化，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 模型制備及給藥動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、模型組、順鉑組、白花蛇舌草多糖（高、中、低劑量）組，每組13只。空白組除外，其余各組小鼠于右腋皮下接種LLC懸液［13-14］，每只0.2 mL（細(xì)胞計(jì)數(shù)器選取活細(xì)胞數(shù)＞95%，濃度為1×107mL-1）。接種7 d后，選取造模動(dòng)物右腋下形成瘤塊者為成模動(dòng)物，最終動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)確定為每組10只（確保每組成模動(dòng)物數(shù)量統(tǒng)一）。各組小鼠給予相應(yīng)藥物，順鉑組腹腔注射6 mg·kg-1的DDP，隔日1次，白花蛇舌草多糖（灌胃劑量200 mg·kg-1、100 mg·kg-1、50 mg·kg-1），空白組及模型組給予同等體積生理鹽水灌胃，每天給藥1次，連續(xù)給藥21 d。

2.3 血清指標(biāo)檢測(cè)各組動(dòng)物于末次給藥2 h后，腹主動(dòng)脈取血，離心后取上清液，ELISA法檢測(cè)血清中IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ、VEGF、HIF-1α、MMP-2的水平。

2.4 抑瘤作用處死各組小鼠，取出完整腫瘤組織稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率＝（模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%

2.5 RT-PCR法檢測(cè)肺癌組織中VEGF mRNA、HIF-1α、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)取瘤體組織適量，研磨并加入1 mL的Trizol混合均勻，提取上層RNA溶解物后測(cè)濃度。取2μg的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃，5 s，合成cDNA。PCR引物序列如表1，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃，15 s，60℃退火延伸45 s采集信號(hào)，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)組分別做3次定量檢測(cè)，采用公式Q＝2-ΔΔCt，β-actin為內(nèi)參，計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)，見表1。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s的形式表示，運(yùn)用單因素方差對(duì)各組間對(duì)比，依照方差齊性進(jìn)行LSD法及Games-Howell法選擇，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制率的影響與空白組對(duì)比，模型組腫瘤的瘤體質(zhì)量明顯增大（P＜0.05），模型復(fù)制成功；與模型組比較，白花蛇舌草多糖各劑量組和順鉑組均可明顯降低瘤體質(zhì)量（P＜0.05）。見表2。

表1 引物序列表

表2 對(duì)Lew is肺癌小鼠腫瘤抑制率的影響（±s，n＝10）

表2 對(duì)Lew is肺癌小鼠腫瘤抑制率的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與空白組比較，#P＜0.05

/%組別劑量/mg·kg-1腫瘤質(zhì)量（m/g）抑制率空白---模型-2.71±0.32#-順鉑6 0.99±0.16*79.26白花蛇舌草多糖高劑量組200 1.22±0.22*68.66白花蛇舌草多糖中劑量組100 1.47±0.26*57.14白花蛇舌草多糖低劑量組50 1.92±0.34*36.40

3.2 對(duì)Lewis肺癌小鼠血清IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ水平的影響與空白組比較，模型組動(dòng)物血清中IL-2、TNF-α、TFN-γ水平明顯降低，IL-10水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，白花蛇舌草多糖各劑量組和順鉑組均可明顯升高模型動(dòng)物血清中IL-2、TNF-α、TFN-γ水平，降低IL-10水平（P＜0.05）。見表3。

表3 對(duì)Lew is肺癌小鼠血清IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ含量的影響（±s，n＝10）

表3 對(duì)Lew is肺癌小鼠血清IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ含量的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與空白組比較，#P＜0.05

組別劑量/mg·kg-1 IL-2（ρ/ng·L-1） IL-10（ρ/ng·L-1） TNF-α（ρ/ng·L-1） TFN-γ（ρ/ng·L-1）空白-3.69±0.31*3.55±0.46*150.27±19.94*19.14±3.05*模型-1.13±0.16#12.13±1.52#62.39±11.28#8.24±1.26#順鉑6 2.62±0.40*5.74±0.91*123.94±13.00*15.71±2.49*白花蛇舌草多糖高劑量組200 2.31±0.34*6.37±1.16*104.49±15.12*17.54±2.80*白花蛇舌草多糖中劑量組100 1.99±0.23*8.18±148*89.85±10.04*11.65±1.46*白花蛇舌草多糖低劑量組50 1.70±0.18*9.22±1.64*83.57±10.69*10.77±1.63*

3.3 對(duì)Lew is肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2水平的影響與空白組比較，模型組動(dòng)物血清中VEGF、HIF-1α、MMP-2水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，白花蛇舌草多糖各劑量組和順鉑組均可明顯降低模型動(dòng)物血清中VEGF、HIF-1α、MMP-2水平（P＜0.05）。見表4。

表4 對(duì)Lew is肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2含量的影響（±s，n＝10）

表4 對(duì)Lew is肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2含量的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與空白組比較，#P＜0.05

組別劑量/mg·kg-1 VEGF（ρ/mg·L-1）HIF-1α（ρ/mg·L-1）MMP-2（ρ/ng·L-1）空白-224.09±36.28*45.29±6.28*144.42±22.36*模型-629.7±91.00#169.53±20.95#345.71±24.58#順鉑6 305.59±59.28*75.55±15.5*196.09±26.05*白花蛇舌草多糖高劑量組200 394.03±51.62*84.62±15.41*217.57±23.31*白花蛇舌草多糖中劑量組100 462.49±72.04*102.05±13.04*244.75±28.53*白花蛇舌草多糖低劑量組50 530.27±46.74*128.34±17.23*262.02±24.20*

3.4 對(duì)Lew is肺癌小鼠瘤組織中VEGF m RNA、HIF-1α、Bcl-2 m RNA、Bax m RNA表達(dá)影響

模型組動(dòng)物腫瘤組織中VEGF mRNA、HIF-1α、Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯升高，Bax mRNA及Bcl-2/Bax表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，白花蛇舌草多糖各劑量組和順鉑組均可明顯降低模型組動(dòng)物腫瘤組織中VEGF mRNA、HIF-1α、Bcl-2 mRNA表達(dá)，升高Bax mRNA及Bcl-2/Bax表達(dá)（P＜0.05）。見表5。

表5 對(duì)Lew is肺癌小鼠瘤組織中VEGF m RNA、H IF-1α、Bcl-2 m RNA、Bax mRNA表達(dá)影響（±s，n＝10）

表5 對(duì)Lew is肺癌小鼠瘤組織中VEGF m RNA、H IF-1α、Bcl-2 m RNA、Bax mRNA表達(dá)影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與空白組比較，#P＜0.05

組別劑量/mg·kg-1 VEGF mRNA HIF-1αBcl-2 mRNA Bax mRNA Bcl-2/Bax模型-0.93±0.10 0.96±0.07 1.06±0.17 1.03±0.12 1.03±0.13順鉑6 0.39±0.06#0.67±0.05#0.72±0.12#3.39±0.59#0.21±0.01#白花蛇舌草多糖高劑量組200 0.31±0.04*0.50±0.05*0.76±0.14*3.45±0.37*0.22±0.01*白花蛇舌草多糖中劑量組100 0.63±0.05*0.58±0.05*0.85±0.07*2.37±0.55*0.36±0.03*白花蛇舌草多糖低劑量組50 0.75±0.07*0.71±0.06*0.98±0.05*1.49±0.27*0.65±0.04*

4 討論

隨著工業(yè)化和城市化發(fā)展，肺癌嚴(yán)重威脅著人類健康和生命［15］。目前已成為當(dāng)今世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及基因表達(dá)的異常、新生血管的形成，信號(hào)傳導(dǎo)異常等多環(huán)節(jié)的變化［16-17］。而現(xiàn)今癌癥患者的治療主要以放化療為主，眾多患者難以承受其產(chǎn)生的不良反應(yīng)，機(jī)體免疫功能逐漸降低，身體逐漸垮掉［18-19］。本研究血液指標(biāo)選取IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ等免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

Bcl-2和Bax作為激活線粒體通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一對(duì)重要信號(hào)分子［20］，在外界因素誘導(dǎo)下Bax激活/Bcl-2失活促進(jìn)線粒體膜電位降低，進(jìn)而線粒體內(nèi)外膜交換孔開放，促進(jìn)細(xì)胞色素C等小分子物質(zhì)釋放到細(xì)胞漿，通過活化Caspase-3激活核酸內(nèi)切酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［21-22］。本次研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草多糖各劑量組可明顯降低模型組瘤組織中Bcl-2含量表達(dá)，升高Bax含量表達(dá)，升高Bcl-2/Bax的水平，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。HIF-1α是組織內(nèi)缺氧的標(biāo)記物之一［23］，其在多種腫瘤中存在高表達(dá)，并可誘導(dǎo)多種與細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境有關(guān)的基因表達(dá)，是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧的核轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、永生化、腫瘤血管生成等方面起重要作用。腫瘤血管生成是腫瘤生長及轉(zhuǎn)移最為重要的因素［24］。VEGF是重要的血管生成促進(jìn)因子，又稱血管滲透性因子，可促進(jìn)血管形成，增加血管通透性，刺激單核細(xì)胞及成骨細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)蛋白水解酶、組織因子、基質(zhì)膠原酶等在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，激活第Ⅷ因子從內(nèi)皮細(xì)胞釋放，改變細(xì)胞外基質(zhì)，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和浸潤，利于血管生成［25-26］。研究可知，白花蛇舌草多糖各劑量組可顯著降低模型動(dòng)物瘤組織中VEGF、HIF-α含量表達(dá)，從而抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

本次研究通過建立Lewis肺癌小鼠模型，經(jīng)藥物干預(yù)后可知，白花蛇舌草多糖各劑量組均可不同程度升高模型動(dòng)物血清中IL-2、TNF-α、TFN-γ水平，降低IL-10、VEGF、HIF-1α、MMP-2水平，同時(shí)可降低模型動(dòng)物腫瘤組織中VEGF mRNA、HIF-1αmRNA、Bcl-2 mRNA水平表達(dá)，升高Bax mRNA水平表達(dá)，抑制腫瘤瘤體的增長。提示白花蛇舌草多糖治療肺癌模型的主要機(jī)制可能與增加模型動(dòng)物免疫能力及下調(diào)瘤體組織中VEGF mRNA、HIF-1α、Bcl-2 mRNA含量表達(dá)，升高Bax mRNA表達(dá)，從而達(dá)到干預(yù)腫瘤組織生長轉(zhuǎn)移的作用。