醬油特征性風味物質研究進展

趙鉅陽，袁惠萍

（哈爾濱商業(yè)大學旅游烹飪學院，哈爾濱 150030）

醬油是一種傳統(tǒng)的調味品，起源于我國公元前2 世紀，由煮過的大豆、烤過的谷物、鹽水和米曲霉或大豆曲霉經發(fā)酵制成的液體。由于醬油色澤誘人，滋味鮮美，現(xiàn)廣泛應用于東亞和東南亞的菜肴中，并逐漸在西方國家中流行[1?2]。醬油主要由鮮、甜、酸、咸、苦等綜合而成[3?5]，其中，咸味、甜味、苦味分別主要由醬油的鹽分、糖分、糖色所決定，有些在生產中容易控制。然而，醬油的鮮度、酸味和香味不是由單一成分決定的，而是由酯類、醇類、羰基化合物、縮醛類及酚類等多種成分共同作用的結果[6?7]。醬油中的營養(yǎng)成分十分豐富，包括氨基酸、可溶性蛋白質、糖、酸和一些微量元素，可以有效維持人體的生理平衡。醬油是烹飪的首選調料，味道醇厚，營養(yǎng)價值高。因此，本文對醬油的相關香氣成分及相應的檢測技術進行了研究，希望能為今后醬油行業(yè)的發(fā)展提供一些理論依據。

1 醬油風味概述

根據醬油生產的不同方法，醬油可以分為配制醬油、釀造醬油、再制醬油。其中的釀造醬油根據其加工工藝的不同分為低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油、高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油[8]。利用低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝釀造醬油工藝中生產出來的醬油存在較重的焦糊味，色澤較為暗淡，而且在口味方面比較單一。高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝的醬油顏色呈現(xiàn)出紅褐色，且其散發(fā)出濃厚的酯香和醬香，突出的鮮味，醇厚的口感，甜咸適口。根據醬油滋味、色澤的不同分為老抽醬油、生抽醬油、花色醬油。其中使用最廣泛的是生抽和老抽醬油。生抽是一種低粘度、不透明、淡棕色的醬油，其制法通常是將蒸小麥、大豆與曲霉一起培養(yǎng)，并將三者混合物于鹽水中發(fā)酵。生抽主要用于調味，顏色略淺，口味稍咸且風味獨特。老抽則是由生抽制成的顏色較深且稍厚的醬油，是經長時間陳釀而成的。它通常添加焦糖，使得其相比于比生抽味道更甜、咸且外觀獨特，因而老抽口感則更為豐富，外觀更飽滿，其風味也因此多在烹飪后釋放，因此其主要用于烹飪菜肴的色澤和風味的增補。紅燒醬油和蘑菇醬油是老抽的兩種延伸，多用特定的菜肴的烹飪，紅燒醬油和蘑菇醬油是通過添加額外的香料、添加劑和調味料制成的[9?10]，它們的發(fā)酵過程基本相同，但口味不同，這主要是由于各自添加的添加劑種類和含量不同而造成[11]。

2 醬油中風味形成機理

2.1 醬油風味來源

醬油中風味物質非常復雜，不是單一的物質，而是幾十種甚至上百種復雜化合物的混合物[12]。醬油中已鑒定出近300 種香氣化合物，這些香氣化合物包括醇類、醛類、酸類、碳氫化合物、酯類、呋喃、呋喃酮、含氮化合物、酚類、吡喃酮、吡嗪類、吡啶類、含硫化合物和噻唑類[13]。其中，醇類、酸類、酯類和醛類被報道為醬油中發(fā)現(xiàn)的最豐富的香氣化合物[14]。醬油色素形成的主要途徑是美拉德反應。原料中的淀粉經過酶水解生成羥基和氨基，生成黑色素物質。美拉德反應是一種非酶促褐變反應，在改善顏色和味道方面起著重要作用，但它也有負面的健康影響[15]。褐變反應中會產生醛、酮等還原性中間體，達到一定含量會影響健康。美拉德反應是由羰基和氨基之間的縮合反應產生希夫堿，然后進行Amadori重排得到Amadori 產物，然后通過兩條主要途徑降解，產生大量的美拉德反應產物。α-DC 是由在美拉德反應過程中形成的糖或其他的美拉德反應產物分解而產生的，但也被認為是由脂質氧化產生的。作為重要的中間體，α-DC 促進了美拉德反應引起的香氣和顏色的變化，這些化合物也是最終類黑素（高度聚合的棕色顏料）形成的前體[16?17]。醬油中的雜環(huán)化合物，包括呋喃和吡嗪，主要是通過美拉德反應形成的[18]。醬油中的呋喃來自葡萄糖熱解和美拉德反應，一般來說，呋喃是在美拉德反應中分解而生成的[19]。吡嗪是一類重要的含氮風味化合物，通常由氨基酸與羰基通過美拉德反應生成[20]。大多數吡嗪是影響烘烤食品和烘烤食品風味的重要因素。

醇類主要存在于發(fā)酵初期，酯類主要存在于發(fā)酵中期，烷烴和雜環(huán)化合物主要出現(xiàn)在發(fā)酵末期[21]。醬油的香氣的形成時期是發(fā)酵的后期。雖然形成的醬油香氣含量甚微，但它對醬油的整體風味有很大的貢獻。例如，在酵母發(fā)酵的過程中會產生的酒香氣、有機酸和醇的酯化作用產生的特殊芳香酯，這些都對醬油的風味起到了積極的作用。醬油的酸味主要來源于琥珀酸、乳酸、乙酸等有機酸。淀粉水解糖賦予了醬油的甜味，醬油的苦味大部分來自亮氨酸、蛋氨酸和精氨酸等氨基酸，食鹽中的氯化鈉成分賦予了醬油的咸味[22]。醬油的鮮味主要源于發(fā)酵過程中由大豆蛋白和麥麩蛋白水解產生的酸性氨基酸（主要是天冬氨酸和谷氨酸），這些氨基酸具有獨特的鮮味。此外造成醬油獨特風味的因素還來自于一些低分子量化合物，如酸性肽和味精谷氨酸鹽（MSC），它們會賦予醬油咸味和鮮味[23]。

2.2 醬油風味形成途徑

2.2.1 通過蛋白質降解作用產生的風味物質 市售醬油釀造的原料主要是豆粕或者麥麩，醬油在高溫下煮沸后，原料中的蛋白質會發(fā)生變化，導致蛋白質變性。蛋白質由于微生物分泌的蛋白酶的作用會進一步降解產生谷氨酸、丙氨酸等，這些降解物對醬油的風味產生重要影響，其中谷氨酸對風味貢獻最大。水解酶的作用可以使大豆蛋白和小麥粉分解，但由于其復雜而穩(wěn)定的結構，一些未表征的蛋白一直保留到發(fā)酵終點。在醬油發(fā)酵過程中，二肽酶、中性蛋白酶，亮氨酸氨基肽酶和β-木聚糖酶等水解酶的表達水平不是恒定的，并且逐漸降低，某些風味與水解氨基酸和還原糖有關[24]。根據黃毅等[25]研究表明4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）-呋喃酮（HEMF）是促使醬油呈現(xiàn)其獨特香氣的主要風味物質[26]，不僅能夠帶來香氣，還可為醬油風味提供豐富的濃厚感[27]。此外，醬油中常見的風味化合物還有4-羥乙基-5-甲基-3（2H）-呋喃酮（4-HEMF），其與HEMF 可能還會導致煙熏味[28]?？傊@些蛋白質降解產物不僅是醬油中主要的滋味成分，同時也是揮發(fā)物質的前體物質，因而進一步影響醬油的揮發(fā)性氣味。吡嗪和呋喃化合物是醬油中非常重要的化合物。吡嗪化合物來自于Strecker 降解的α-氨基酸和還原酮，呋喃化合物來自葡萄糖的降解[29]。

2.2.2 通過淀粉的糖化作用產生的風味物質 醬油制曲過程的主要微生物—米曲霉能夠分泌多種酶類分解醬油原料物質，其中最重要的是淀粉液化酶和糖化酶。米曲霉在發(fā)酵過程中起重要作用，在酶的作用下，原料中的淀粉類物質會被分解為小分子的葡萄糖，進而使醬油具有一定的甜味，同時這些糖類物質也為制曲和發(fā)酵中的微生物提供了碳源，構成了微生物的物質基礎。此外，碳水化合物是美拉德反應中所必需的化合物之一，為醬油風味、色澤、體態(tài)的形成打下了基礎[30]，發(fā)酵中碳水化合物通過美拉德反應會產生一系列含N，S 的棕褐色揮發(fā)性雜環(huán)化合物，如類黑精等[31]。此外，戊糖還將通過加熱過程中的美拉德反應產生醬油中兩種最重要的芳香化合物—4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃（4-HDMF）和4-HEMF[32]。另一方面，構成醬油紅棕色或紅棕色的主要顏色物質也主要來自醬油發(fā)酵過程中醬油醪或醬油醪中蛋白質和淀粉原料（或其分解產物氨基酸和糖）的美拉德反應。2-乙?；秽徽J為具有類似焦糖的香氣，通常在美拉德反應的糖降解過程中產生[33]。

2.2.3 通過脂肪的水解作用產生的風味物質 黃豆作為醬油生產的原料富含了大量的油脂，在儲藏期內油脂分解對醬油的風味有著重要影響。油脂降解產生的脂肪酸與酵母發(fā)酵物乙醇相互作用會生成小分子脂類，脂類具有芳香香氣[34]。酯類是醬油中另一種重要的香氣化合物，因為它具有較高的揮發(fā)性和對人類嗅覺受體的敏感性。大多數酯是通過發(fā)酵過程中脂肪酸和醇類的酯化作用形成的，并且受基質中前體脂肪酸類和醇類的含量的影響，可以通過減少胺類和脂肪酸所帶來的酸味和苦味來增加風味[35]。根據Fengy 等[36]研究表明，在醬油曲的發(fā)酵過程中會產生游離脂肪酸等物質，這些物質是醬油風味和香氣的典型前體，在醬油獨特風味的形成的過程中發(fā)揮了很大的作用?？梢月劦揭恍┲匾姆枷慊衔?，包括乙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物等。Gao 等[37]研究表明與脫脂大豆相比，用全大豆制成的醬油粗脂肪含量高，含有更多的脂肪酸酯，當使用全大豆時，親脂化合物包括芳香化合物更傾向于駐留在油分中，在巴氏殺菌之前進一步醬醪糖化被去除，這導致最終產品的味道損失，醬油口味也更溫和。豆類等發(fā)酵過程中產生的高級脂肪酸酯，如油酸乙酯、亞油酸乙酯、十六酸乙酯等物質，具有明顯的水果風味，釀造醬油的香氣愈加濃郁諧和，但在發(fā)酵過程中，由于脂肪酸氧化的產生，也容易產生不良氣味，導致醬油質量下降。可見脂肪酸本身對醬油的香氣并沒有太大的作用，但是經過長達半年的發(fā)酵，會被氧化成一系列的脂肪酸鏈等化合物，再經過進一步的化學反應，會生成醛類、酸類等具有香氣的物質。制作醬油的大豆原材料富含油脂，在發(fā)酵過程中極易因生產條件控制不當引發(fā)脂肪酸敗，也易促使不良氣味的產生造成醬油品質下降，因此在醬油生產過程中要控制好生產條件[38]。

2.2.4 通過菌種微生物的代謝作用產生的風味物質 醬油發(fā)酵是決定醬油風味和香氣品質的重要環(huán)節(jié)。在這一階段，大量的微生物在醬油中產生香氣化合物，這些化合物構成了醬油的整體香氣。由于單一的菌種接種發(fā)酵不容易產生色澤飽滿，口感濃郁的醬油，因此多采用混合菌種發(fā)酵，目前在醬油釀造過程比較常用的菌種是米曲霉、酵母菌、乳酸菌、嗜鹽桿菌和魯氏桿菌等[39]。其中酵母菌和乳酸菌在醬油發(fā)酵過程中起主要作用，它們能夠將葡萄糖轉化為二氧化碳和乙醇，生成的乙醇可以繼續(xù)被氧化成酸類，部分進一步反應為酯類，這類物質組成醬油香氣的重要部分。Harada 等[40]研究了發(fā)酵過程中酵母和乳酸菌對醬油成分的影響，發(fā)現(xiàn)酵母在發(fā)酵過程中加入后可以產生乙醇。乙醇不僅具有酒的香氣，還能被氧化成醛和酸，并進一步與酸形成酯。乳酸菌的添加也能顯著提高醬油中馬鈴薯風味的甲基化產物。Moromi發(fā)酵被認為是決定醬油風味和香氣質量的重要階段。在此階段，Moromi 發(fā)酵存在的大量微生物會產生香氣，這些香氣有助于醬油的整體風味。在這些微生物中，嗜鹽桿菌和魯氏桿菌占主導地位，對醬油香氣的貢獻研究最多[41]。嗜鹽桿菌和魯氏桿菌分別通過乳酸和酒精發(fā)酵途徑產生各種次生代謝物，包括重要的芳香化合物。嗜鹽桿菌可產生乙酸、甲酸、苯甲醛、乙酸甲酯、2-羥基丙酸乙酯、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊酮等。Harada 等[42]代謝組學研究證明了在鹽味發(fā)酵過程中，嗜鹽鏈球菌與糠醛、糠醇、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮（環(huán)戊烯）和蛋氨酸的增加之間存在相關性，因為這些風味化合物是通過美拉德反應產生的，由嗜鹽丁酸桿菌產生乙酸和乳酸創(chuàng)造一個酸性環(huán)境。此外，醬油里還有一些通過氨基酸脫羥基、氨基而形成丁醇等醇類物質，它們是醬油風味有效增強劑，不但在緩解醬油咸味發(fā)揮重要作用，而且還可以促使醬油的口感變得更加柔和和濃厚[43]。酯類化合物是醬油中最豐富和復雜的成分。大部分酯類是由醇與蛋白質水解產生的有機酸通過酯化酶進行酯化反應生成的，可以使醬油的風味更加醇厚，醬油的咸味可以得到有效緩解。

3 醬油風味物質分離與分析技術

日本是第一個研究醬油香味的國家。有報道稱醬油的香味早在1887 年就被研究過了[44]。1940 年，Kihara 在《日本化學學會雜志》上曾經發(fā)表過一篇和醬油香味相關的文章，醬油中的香氣成分很豐富，Kihara 的研究中指出這些成分包括乙醇、乙酸、乙酸乙酯、乳酸等[45]。在1955 年引入第一臺氣相色譜儀，此儀器在醬油中揮發(fā)性風味成分的鑒定中起著至關重要的作用[46]。截至到目前為止，日本學者在研究醬油味道的道路上從沒有停止過腳步[47]。在我國也是很早就開始啟動了研究醬油風味的項目，在1953年，曾做過測定醬油中揮發(fā)性酸、酯、醛、乙醇等方法的報道[48?49]。到1980 年，用氣相色譜法研究了醬油中的揮發(fā)性風味成分[50]。在2008 年，國內開始普及氣相色譜和氣相色譜-質譜聯(lián)用技術，我國對醬油中揮發(fā)性風味物質的研究有所增加。醬油中的揮發(fā)性化合物通常用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行分析。在進行氣相色譜-質譜分析之前，樣品必須通過從醬油中提取揮發(fā)性化合物來制備，使用的主要技術有溶劑直接萃取、吹掃和捕集、溶劑輔助蒸發(fā)風味成分、固相微萃取、同時蒸餾和萃取、蒸餾和頂空取樣。

醬油的香氣主要是經過多種揮發(fā)性風味物質共同作用出來的，而醬油的滋味主要是通過多種非揮發(fā)性風味物質共同作用呈現(xiàn)出來的[51]。

3.1 醬油揮發(fā)性香氣物質的分離與分析

3.1.1 溶劑直接萃取 溶劑直接提取法是用溶劑提取醬油中的揮發(fā)性成分。因為醬油是液態(tài)的，這種方法也被稱為液-液萃取法，提取醬油中的揮發(fā)性成分。可以用分液漏斗直接提取，也可以用特殊的玻璃儀器連續(xù)提取[52?54]。溶劑直接萃取的優(yōu)點是利用溶劑的不同將揮發(fā)性成分萃取出來，但缺點是對非揮發(fā)性成分并不適用。朱志鑫等[55]利用乙醚溶劑提取醬油揮發(fā)性風味物質，使用GC-MS 分析手段，共鑒定出43 種物質，4-乙基愈創(chuàng)木酚、HEMF，3-甲巰基丙醇及5-甲基-2-糖醛等對醬油香氣貢獻最大。楊成聰[56]等利用電子鼻和GC-MS 技術對老抽和生抽風味品質進行了評價，老抽醬油中芳香類物質的含量顯著高于生抽醬油。

3.1.2 吹掃捕集 吹掃收集法的優(yōu)點是可以分析揮發(fā)性成分，但缺點是收集效率受多種因素影響，存在誤差[57]。近些年這個方法使用的并不多，韓國學者通過測定韓式醬油揮發(fā)性成分在發(fā)酵過程中的變化情況，共鑒定出62 種成分，在發(fā)酵過程中，酸類和醛類含量升高[42]。Zhao 等[58]研究表明通過氣相色譜-質譜法（GC-MS）在傳統(tǒng)中式醬油中總共檢測到35 種重要的氣味活性值大于1 的重要香氣化合物，其中具有芳香環(huán)的芳香化合物共20 種，占了35 種重要香氣化合物很大比例，超過57%。此外，應用了全二維氣相質譜法（GC×GC-TQMS），鑒定了414 種香氣化合物，其中包括85 種帶有芳香環(huán)的香氣化合物。結合主成分分析和GC-O-MS，5-甲基-2-呋喃甲硫醇、3-甲基丁醛苯乙醛、2-苯乙醇、乙酸苯乙酯和苯乙酸乙酯被確認為所有樣品中的典型香氣化合物。

3.1.3 溶劑輔助風味成分蒸發(fā) 溶劑輔助風味蒸發(fā)（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）優(yōu)點在于分離和提取的過程中不需要運用加熱處理，能更真實的反映出樣品中揮發(fā)性成分[59]。目前，雖然該提取揮發(fā)性成分的方法在國際上被公認為最佳，但高真空系統(tǒng)的高成本這一因素，所以在實踐中很少投入使用。日本學者用該方法研究5 種市售醬油中關鍵香氣成分以及在加熱條件下香氣活性物質的變化，結果顯示，其中苯乙酸、異戊酸、麥芽酚、苯乙酸和呋喃酮是5 種市售醬油中的25 種核心氣體成分鑒定結果中含量較高的[60]。

3.1.4 固相微萃取 固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）因其操作簡單、靈敏、快速、自動化、樣品用量少、無溶劑、成本低等優(yōu)點而被廣泛應用[61]。然而，由于當不同的纖維被用于提取時所識別的不同成分，具有定量結果存在差異的缺點。近些年來，利用SPME 提取醬油風味的研究很多。高獻禮等[62]同時利用SDE、SMPE 和直接溶劑萃取法三種方法醬油對揮發(fā)性風味物質進行提取分離，并采用GC-MS 分析手段鑒定，在鑒定出的147 種風味物質中，酯類、酸類、醛類、醇類和雜環(huán)類是主要的揮發(fā)性的風味物質，數量和相對含量最多的揮發(fā)性物質為酯類。鐘小廷等[63]采用電子鼻、GC-MS 和HS-SPME比較了三種釀造醬油風味特征及風味物質組成。結果表明，黑豆醬油風味特征及揮發(fā)性物質組成與黃豆醬油、豆粕醬油均存在較大差異。Gao 等[37]研究表明，采用GC-MS 結合頂空固相微萃?。℉S-SPME），對12 種不同發(fā)酵工藝生產的醬油進行了揮發(fā)性風味物質的鑒定和揮發(fā)性成分的測定，對影響中式醬油風味的41 種關鍵揮發(fā)性成分進行了定性鑒別，并進行了半定量比較，研究表明，醬油樣品的揮發(fā)性風味物質存在較大差異，低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝生產的醬油風味品質中揮發(fā)性有機物含量普遍較少。

3.1.5 同時蒸餾萃取 同時蒸餾萃取法具有集蒸餾與萃取于一體，操作起來方便等的優(yōu)點，然而蒸餾萃取法也有著提取熱不穩(wěn)定，具有揮發(fā)性的物質并不適用的缺點，因而會生成一些樣品中本不存在的成分，影響萃取結果[64]。為了解決這個問題，可在同時蒸餾萃取時進行減壓操作。王軍喜等[65]采用同時蒸餾萃取（SDE）和SPME 對醬油中揮發(fā)性香氣成分進行提取，結合氣質聯(lián)用（GC-MS）儀進行檢測，結果顯示SDE 法檢測出73 種揮發(fā)性物質。

3.1.6 其他方法 除了上述提到的常用方法外，還有一些其他方法，比如蒸餾法和頂空取樣法，這些方法可以從醬油中提取揮發(fā)性物質[66]。蒸餾法早期用于檢測醬油風味物質。蒸餾是一種早期檢測醬油風味物質的方法，它需要蒸餾和提取，并在提取過程中加熱，導致?lián)]發(fā)性成分的變化，因此它現(xiàn)在很少使用。頂空取樣法主要是用來分析低沸點呈香物質，優(yōu)點是可以真實的反映頂空氣的組成，缺點是抽取揮發(fā)性成分少，不便于定性與定量分析。Wang 等[59]采用SPME和氣相色譜/質譜聯(lián)用法（GC/MSD）對添加和不添加反應香精技術的醬油中的揮發(fā)性成分進行了分析，共檢出57 種化合物。Gao 等[44]利用超聲處理技術不僅能顯著提高醬油風味物質的釋放和感官品質，而且能降低醬油中NaCl 的含量，在醬油生產中具有廣闊的應用前景。超聲波處理提高酶活性，特別是酸性蛋白酶的活性，形成更多的表面積和反應位點，超聲波強化醬油風味物質釋放和感官品質。楊曉璇[67]依據代謝組學技術研究方法，利用氣相-離子遷移譜和超高效液相色譜串聯(lián)二級質譜分析不同醬油和食醋中的差異，特級醬油與散裝醬油之間的風味差異不顯著，而在非揮發(fā)性代謝物差異較大。俞慧紅等[68]通過電子鼻和感官評價分析了5 種不同品牌的醬油，結果表明它們之間氣味存在一定的差別。

3.2 醬油非揮發(fā)性香氣物質的分離與分析

氨基酸是醬油風味的主要來源，其非揮發(fā)性風味物質除了氨基酸外，還包括糖類、有機酸和水溶性肽等，醬油甜味的主要來源于葡萄糖和麥芽糖等糖類物質，但并不是所有甜味來源都是糖類物質，有些呈甜味主要是其中的甘氨酸、丙氨酸和色氨酸的作用，同樣，醬油的微量苦味也與纈氨酸、酪氨酸等有關，乳酸和琥珀酸等有機酸賦予了醬油的酸味[69?70]。

目前在醬油非揮發(fā)性風味物質的方面分析與研究的不多且不夠深入。馮云子[71]分析了醬油氨基酸的組成，利用高效液相色譜技術進行分析，測定了中式醬油和日式醬油中含有的可溶性無鹽固形物、氨基酸態(tài)氮、總氮、總酸和還原糖等指標，除此之外制定感官評價標準，進行了感官評價，實驗結果表明：中式和日式醬油在感官評價和非揮發(fā)性成分的存在明顯差異，中式醬油鮮、咸味突出，而日式醬油口感較為協(xié)調，兩類醬油感官差別的主要原因是非揮發(fā)性成分不同的組成。

4 展望

作為我國傳統(tǒng)的調味品，醬油擁有豐富的風味物質。伴隨著科學分析儀器的迭代發(fā)展和揮發(fā)性成分提取技術的進步，許多研究人員已開始重視醬油的揮發(fā)性成分的分析，提取、分離和鑒定醬油的揮發(fā)性風味成分。雖然研究人員已經通過多種方法檢測出醬油中的關鍵風味物質成分和其他風味物質成分，但是風味物質各成分的具體功能以及他們之間的相互作用仍不可知。此外，這些風味物質在食品加工過程中進一步變化并進一步影響食品整體風味的機理尚不清楚，因此這一問題所蘊含的科學內涵需要進一步探索和分析。