基于TGF-β/smad信號(hào)通路探討七方胃痛顆粒對(duì)人胃腺癌AGS細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響*

袁鐵超，陳國(guó)忠，彭振西，易志忠，歐智海

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023

胃癌是全世界最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，缺乏有效的治療措施，導(dǎo)致患者治療效果不佳，死亡率高［1］。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移歷經(jīng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、定向侵襲、侵入血液循環(huán)等過(guò)程［2］。其中EMT是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)型細(xì)胞的生物過(guò)程。該過(guò)程中原屬上皮型細(xì)胞經(jīng)過(guò)形態(tài)和骨架結(jié)構(gòu)的改變而逐漸舍去細(xì)胞極性及胞間連接，獲得間質(zhì)型細(xì)胞的特性，且獲得侵襲和遷移能力［3］。而腫瘤患者致死率高的主要原因則是癌細(xì)胞的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移［4］，因此，阻止或抑制EMT的產(chǎn)生，可以克制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，對(duì)患者的預(yù)后及治療有著積極作用。七方胃痛顆粒的功效以益氣健脾為主，消積導(dǎo)滯、清肝降逆、活血化瘀為輔。前期研究發(fā)現(xiàn)，七方胃痛顆?？梢砸种迫宋赴┘?xì)胞增殖并促其凋亡［5-7］，但其能否影響人胃腺癌AGS細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有待進(jìn)一步證實(shí)。因此，本研究就七方胃痛顆粒對(duì)人胃腺癌AGS-EMT細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察干預(yù)后對(duì)胃癌細(xì)胞ZEB2、E-cad及Vimentin的影響，以闡明其對(duì)人胃腺癌AGS細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用及機(jī)制，為七方胃痛顆粒在臨床上推廣使用提供有力的依據(jù)。

1 材料

1.1 人胃腺癌AGS細(xì)胞與動(dòng)物人胃腺癌AGS細(xì)胞系購(gòu)于上海慧穎生物科技有限公司，貼壁生長(zhǎng)，置于37℃和5%CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雄性SPF級(jí)健康Wistar大鼠40只，體質(zhì)量100～150 g，購(gòu)于湖南省長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SCXK（湘）2014-0011。在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心（SYXK桂2019-0001）飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)涉及動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)準(zhǔn)則，并且嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3 R原則給予人道主義的關(guān)懷照顧，且通過(guò)廣西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查，倫理審批號(hào):DW20190920-34。

1.2 藥品和試劑七方胃痛顆粒為江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的免煎中藥顆粒，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，其組成為生黃芪30 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g，炙甘草9 g，紅參10 g，白芍30 g，炒雞內(nèi)金9 g，枳實(shí)10 g，木香6 g，黃連6 g，吳茱萸3 g，丹參6 g，中藥顆粒被混合攪勻并按每袋8 g的規(guī)格滅菌包裝。胎牛血清（上海依科賽生物制品有限公司，貨號(hào):FCS500）；檸檬酸鹽緩沖液（10 mM pH 3.0）（深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào):NP-1510-03）；TGF-β1［美國(guó)PeproTech（派普泰克）公司中國(guó)代表處，貨號(hào):100-21］；TGF-β/Smad抑制劑LY2109761［Selleck（中國(guó)）公司，貨號(hào):S2704］；凍存液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào):D8371）；胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào):T1300）；青鏈霉素混合液（100X）（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào):P1400）；DMEM高糖培養(yǎng)基［賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司，貨號(hào):11965092］；PBS緩沖液（凱基生物，貨號(hào):KGB5001）；Trizon Reagent（CWBIO康為世紀(jì)，貨號(hào):CW0580S）；Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒（CWBIO 康為世紀(jì)，貨號(hào):CW0581M）；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（CWBIO康為世紀(jì)，貨號(hào):CW2569M）；UltraSYBR Mixture（CWBIO康為世紀(jì)，貨號(hào):CW0957M）；RIPA裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào):C1053）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（康為世紀(jì)，貨號(hào):CW0014S）；Marker（Thermo，貨號(hào):26617）；PVDF膜（Millipore，貨號(hào):IPVH00010）；封閉專用脫脂奶粉（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào):P1622）。引物（蘇州金唯智生物科技有限公司）。

1.3 儀器熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；371高溫滅菌CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）。

2 方法

2.1 人胃腺癌AGS細(xì)胞EMT模型建立細(xì)胞生長(zhǎng)密度高達(dá)80%時(shí)，須分植至新的培養(yǎng)皿或瓶中，一般稀釋比例為1∶3。當(dāng)細(xì)胞傳代達(dá)一定數(shù)量后，用10μg·L-1的TGF-β1處理AGS細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)3代，建立EMT模型［8］。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞分為3組，空白組（無(wú)處理的EMT模型）、七方胃痛顆粒（含藥血清+EMT模型）組、LY2109761（TGF-β1/Smad抑制劑+EMT模型）組。

2.3 藥物制備TGF-β/Smad抑制劑LY2109761，體外實(shí)驗(yàn)給藥時(shí)濃度稀釋為10μmol·L-1。TGFβ1，體外實(shí)驗(yàn)給藥時(shí)濃度稀釋為10μg·L-1。實(shí)驗(yàn)前稱取七方胃痛顆粒所需的藥物。

2.4 藥物血清制備將大鼠隨機(jī)分為藥物組、空白組，每組20只。分別給予七方胃痛顆粒（給藥劑量＝臨床常用劑量×動(dòng)物等劑量系數(shù)×培養(yǎng)液內(nèi)稀釋濃度［9］）和生理鹽水灌胃。先將藥物用生理鹽水稀釋，配置成2 g·mL-1的藥物混懸溶液給大鼠灌胃，方案按照1 mL·100 g-1給藥，每日給藥2次，連續(xù)7天。于末次給藥后1 h腹主動(dòng)脈采血，血樣置于10 mL離心管，靜置2 h以上，離心半徑8 cm，3 000 r·min-1離心15 min，無(wú)菌分離血清。將血清置于56℃水浴30 min滅活，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，置于-20℃下保存?zhèn)溆谩？瞻捉M大鼠除給予生理鹽水代替七方胃痛顆粒灌胃之外，余同七方胃痛顆粒含藥血清制備方法。實(shí)驗(yàn)前將EMT模型AGS細(xì)胞傳代培養(yǎng)，將其接種于含DMEM培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)，約12 h后，待細(xì)胞貼壁，換上凍存融化的含藥血清作用細(xì)胞24 h、48 h、72 h后觀察其生長(zhǎng)情況。

2.5 RT-PCR法檢測(cè)ZEB2、E-cad及vimentin的表達(dá)提取細(xì)胞的總RNA，遵守操作說(shuō)明對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參［10］，采取實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)，再進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min進(jìn)入循環(huán)，95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃1 min，共33個(gè)循環(huán)后，最終測(cè)定不同樣本的Ct值，以公式2-△△Ct計(jì)算反映各樣品目的基因相對(duì)表達(dá)量的差異。見表1。

表1 引物信息

2.6 W estern blot法檢測(cè)ZEB2、E-cad及Vimentin的表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按1∶4比例加入蛋白中煮沸5 min，取50μg蛋白在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳，100 mA恒流電轉(zhuǎn)70 min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶非特異性封閉1 h，加入一抗抗體4℃過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h，ECL顯影5～10 min。圖像結(jié)果用Quanty-one分析軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白/內(nèi)參的灰度比值表示相對(duì)目的蛋白水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 七方胃痛顆粒對(duì)EMT模型中ZEB2 m RNA、Vimentin m RNA表達(dá)的影響與空白組比較，七方胃痛顆粒組和LY2109761組作用24 h、48 h、72 h后均能明顯下調(diào)ZEB2 mRNA、Vimentin mRNA表達(dá)（P＜0.05）；與七方胃痛顆粒組相比，LY2109761組ZEB2 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而Vimentin mRNA下調(diào)在相同時(shí)間下相近（P＞0.05）。該結(jié)果提示七方胃痛顆粒中藥血清具有抑制EMT模型AGS-EMT細(xì)胞ZEB2 mRNA、Vimentin mRNA的表達(dá)，且其抑制ZEB2作用不如TGF-β1的抑制劑LY2109761。見圖1、圖2。

3.2 七方胃痛顆粒對(duì)EMT模型中E-cadmRNA表達(dá)的影響與空白組比較，七方胃痛顆粒組和LY2109761組作用24 h、48 h、72 h后均能明顯上調(diào)E-cad mRNA表達(dá)（P＜0.05）；隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)有差異，在48 h、72 h時(shí)間段均出現(xiàn)促進(jìn)。與七方胃痛顆粒組相比，LY2109761組在24 h、48 h、72 h均能明顯上調(diào)E-cad mRNA表達(dá)（P＜0.05）。該結(jié)果提示七方胃痛顆粒中藥血清具有促進(jìn)AGSEMT細(xì)胞E-cad mRNA的表達(dá)，但其促進(jìn)作用不如TGF-β1抑制劑LY2109761。見圖3。

圖1 七方胃痛顆粒對(duì)EMT模型中ZEB2 mRNA表達(dá)的影響

圖2 七方胃痛顆粒對(duì)EM T模型中Vimentin m RNA表達(dá)的影響

圖3 七方胃痛顆粒對(duì)EMT模型中E-cad m RNA表達(dá)的影響

3.3 七方胃痛顆粒對(duì)EMT模型中ZEB2、vimentin、E-cad的蛋白表達(dá)的影響與空白組相比，七方胃痛顆粒和LY2109761組分別干預(yù)AGS-EMT細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，ZEB2、Vimentin的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），E-cad的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與七方胃痛顆粒組相比，LY2109761組在24 h、48 h、72 h均能明顯下調(diào)ZEB2表達(dá)（P＜0.05）。提示七方胃痛顆粒與LY2109761作用相近，且隨之干預(yù)時(shí)間增加對(duì)于Ecad作用更明顯，進(jìn)一步確認(rèn)了七方胃痛顆粒在調(diào)控EMT方面的作用。見圖4。

圖4 七方胃痛顆粒對(duì)EMT模型中ZEB2、vimentin、E-cad的蛋白表達(dá)的影響

4 討論

胃癌在我國(guó)引起的死亡約占全球的一半，對(duì)人民的身體健康造成極大危害［11］。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究表明其發(fā)生涉及多信號(hào)、多基因的復(fù)雜過(guò)程［12］。胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是影響胃癌療效的主要原因［13］，而在腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲過(guò)程中，EMT這一過(guò)程則起著不容忽視的關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，EMT的形成與TGF-β/smad信號(hào)通路的ZEB2、E-cad、Vimentin等因子關(guān)系密切，它們與胃癌的侵襲深度、淋巴轉(zhuǎn)移及分期密切相關(guān)。TGFβ1作為TGF-β主要存在形式在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用［14］。TGF-β可抑制E-cad的表達(dá)并促發(fā)EMT［15］，也可促進(jìn)腫瘤EMT發(fā)生，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［16］。研究證實(shí)TGF-β1可誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并增強(qiáng)其侵襲和遷移能力［17］。而TGF-β/smad為TGF-β促進(jìn)腫瘤EMT發(fā)生的重要信號(hào)通路，TGF-β/smad信號(hào)通路可誘導(dǎo)snail、slug、ZEB1、ZEB2、Twist等與EMT密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而抑制E-cad表達(dá)，促進(jìn)EMT發(fā)生［18］。E-cad是EMT過(guò)程中的重要分子，E-cad在EMT過(guò)程中表達(dá)降低，使細(xì)胞間黏附破壞，增加細(xì)胞能動(dòng)性和推進(jìn)癌癥向晚期進(jìn)展。在腫瘤中，E-cad的低表達(dá)可以活化誘導(dǎo)致癌因子，激活TGF-β、EGF、NF-κB、Wnt、HIF-1α等傳導(dǎo)途徑，從而促進(jìn)EMT的形成［19］。ZEB2作為Snail超家族的重要成員可直接或間接下調(diào)E-cad表達(dá)并誘導(dǎo)EMT，ZEB2直接結(jié)合并抑制近端CDH1啟動(dòng)子處的E-cad并重塑細(xì)胞間粘附［20］。有報(bào)告顯示，ZEB2除了能抑制其他上皮標(biāo)志物，激活間充質(zhì)基因［21］，還能重組上皮極性分子，阻礙基底膜形成以促進(jìn)侵入性［22-24］。有研究顯示ZEB與臨床預(yù)后有關(guān)，靶向調(diào)節(jié)胃癌組織中ZEB2的表達(dá)可以增強(qiáng)SGC7901/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，提示ZEB2高表達(dá)與人類癌癥的較差預(yù)后密切相關(guān)［25］。Vimentin在胃癌中的表達(dá)已被作為胃癌預(yù)后價(jià)值評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)多年，其表達(dá)量的上調(diào)，可使細(xì)胞失去細(xì)胞極性，細(xì)胞間連接被破壞，細(xì)胞粘附能力下降，運(yùn)動(dòng)能力增加，從而使細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)［26］。最新的涉及1 598例樣本的薈萃分析顯示，Vimentin陽(yáng)性表達(dá)與胃癌患者較差的整體存活率顯著相關(guān)，且亞組分析顯示Vimentin對(duì)中國(guó)患者的整體存活率有不利影響。

LY2109761是一種臨床前研究階段的新型ALK5/TGFβRII雙靶點(diǎn)抑制劑［27］，雖然其在細(xì)胞研究階段能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的L3.6pl/GLT細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞中Smad2蛋白磷酸化水平。但在體外研究中，LY2109761目前只有在與其他藥物聯(lián)用或者聯(lián)合放、化療時(shí)才能減小腫瘤體積、降低腫瘤轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤微血管形成，增強(qiáng)放、化療效果，且不良反應(yīng)明顯。

七方胃痛顆粒是廣西中醫(yī)藥大學(xué)羅偉生教授在中醫(yī)經(jīng)典中溯本追源以探尋胃癌之病機(jī)后，結(jié)合長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐，取四君子湯、丹參飲、左金丸、逍遙散、枳實(shí)芍藥散、枳術(shù)丸、木香檳榔丸等7個(gè)不同功效的經(jīng)典方劑加減而成，其健脾益氣針對(duì)胃癌之根本病機(jī)，扶助脾胃，助其抗邪。用活血化瘀之法消散積瘤瘀滯，促其氣血運(yùn)行；清熱解毒之法可清散郁熱，攻伐毒邪；理氣化痰和中之法則可助脾胃之升降、運(yùn)化，促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)之功效。

近年來(lái)，在防治胃癌及癌前病變的研究上，傳統(tǒng)中醫(yī)中藥發(fā)揮其特色，已經(jīng)在臨床研究上取得一定的成果以及較好的療效。中醫(yī)對(duì)于腫瘤的認(rèn)識(shí)在古籍里早有描述，大多可歸為“癥瘕”“積聚”之類，同屬于“邪氣”這一范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》云:“正氣存內(nèi)，邪不可干……邪之所湊，其氣必虛。”《醫(yī)宗必讀·積聚》曰:“積之成者，正氣不足，而后邪氣踞之。”這提示腫瘤的形成與人體的正氣密切相關(guān)，人體正氣不足，無(wú)力御邪，使得邪氣獨(dú)居，以致“寒”“濕”“痰”“瘀”等病理產(chǎn)物形成，阻礙氣血運(yùn)行，以致氣滯血瘀、痰濕搏結(jié)、寒凝血瘀，聚而成積，其積瘤之形成，阻礙氣機(jī)，郁而化熱?！皦鸦鹕狻?，郁熱進(jìn)一步損耗元?dú)?，耗傷津血，氣血津液不能濡養(yǎng)脾胃，從而使脾胃虛損，運(yùn)化失司。胃為“水谷之?！?，氣血生化之源，胃氣受損，后天之本無(wú)以生化正氣，正氣虧虛不能抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，從而形成惡性循環(huán)。因此，中醫(yī)治療腫瘤，首當(dāng)扶助正氣，恢復(fù)人體抗邪的自衛(wèi)能力。人之正氣充足，則五臟功能協(xié)調(diào)，氣機(jī)調(diào)暢不相失宜，“寒濕痰瘀”等病理產(chǎn)物自然祛除，積瘤自消矣。唯有正氣充足，方能抗邪，故而“正虛邪積”為腫瘤之病機(jī)，而胃癌的病因主要為“脾胃虛弱”，后天之本生化失司，故“健脾益氣”之法即為胃癌之治則。

本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，七方胃痛顆?？勺钄嗦晕s性胃炎癌前病變的進(jìn)一步發(fā)展，對(duì)防治慢性萎縮性胃炎癌前病變有明顯效果［28-29］，并且可以抑制人胃腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究顯示含七方胃痛顆粒中藥血清可以抑制AGS細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上調(diào)E-cad表達(dá)，下調(diào)ZEB2及Vimentin表達(dá)，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，中藥血清作用于AGS-EMT細(xì)胞的效果與TGF-β/Smad抑制劑作用相似。提示七方胃痛顆粒與TGF-β/smad信號(hào)通路抑制劑作用一致，能抑制TGF-β/smad信號(hào)通路，下調(diào)ZEB2、Vimentin，上調(diào)E-cad，增加細(xì)胞黏附，減少細(xì)胞破壞，減少細(xì)胞遷移和侵襲，且作用效果與時(shí)間呈正相關(guān)性。綜上所述，七方胃痛顆粒對(duì)人胃腺癌AGS細(xì)胞具有抑制作用，其機(jī)制可能為抑制TGF-β/smad信號(hào)通路，從而抑制胃黏膜上皮的EMT。這體現(xiàn)了七方胃痛顆粒在防治胃癌方面的重大協(xié)同作用。