人顆粒蛋白A 的表達(dá)、優(yōu)化及抗腫瘤活性研究

張雪健, 韓玉峰, 王繁業(yè)

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院, 山東 青島 266042)

1 前 言

顆粒蛋白(GRN)，也稱為上皮蛋白，通過顆粒體蛋白前體(pGRN)產(chǎn)生，分子量在6 kD 左右，由多種功能富含半胱氨酸的多肽家族組成。GRN 家族的成員含有12 個(gè)半胱氨酸殘基，排列在高度保守的位置，半胱氨酸殘基形成分子內(nèi)二硫鍵，具有特征緊密堆積的結(jié)構(gòu)[1-2]。pGRN 是一種分泌性糖蛋白，在胚胎發(fā)育、宿主防御、抗炎和創(chuàng)傷修復(fù)等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[3]。大量研究證明pGRN 在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。在許多類型的癌癥的臨床標(biāo)本中已經(jīng)觀察到pGRN 的過度表達(dá)，尤其是在具有高惡性腫瘤的癌癥中[4-5]。Bateman 等[6]最初從人類炎癥細(xì)胞分泌物以及大鼠骨髓中分離得到GRNA、GRNB、GRNC 和GRND。Sparro 等[7]從尿液中分離出GRNF。GRN 家族在結(jié)構(gòu)上與表皮生長因子/轉(zhuǎn)化生長因子α(EGF/TGFα)家族具有相似性，GRN 在體外顯示出對哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長的抑制或促進(jìn)作用，GRN 家族的不同成員可以作為細(xì)胞增殖的激動(dòng)劑或拮抗劑，并在胚胎發(fā)生、細(xì)胞存活、細(xì)胞遷移、組織修復(fù)、炎癥和血管生成中起作用[8-10]。

實(shí)驗(yàn)室前期從海鞘中分離出一種新型抗腫瘤多肽 CS5931[11]，因該多肽的三維結(jié)構(gòu)類似于 HGRNA，推測HGRNA 可能也具有抗腫瘤活性。為了探究HGRNA 的抗癌活性，構(gòu)建一種能夠在畢赤酵母細(xì)胞高效表達(dá)多肽的方法，優(yōu)化發(fā)酵條件并探究GRNA 的抗腫瘤生物活性。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒、菌株與癌細(xì)胞：表達(dá)載體 pGAPZαA，生物風(fēng)公司；大腸桿菌(E.coli)DH-5α 由實(shí)驗(yàn)室保存；畢赤酵母菌株(P. pastoris)SMD1168H，山東大學(xué)生物醫(yī)藥研究院；人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人胰腺癌細(xì)胞SW1990、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人腎細(xì)胞293T，上海奧陸生物技術(shù)有限公司。

生化試劑：限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、DNA 回收試劑盒、胎牛血清、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、透析袋，美國Sigma 公司；PCR Mix，南京凱基公司；DNA 標(biāo)記物(marker)，深圳華因賽生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，上海信帆生物科技有限公司；培養(yǎng)基RPMI-1640、質(zhì)粒提取試劑盒，美國Thermo Scientific 公司；小鼠抗His-tag 單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG-HRP，上海愛必信生物技術(shù)有限公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基配制：LB 液體培養(yǎng)基，將5 g 酵母提取物、10 g 胰蛋白胨及5 g NaCl 用1 L 雙蒸水(ddH2O)溶解，再用5 mol?L-1的NaOH 將溶液pH 調(diào)節(jié)至7.0，高壓滅菌冷卻后待用。LB 固體培養(yǎng)基，取配制好的600 mL LB 液體培養(yǎng)基，加入9 g 瓊脂糖攪拌均勻后高壓滅菌冷卻至45 ℃，在無菌條件下均勻加入15 mg 博來霉素(Zeocin)，冷卻備用。

蛋白緩沖液配制：將 17.5 g NaCl、17 g 甘惡啉、6 g NaH2PO4，使用 ddH2O 溶解并用 1 mol?L-1的 HCl調(diào)節(jié)pH 至8.0 后定容至1L。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 多肽的克隆

根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)了一對引物，正向引物：5′-CCGGAATTC GATGTGAAATGTGACATGAG-3′，反向引物：5′-CTAGTCGATACCCTGTTCACAGGTACCCTTCT-3′，下劃線部分為EcoRI 和Xba I 酶切位點(diǎn)。用凝膠提取試劑盒純化擴(kuò)增的目的基因，利用EcoRI 以及Xba I 對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。將目的基因與載體pGAPZαA(載體圖譜見圖1，由質(zhì)粒公司官網(wǎng)提供)連接后導(dǎo)入感受態(tài)的DH-5α，在LB 培養(yǎng)基上初步培養(yǎng)。

2.2.2 多肽在酵母細(xì)胞中的制備及表達(dá)

將含有目的基因的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入酵母液中，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢查蛋白表達(dá)情況。Western印跡分析也用于檢查表達(dá)的蛋白質(zhì)，將發(fā)酵上清液中的多肽進(jìn)行電泳，將多肽從瓊脂凝膠電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，小鼠抗 His-tag單克隆抗體作為一抗，山羊抗小鼠 IgG-HRP 作為二抗，做蛋白印跡分析。

2.2.3 酵母發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)方法和設(shè)計(jì)

去中心化屬于區(qū)塊鏈技術(shù)的基本屬性，是區(qū)塊鏈技術(shù)和其他技術(shù)得以區(qū)分的基本特點(diǎn)。去中心化既有物理基礎(chǔ)又有組織形式，具體如下：

因酵母菌株為好氧菌，所以實(shí)驗(yàn)中增加了通氣環(huán)節(jié)。將過濾后的潔凈空氣通入搖瓶，以增加供氧量。具體流程為：空氣壓縮機(jī)-穩(wěn)壓閥-穩(wěn)流閥-流量計(jì)-過濾器-搖瓶。將空氣壓縮后經(jīng)過穩(wěn)壓閥和穩(wěn)流閥得到穩(wěn)定氣流，計(jì)量后經(jīng)過濾膜通入搖瓶。

圖1 載體pGAPZαA 圖譜Fig.1 Spectrum of Vector pGAPZαA

通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定部分培養(yǎng)基成分(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：酵母粉1.5%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.6%、(NH4)2SO40.2%和MgSO40.05%，通過實(shí)驗(yàn)獲取了最佳接種量 7%、最佳發(fā)酵時(shí)間80 h。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對通氣量A、豆粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)B、發(fā)酵溫度C、發(fā)酵初始pH 值D 4 個(gè)因素進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。其中前個(gè)因素采用2 水平，發(fā)酵初始pH 采用3 水平的混合設(shè)計(jì)方法。自變量和水平見表1，使用Minitab16軟件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of experimental design

表2 實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results

表3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度配制Table 3 Standard protein concentration configuration

2.2.4 多肽的分離純化與濃度測定

在最優(yōu)發(fā)酵條件下，將酵母菌液在4 ℃、1 000 r?min-1條件下離心10 min 后收集上清液。加入咪唑洗滌緩沖液，上清液以體積流量 6 mL?min-1經(jīng)金屬螯合親和層析柱(MCAC)純化，收集各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE 檢測。

將分離提純后的多肽在4 ℃下透析10 h后進(jìn)行離心濃縮。離心機(jī)在4 ℃環(huán)境下，轉(zhuǎn)速為4 000 r?min-1離心5 min。使用BCA 法在562 nm 處測定蛋白濃度，配制標(biāo)準(zhǔn)如表3 所示。

2.2.5 多肽的抗腫瘤活性探究

采用MTT 法測定。人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人胰腺癌細(xì)胞SW1990、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人腎細(xì)胞293T，在含有10% 胎牛血清(FBS)的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代后取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化細(xì)胞并調(diào)整濃度。加入不同濃度純化的HGRNA 樣品培養(yǎng)48 h。然后按照 20 μL 每孔加入 5 mg?mL-1的 MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4～6 h，再按照 150 μL 每孔加入 DMSO，待結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀測定各孔 A570值。抑制率的計(jì)算式為：抑制率(致死率)=(對照組 A 值-實(shí)驗(yàn)組 A 值)/對照組A 值。

將癌細(xì)胞在對數(shù)生長期消化后使用顯微鏡實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓后終止消化調(diào)整濃度培養(yǎng)24 h 后，吸出培養(yǎng)液加入不同濃度的HGRNA，對照組加入同體積的PBS。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后使用倒置顯微鏡觀察并拍照。利用DAPI 染色方法同上培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后吸取培養(yǎng)液，在4 ℃下用4% 多聚甲醛固定細(xì)胞1 h，用PBS 洗滌并在黑暗中加入5 μg?mL-1的4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)染液1 mL 染色10 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 多肽的表達(dá)

目的基因的瓊脂糖凝膠電泳和測序結(jié)果如圖。 從圖2 中可以看出，通過PCR 擴(kuò)增到一條約170 bp 目標(biāo)帶，通過與HGRNA 對比發(fā)現(xiàn)分子量大小相符，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)室前期使用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)多肽沒有活性。猜測可能是因?yàn)樵松餂]有足夠的細(xì)胞器進(jìn)行蛋白加工及修飾，而巴斯德畢赤酵母作為真核生物被認(rèn)為是生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)最有效、用途最廣泛的系統(tǒng)之一[12]?？梢栽诖_定的礦物培養(yǎng)基中生長高細(xì)胞密度，并且還可以進(jìn)行許多翻譯后修飾，例如蛋白質(zhì)折疊，蛋白水解加工，二硫鍵形成和糖基化，也可以使用合適的分泌信號將蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中[13]。故使用巴斯德畢赤酵母對目標(biāo)多肽進(jìn)行表達(dá)。通過對多肽進(jìn)行SDS – PAGE 電泳分析檢測(圖3)，可以看出大約在15 kD 處清晰可見誘導(dǎo)表達(dá)帶。為了進(jìn)一步確認(rèn)HGRNA 的成功表達(dá)，進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析(圖4)。結(jié)果表明與SDS-PAGE 分析相對應(yīng)的位置上出現(xiàn)了一條清晰的條帶，證明目標(biāo)多肽在畢赤酵母菌株中成功表達(dá)。

圖2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results

圖3 畢赤酵母液中HGRN A 多肽SDS-PAGE 表達(dá)情況Fig.3 SDS-PAGE results of HGRN A expression in Prichia pastoris

3.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，探究 A-通氣量(mL?min-1)(即每分鐘通氣體積)、B-豆粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)、C-發(fā)酵溫度(℃)、D-發(fā)酵初始 pH 4個(gè)因素。以Y-蛋白收率為目標(biāo)，對表2 結(jié)果進(jìn)行擬合得到回歸方程：

圖5(a)、(b)、(c)分別給出了蛋白多肽收率與豆粉、pH；通氣量、pH；發(fā)酵溫度、pH 的關(guān)系圖。通過圖5(a)可以看出在通氣量和發(fā)酵溫度固定的情況下，蛋白收率在培養(yǎng)液pH 不變的情況下隨著培養(yǎng)基中豆粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而升高，在培養(yǎng)基豆粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(shí)隨著培養(yǎng)液 pH 的增大先升高后降低。由于固定了通氣量和發(fā)酵溫度，在此水平上沒有最大值，同理分析圖 5(b)及圖 5(c)。酵母在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量乙酸及乳酸，這會改變發(fā)酵液的pH 從而影響菌株生長及蛋白表達(dá)[14]。選擇合適的pH 不僅能夠提高酵母的生長還能提高分泌蛋白的活性，防止其發(fā)生降解。培養(yǎng)液pH 過高或過低不利于酵母菌株的增殖，豆粉含量的多少同樣對酵母生長產(chǎn)生促進(jìn)或者抑制作用。通過軟件進(jìn)一步分析得出此時(shí)豆粉含量在1.6%左右，發(fā)酵pH 在6.6 左右。由圖5(b)可知，當(dāng)豆粉和發(fā)酵溫度不變，培養(yǎng)液pH 固定時(shí)蛋白收率隨著通氣量的增加而逐漸升高。對于酵母菌液的搖瓶發(fā)酵，瓶口的防菌紗布限制了空氣交換，而通氣量的多少決定酵母接觸氧氣的多少，酵母能否高密度發(fā)酵由氧氣來決定。本研究表明通氣量在0.1 mL?min-1即可提高蛋白收率。當(dāng)通氣量過少不利于菌株的代謝與高密度增殖，過高則會使得培養(yǎng)液中氧自由基濃度偏大導(dǎo)致酵母發(fā)生中毒死亡[15]?？紤]以上條件最終將通氣量設(shè)定在0.13 mL?min-1左右。由5(c)可見，固定通氣量與豆粉含量，當(dāng)培養(yǎng)液 pH 不變時(shí)，發(fā)酵溫度的持續(xù)升高在一定范圍內(nèi)會活躍酵母菌株，有利于提高菌株生長密度，而較低溫度有利于多肽的正確折疊、提高蛋白表達(dá)，折疊不良的肽抑制性弱或無活性[16]。故而在生長階段與誘導(dǎo)階段采用不同的培養(yǎng)溫度?？紤]到誘導(dǎo)溫度在20～28 ℃，設(shè)定發(fā)酵溫度在24.5 ℃左右。

圖4 HGRN A 多肽Western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of HGRN A

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化模型，以最大蛋白收率為優(yōu)化目標(biāo)，獲得了酵母發(fā)酵最優(yōu)條件：豆粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%、培養(yǎng)液初始pH 6.6、通氣量0.13 mL?min-1、發(fā)酵溫度24.5 ℃。3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的蛋白收率平均值為13.97 mg?mL-1，與回歸模型的預(yù)測值(14.49 mg?mL-1)相差3.7%。蛋白收率的預(yù)測值與實(shí)際值基本吻合，驗(yàn)證了模型的可行性。

3.3 多肽的純化與濃度測定

在最優(yōu)表達(dá)條件下利用 MCAC 柱分離重組多肽，SDS-PAGE 純化結(jié)果如圖 6 所示。凝膠分析軟件Bandscan 5.0 對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示純化率為99.2%，說明純化效果顯著。質(zhì)粒載體表達(dá)蛋白(圖1)由α-factor信號肽(分子量約為8 kD)、HGRNA(分子量約為6 kD)、Myc 標(biāo)簽(分子量約為1.1 kD)及6 個(gè)His 標(biāo)簽(分子量約為0.84 kD)依次組成，與SDS-PAGE 純化結(jié)果顯示的分子量15 kD 基本相符，誤差在合理范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線擬合結(jié)果如圖7 所示，測得目標(biāo)多肽濃度為19.01 mg?mL-1。

圖6 HGRNA 多肽純化結(jié)果Fig.6 Purification results of HGRNA

圖7 蛋白濃度曲線Fig.7 Standard curve of protein concentration

3.4 多肽的抗腫瘤活性探究

圖8 HGRNA 多肽對3 種癌細(xì)胞的抑制結(jié)果Fig.8 Inhibition of HGRNA on three cancer cells

使用MTT 法檢測HGRNA 多肽對SW480、SW1990、A549、239T 的細(xì)胞毒性作用，結(jié)果如圖8 所示。結(jié)果表明HGRNA 對3 種癌細(xì)胞都比較敏感而對正常細(xì)胞無明顯作用。HGRNA 在低濃度(50 μg?mL-1)時(shí)對3 種癌細(xì)胞抑制作用不明顯，提高處理濃度后，具有明顯的抑制效果。其中對SW480 的抑制效果最好，在濃度為200 μg?mL-1時(shí)抑制率達(dá)到 80%，而 SW1990、A549的抑制效果次于SW480。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示目標(biāo)多肽對3 種癌細(xì)胞抑制作用效果呈劑量依賴性關(guān)系，IC50值分別為89.7、106.2、100.8 μg?mL-1。

GRN 家族的不同蛋白具有不同的生物活性，高分辨率核磁共振(NMR)顯示，只有 GRNA、GRNC 和GRNF 在溶液中含有相對明確的三維結(jié)構(gòu)，而其他的主要是結(jié)構(gòu)較差的二硫異構(gòu)體的混合物。GRNA、GRNC 和GRNF 的三維結(jié)構(gòu)在它們的n-端子域中包含一個(gè)穩(wěn)定的b-發(fā)夾堆棧，但在c-端子域中顯示出更靈活的結(jié)構(gòu)[5]。Van 等[17]將GRNE 作為單一培養(yǎng)物放在Wistar 大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元中，在不添加其他生長因子的情況下發(fā)現(xiàn)GRNE 以劑量依賴的方式支持神經(jīng)元存活，這說明 GRN 可作為神經(jīng)營養(yǎng)因子來調(diào)節(jié)神經(jīng)生長并增強(qiáng)神經(jīng)元存活。Liau 等[18]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中有大量GRND 的存在，膠質(zhì)瘤在細(xì)胞遺傳學(xué)水平上的 17 號染色體的過量表達(dá)和 GRND具有一定相關(guān)性。Zhu 等[19]發(fā)現(xiàn)GRNB 可以抑制上皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌嗜中性粒細(xì)胞IL-8 的主要趨化因子，通過刺激白細(xì)胞介素的分泌而發(fā)揮抗炎作用。有趣的是GRNC 對乳腺癌細(xì)胞具有顯著抑制作用，而GRNF 具有刺激腫瘤細(xì)胞生長的作用[4]，這意味著有些GRN 能夠刺激細(xì)胞增殖，而其他GRN 則具有抑制細(xì)胞增殖的作用[20]。盡管對 GRN 家族的研究取得了重大進(jìn)展，但對HGRNA 的生物學(xué)功能仍不清楚。結(jié)合本研究的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(圖 8)可初步證明HGRNA 具有抗腫瘤生物學(xué)活性。

圖9 24 h 后的腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化Fig.9 Morphological change of tumor cells after 24 h

圖10 DAPI 染色后的細(xì)胞形態(tài)變化Fig.10 Cell morphology variation after DAPI staining

為了進(jìn)一步確定HGRNA 的誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(圖9)并借助DAPI染色(圖10)探究了細(xì)胞的凋亡情況。在處理細(xì)胞24 h 之后，從圖9 可見沒有經(jīng)過處理的2 種腫瘤細(xì)胞生長良好，細(xì)胞密度較大，排列有規(guī)則。實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞在經(jīng)過多肽處理后由規(guī)則的形態(tài)發(fā)生明顯的萎縮，細(xì)胞密度及黏度降低，細(xì)胞之間孔隙變大，貼壁距離變大排列不規(guī)律，而隨著給藥濃度的增加這樣現(xiàn)象更加明顯。將抑制率作用最好的SW480 進(jìn)行染色，從圖10 可以看出未經(jīng)處理的細(xì)胞呈正常狀態(tài)且分布均勻。低濃度處理下的細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，而高濃度作用下的腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)凝聚、半月形現(xiàn)象，且核膜核仁破碎，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)室前期證明了一種海鞘多肽對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性并以劑量和時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于海鞘多肽的N 端序列與本實(shí)驗(yàn)中HGRNA 相同，且結(jié)構(gòu)相似，這意味著HGRNA 可能具有類似作用，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了這種推測。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(圖8) 表明了目標(biāo)多肽對3 種癌細(xì)胞的抗增殖作用。顯微鏡觀察結(jié)果(圖9)和DAPI 染色結(jié)果(圖10)表明目標(biāo)多肽可以誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明HGRNA可以作用于腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗增殖作用，并以劑量依賴方式誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化畢赤酵母菌株的發(fā)酵分離純化獲得大量 HGRNA，使用四種細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，MTT 結(jié)果表明HGRNA 對幾種人類癌細(xì)胞具有強(qiáng)烈抑制作用而對人正常細(xì)胞沒有損傷，細(xì)胞形態(tài)觀察表明該多肽能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)初步證明HGRNA 具有作為開發(fā)新型抗腫瘤藥物的潛力，為以后的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)，對其具體抗腫瘤機(jī)制及其他生物活性等問題需要進(jìn)一步研究。