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    鐵十字酢漿草不同極性部位的HPLC 指紋圖譜與抗氧化活性研究

    2021-01-21 09:18:46李蕭娜紀(jì)永輝王京龍張立華臧遠(yuǎn)龍劉春河劉春江
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年24期
    關(guān)鍵詞:酢漿草內(nèi)芯外皮

    李蕭娜,紀(jì)永輝,王京龍,張立華,臧遠(yuǎn)龍,楊 彬,劉春河,劉春江

    (1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院,山東 棗莊 277160;2.棗莊虹合食品科技服務(wù)有限公司,山東 棗莊 277800)

    酢漿草(Oxalis corniculataL.)為酢漿草科植物酢漿草的新鮮或干燥全草,既是常見的綠化種植花卉,也常作為清熱解毒藥用,是苗族的傳統(tǒng)藥材[1]。酢漿草廣泛分布于云南、廣西、四川等地,大多用作藥物。酢漿草富含黃酮類、多酚類、多糖類等多種成分[2,3],具有清除自由基、防衰老、抗氧化的作用[4,5]。

    目前,對于酢漿草的藥理研究主要集中在抗炎鎮(zhèn)痛作用上,對其抗氧化活性的報道很少。研究表明,人體衰老、血栓形成等許多疾病與自由基有很大的關(guān)系,因其具有強氧化性,能攻擊生物大分子,進(jìn)而導(dǎo)致機體組織、細(xì)胞受到損傷。因此,評價和篩選具有抗氧化功能的天然抗氧化物,在對人體抗衰老等研究方面占據(jù)了重要地位[6],已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者重點研究的熱點問題。

    中藥化學(xué)指紋圖譜是一種綜合、整體的鑒定手段,強調(diào)多組分比例的相對穩(wěn)定和位置順序的完整性特征,以及在共同特征的基礎(chǔ)上個體之間又互有差異的模糊性特征[7-11]。馮華等[12]采用高效液相色譜法比較了不同產(chǎn)地的酢漿草干燥全草及其混淆品藥材的相似度;吳林菁等[13]采用UHPLC,研究了30批15 個不同產(chǎn)地的酢漿草指紋圖譜,并標(biāo)定共有峰24 個。本研究中所用的酢漿草采自云南省,經(jīng)鑒定為鐵十字酢漿草,試驗中所用的為其地下鱗莖部分,經(jīng)不同極性的有機溶劑初步萃取后,通過HPLC 指紋圖譜比較其不同部位在不同極性溶劑中的化學(xué)成分差異,并探究其抗氧化活性,為鐵十字酢漿草的深入研究提供參考[6,14]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 儀器 Agilent1260 型高效液相色譜儀(安捷倫科技(中國)有限公司);UV-2600 型全波段紫外可見掃描儀(日本島津公司);UV-2000 型紫外-可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司);FW100 型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);HH-S4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司);RE52CS-2 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-260 型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);KQ5200QDB 型超聲波清洗機(寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司);DHG-92464 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

    1.1.2 試藥 藥材采自云南省,經(jīng)鑒定為酢漿草科植物鐵十字酢漿草。沒食子酸、蘆丁、葡萄糖對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,上海源葉生物科技有限公司);乙腈、甲醇(色譜純,德國Merck 公司);其他試劑(分析純,國藥集團)。

    1.2 方法

    1.2.1 酢漿草鱗莖總多酚含量的測定

    1)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精確稱量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg,用無水乙醇定容至100 mL,即得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于容量瓶中,加入6 mL 酒石酸亞鐵溶液;再用pH 7.5 磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL,靜置顯色后在540 nm 波長下測定吸光度,重復(fù)3 次,取平均值[15,16]。將沒食子酸濃度與吸光度進(jìn)行線性回歸,回歸方程為y=13.993x+0.009 8,R2=0.999 1。

    2)供試品的制備。取酢漿草鱗莖洗凈,烘干后粉碎、過篩,保存?zhèn)溆?。取外皮、?nèi)芯粉末各2.00 g置于燒瓶中,加入適量乙醇溶液,超聲30 min 后過濾,吸取濾液3 mL,定容至25 mL 容量瓶中。

    1.2.2 酢漿草鱗莖總黃酮含量的測定

    1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg,用95% 乙醇溶液溶解,再用50% 乙醇溶液定容到100 mL 容量瓶中,制得標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL 至容量瓶中,加入50% 乙醇溶液至25 mL,加入亞硝酸鈉溶液1.5 mL,加入10% 硝酸鋁溶液1.5 mL,再加入1 mol∕L 氫氧化鈉溶液20 mL,最后用50% 乙醇溶液定容至50 mL,15 min 后于510 nm 波長下測定吸光度,重復(fù)3 次,取平均值[17,18]。將蘆丁濃度與吸光度進(jìn)行線性回歸,回歸方程為y=10.985x+0.006 3,R2=0.999 8。

    2)供試品的制備。取酢漿草鱗莖洗凈,烘干后粉碎、過篩,保存?zhèn)溆?。分別稱取2.00 g 酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯粉末置于燒瓶中,加入適量甲醇溶液超聲30 min 后過濾,濾液水浴蒸干后加入70% 乙醇溶液溶解,定容至10 mL,即得供試品溶液。

    1.2.3 酢漿草鱗莖多糖含量的測定

    1)總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg,去離子水定容至100 mL,即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,補加去離子水至2 mL,加5% 苯酚溶液1 mL,加濃硫酸5 mL,靜置10 min,沸水浴加熱20 min,取出冷卻[19,20],于487 nm 波長下測定吸光度,重復(fù)3 次,取平均值。將葡萄糖濃度與吸光度進(jìn)行線性回歸,回歸方程為y=66.84x+0.007 1,R2=0.999 3。

    2)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于試管中,補加去離子水至2 mL,加2 mL DNS 試劑,沸水浴加熱5 min,取出快速冷卻[21,22],在540 nm 波長下測定吸光度,重復(fù)3 次,取平均值。將葡萄糖濃度與吸光度進(jìn)行線性回歸,回歸方程為y=4.8126x+0.055 1,R2=0.999 4。

    3)供試品的制備。分別稱取2.00 g 酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯粉末置于燒瓶中,加去離子水,超聲10 min,沸水浴處理1.5 h 后過濾,取濾液1 mL 定容至25 mL,即為總糖供試液。另取濾液2 mL 定容至10 mL 作為還原糖的供試液。

    1.2.4 HPLC 指紋圖譜建立

    1)供試品的制備。取酢漿草鱗莖洗凈,烘干后粉碎、過篩,保存?zhèn)溆?。分別稱取酢漿草鱗莖外皮、鱗莖內(nèi)芯粉末8 g 置錐形瓶中,按料液比1∶10 加入70% 乙醇溶液,超聲振蕩提取3 次,收集濾液,減壓濃縮得浸膏,加入去離水定容至50 mL。分別取酢漿草鱗莖外皮和內(nèi)芯10 mL 溶液水浴揮干,用甲醇溶解定容。剩余40 mL 用等體積石油醚萃取,直至石油醚層無色。合并萃取液并減壓濃縮,殘渣即為石油醚相。剩余水相水浴揮盡石油醚,等體積氯仿萃取,直至氯仿層無色,合并萃取液并減壓濃縮,制得氯仿相。同法分別制備乙酸乙酯相、水飽和的正丁醇相。將石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇、水相水浴蒸干,用甲醇溶解定容,為不同極性部位的供試品溶液。

    2)色譜條件。Agilent C18色譜柱,流動相0.1%磷酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~15 min,10%~20% B;15~55 min,20%~50% B;55~75 min,50%~70% B;75~80 min,70%~80% B;80~100 min,80%~90%B;100~115 min,90%~100%B);流速1 mL∕min;柱溫25 ℃;檢測波長280 nm;檢測時間115 min;進(jìn)樣量20 μL。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同部位酢漿草鱗莖中活性成分含量的測定結(jié)果

    酢漿草鱗莖不同部位中活性成分含量測定結(jié)果如表1 所示。

    表1 不同部位活性成分的含量

    2.2 HPLC 指紋圖譜建立及分析

    2.2.1 方法學(xué)驗證

    1)穩(wěn)定性試驗。取同一批酢漿草供試液20 μL,分別于0、4、8、12、24 h 考察指紋圖譜,結(jié)果顯示共有峰相對保留時間的RSD均小于3.0%。

    2)精密度試驗。取相同的供試液20 μL 連續(xù)進(jìn)樣6 次,統(tǒng)計共有峰的相對峰面積、相對保留時間,其中峰面積比值的RSD小于3%,符合指紋圖譜的要求,儀器精密度良好。

    3)重現(xiàn)性試驗。取同一批次的酢漿草供試液,在指定色譜條件下,檢測指紋圖譜,相對峰面積的RSD小于3%。

    2.2.2 酢漿草鱗莖醇提液HPLC 指紋圖譜 精密吸取酢漿草供試品溶液各20 μL,分別進(jìn)樣,經(jīng)梯度洗脫,記錄HPLC 指紋圖譜,酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯醇提液HPLC 指紋圖譜如圖1。

    圖1 酢漿草鱗莖醇提液指紋圖譜

    酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯醇提液相對保留時間和指紋圖譜比較分析見表2。分析酢漿草鱗莖外皮、內(nèi)芯總醇提液的指紋圖譜,以21 號峰為基準(zhǔn)峰,結(jié)果標(biāo)定醇提液外皮共有峰32 個,內(nèi)芯31 個。內(nèi)芯(B)與外皮(A)相比,缺失5 號特征峰。總峰面積:總醇提液外皮(A)>總醇提液內(nèi)芯(B)。

    表2 酢漿草鱗莖醇提液指紋圖譜分析

    2.2.3 酢漿草鱗莖不同極性部位HPLC 指紋圖譜

    1)酢漿草鱗莖外皮不同極性部位HPLC 指紋圖譜。精密吸取酢漿草供試品溶液各20 μL,分別進(jìn)樣,經(jīng)梯度洗脫,記錄HPLC 指紋圖譜,酢漿草鱗莖外皮不同極性部位HPLC 指紋圖譜疊加如圖2。酢漿草鱗莖外皮不同極性部位HPLC 指紋圖譜比較分析見表3。

    表3 酢漿草鱗莖外皮不同極性部位指紋圖譜比較分析

    圖2 酢漿草鱗莖外皮不同極性部位指紋圖譜疊加圖

    經(jīng)分析得到酢漿草鱗莖外皮不同極性部位的共有峰,其中石油醚相(A1)8 個,氯仿相(A2)22 個,乙酸乙酯相(A3)22 個,正丁醇相(A4)26 個,水相(A5)9個。總峰面積:A2>A3>A4>A1>A5。

    2)酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位HPLC 指紋圖譜。精密吸取酢漿草供試品溶液各20 μL,分別進(jìn)樣,經(jīng)梯度洗脫,記錄HPLC 指紋圖譜,酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位HPLC 指紋圖譜疊加如圖3。酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位HPLC 指紋圖譜分析見表4。

    表4 酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位HPLC 指紋圖譜比較分析

    圖3 酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位指紋圖譜疊加圖

    經(jīng)分析得到酢漿草鱗莖內(nèi)芯不同極性部位的共有峰,其中石油醚相(B1)14 個,氯仿相(B2)21 個,乙酸乙酯相(B3)17 個,正丁醇相(B4)19 個,水相(B5)10 個??偡迕娣e:B2>B4>B5>B1>B3。

    2.2.4 HPLC 指紋圖譜相似度評價 以鐵十字酢漿草鱗莖外皮和內(nèi)芯不同極性部位的32 個共有峰峰面積,采用夾角余弦值進(jìn)行相似度分析。

    1)鱗莖同部位不同極性的圖譜相似度。酢漿草鱗莖同一部位在不同極性溶劑中指紋圖譜相似度計算分析結(jié)果見表5。不同極性部位外皮的夾角余弦值中,氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相的相似度大于0.9,化學(xué)組成相似,不同極性內(nèi)芯相似度有差異,在其化學(xué)組成上存在一定差異。

    表5 同部位不同極性指紋圖譜相似度結(jié)果

    2)鱗莖同極性不同部位的圖譜相似度。酢漿草鱗莖不同部位在相同極性溶劑中指紋圖譜相似度計算分析結(jié)果見表6。相同極性不同部位的夾角余弦值中,醇提液、氯仿相外皮和內(nèi)芯相似度大于0.9,酢漿草外皮和內(nèi)芯在醇提液、氯仿相其化學(xué)成分相似。乙酸乙酯相外皮和內(nèi)芯相似度比較小,化學(xué)成分可能存在差異。

    表6 同極性不同部位指紋圖譜相似度結(jié)果

    2.3 抗氧化活性測定

    2.3.1 1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)清除率的測定 取不同濃度供試液3.0 mL 置于試管中,加入3.0 mL 0.20 mmol∕L 的DPPH 溶液,充分振蕩,室溫暗處反應(yīng)30 min,測定517 nm 波長處吸光度A,同時測定3.0 mL 無水乙醇和3.0 mL DPPH 混合液的吸光度為A1,測定3.0 mL 供試液和3.0 mL 無水乙醇混合液的吸光度為A2,以無水乙醇作空白,重復(fù)3 次,按下面公式計算清除率。同法操作,以抗壞血酸為陽性對照[15,16]。

    DPPH·自由基清除率D=[1-(A-A2)∕A1]×100%

    2.3.2 羥基自由基(·OH)清除率的測定 將供試品溶液稀釋至不同的濃度,按下表自上而下加入試劑,加入樣品、硫酸亞鐵溶液后充分震蕩混勻[17-19],所加試劑見表7。

    表7 試劑加樣

    在加入以上試劑后,在37 ℃水浴中靜置60 min,在536 nm 波長下測定吸光度A樣、A損、A未損,重復(fù)3 次,按下面公式計算清除率。同法操作,以抗壞血酸為陽性對照。

    ·OH 自由基清除率D=(A樣-A損)∕(A未損-A損)×100%

    2.3.3 酢漿草鱗莖不同極性部位抗氧化活性測定分析

    1)不同極性部位對1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)的清除率。酢漿草鱗莖外皮不同極性部位對DPPH·自由基的清除率如圖4,內(nèi)芯不同極性部位對DPPH·自由基的清除率如圖5。由圖4 可知,鱗莖外皮對DPPH·自由基的清除率:氯仿相>乙酸乙酯相>石油醚相>正丁醇相>水相。由圖5可知,鱗莖內(nèi)芯對DPPH·自由基的清除率:氯仿相>正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚相>水相。

    圖4 外皮不同極性部位對DPPH·自由基的清除率

    圖5 內(nèi)芯不同極性部位對DPPH 自由基的清除率

    2)不同極性部位對羥基(·OH)自由基的清除率。酢漿草鱗莖外皮不同極性部位對·OH 自由基的清除率如圖6,內(nèi)芯不同極性部位對·OH 自由基的清除率如圖7。由圖6 可知,鱗莖外皮對·OH 自由基的清除率:氯仿相>乙酸乙酯相>石油醚相>正丁醇相>水相。由圖7 可知,鱗莖內(nèi)芯對·OH 自由基的清除率:氯仿相>正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚相>水相。

    圖6 外皮不同極性部位對·OH 自由基的清除率

    圖7 內(nèi)芯不同極性部位對·OH 自由基的清除率

    3 小結(jié)與討論

    采用的鐵十字酢漿草鱗莖中富含多酚、黃酮、多糖類等成分,采用酒石酸亞鐵顯色法、亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法、硫酸-苯酚法與DNS 法,所采用方法均為常用的經(jīng)典傳統(tǒng)方法,符合方法學(xué)要求,測得其總量分別為:10.18、24.33、138.02 mg∕g,可見酢漿草鱗莖外皮與內(nèi)芯活性成分總含量有一定差異。

    在抗氧化活性測定體系中,不同極性的鱗莖外皮和內(nèi)芯都有的抗氧化能力。鱗莖外皮對·OH 自由基的清除率為:氯仿相>乙酸乙酯相>石油醚相>正丁醇相>水相,鱗莖內(nèi)芯對·OH 自由基的清除率為:氯仿相>正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚相>水相,可見鱗莖外皮和內(nèi)芯的氯仿相比其他相具有更高的抗氧化能力,且氯仿相指紋圖譜峰面積大,信息量豐富,后續(xù)可對酢漿草鱗莖的氯仿相深入探究。

    建立了其鱗莖外皮和內(nèi)芯不同極性部位的HPLC 指紋圖譜,并探究其抗氧化活性。經(jīng)對比分析酢漿草鱗莖不同極性的HPLC 指紋圖譜,發(fā)現(xiàn)各相峰面積都有一定差異。以21 號峰為基準(zhǔn)峰標(biāo)定醇提液外皮共有峰32 個,內(nèi)芯31 個。其中,總醇提液外皮的指紋圖譜明顯優(yōu)于內(nèi)芯,在外皮中存在5號特征峰,峰面積較大,內(nèi)芯中未出現(xiàn),可進(jìn)一步對此峰進(jìn)行研究。且總醇提液峰面積外皮遠(yuǎn)大于內(nèi)芯。不同極性部位共有峰外皮為石油醚相8 個、氯仿相22 個、乙酸乙酯相22 個、正丁醇相26 個、水相9 個、內(nèi)芯為石油醚相14 個、氯仿相21 個、乙酸乙酯相17 個、正丁醇相19 個、水相10 個。鱗莖外皮不同極性部位中特征峰數(shù)目多,峰面積大,信息量豐富??偡迕娣e中,外皮和內(nèi)芯都是氯仿相峰面積最大,數(shù)量多,且外皮其他各個極性部位指紋圖譜信息量都遠(yuǎn)大于內(nèi)芯。

    對酢漿草鱗莖外皮和內(nèi)芯不同極性部位的32個共有峰峰面積進(jìn)行相似度分析發(fā)現(xiàn),酢漿草鱗莖外皮和內(nèi)芯在氯仿相中相似度大于0.9,而且氯仿相的抗氧化能力最高,外皮和內(nèi)芯的氯仿相萃取物化學(xué)成分相似。酢漿草鱗莖的相同部位在不同極性中,鱗莖外皮的氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相均大于0.9,乙酸乙酯相與正丁醇相相似度接近。在抗氧化測定中,鱗莖外皮的乙酸乙酯相與氯仿相自由基清除率相近,所以在這兩相中酢漿草鱗莖外皮的化學(xué)組成可能相似。大多中藥質(zhì)量的評價只探究藥材的同極性同部位指紋圖譜,不利于精細(xì)分析質(zhì)量,本試驗對鐵十字酢漿草不同極性部位的指紋圖譜、抗氧化活性進(jìn)行探究并考察相似度,能夠更加全面評價中藥質(zhì)量。

    鐵十字酢漿草作為常見花卉,有著較大的栽培面積,其藥用部位多為地上全草部分。本試驗發(fā)現(xiàn),其地下鱗莖部分化學(xué)成分豐富,并且鱗莖外皮不同極性部位HPLC 指紋圖譜更能全面反映酢漿草的化學(xué)組成信息,反映出其較好的抗氧化活性。本研究結(jié)果鐵十字酢漿草地下鱗莖富含活性成分,具備較好的抗氧化作用,為該植物的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)支撐。

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