七-(2,6-二甲基)-β -環(huán)糊精增溶橙皮苷的機理探討

于 湛, 王詩榕, 李天樂,2, 張新宇, 劉麗艷, 辛士剛, 張洪波

(1. 沈陽師范大學 化學化工學院, 沈陽 110034; 2. 鐵嶺縣高級中學, 遼寧 鐵嶺 112000; 3. 沈陽師范大學 實驗教學中心, 沈陽 110034)

0 引 言

環(huán)糊精(Cyclodextrin,CD)是一種天然環(huán)狀低聚糖[1-2]。天然CD中以含有6個、7個和8個D-(+)-吡喃葡萄糖單元并通過1, 4-糖苷鍵相連的α-CD、β-CD和γ-CD最為常見[3]。CD分子由于不能圍繞連接葡萄糖單元的糖苷鍵自由旋轉(zhuǎn),因此外觀呈圓環(huán)或圓錐狀[4],其外面有親水性羥基,內(nèi)部有疏水性空腔。獨特的結(jié)構(gòu)使得CD可將整個或部分客體分子包裹并結(jié)合在其空腔內(nèi),形成非共價復合物,所形成的復合物可顯著提高客體分子的溶解度與穩(wěn)定性[5]。由于存在分子內(nèi)氫鍵,天然CD的水溶性不佳,為了克服這一缺點,人們合成了具有較高水溶解性的2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2HP-β-CD)、2,6-二甲基-β-環(huán)糊精(DM-β-CD)和6-葡萄糖基-β-環(huán)糊精(6Glu-β-CD)等衍生物以提高其實際應(yīng)用效果。CD及其衍生物已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[6]。

橙皮苷(Hes)是橙皮素與蕓香糖形成的二氫黃酮類化合物[7]。從1828年法國化學家Lebreton自橘皮中首次分離獲得Hes以來,人們在檸檬和柑橘類水果中均發(fā)現(xiàn)了Hes[8]。有報道稱Hes是人們每天攝入量最高的黃酮類化合物[9]。Hes已被證實具有抗氧化、降血脂和抗癌活性[10]。此外,人們還發(fā)現(xiàn)Hes可以改善靜脈張力、增強微循環(huán)、幫助治愈靜脈潰瘍,并可用于治療慢性靜脈功能不全、痔瘡和預(yù)防術(shù)后血栓栓塞[11]。由于Hes自身在水中的溶解度很小,口服利用度不高,因此改善Hes溶解度對于提高其實際應(yīng)用具有積極意義。

本文選擇β-CD與2HP-β-CD、DM-β-CD和6Glu-β-CD 3種衍生物,對比研究它們對于Hes的增溶效果。利用紅外光譜法、X-射線粉末衍射法對增溶效果最好的DM-β-CD與Hes形成的復合物進行結(jié)構(gòu)表征,并利用分子模擬方法分析了DM-β-CD增溶Hes的機理。

圖1 CD(a)與Hes(b)的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of CD (a) and Hes (b)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Nicolet 380紅外光譜儀(美國賽默飛世爾公司);UH-5300紫外-可見光譜儀(日本日立公司);CT6TA高速離心機(上海天美公司)。

Hes對照品(上海如吉公司);β-CD、DM-β-CD、2HP-β-CD和6Glu-β-CD(上海源葉公司);實驗用水為超純水(25 ℃時電阻率為18.2 MΩ·cm);乙醇等溶劑均為色譜純或更高。

1.2 實驗方法

1.2.1 相溶解度法

精確稱取6份質(zhì)量相同的Hes(1.0 mg)于一次性離心管中,向其中分別加入不同體積的CD儲液,隨后加水至10 mL,使其中的CD濃度分別為0、1.0×10-3、2.0×10-3、3.0×10-3、4.0×10-3、5.0×10-3mol·L-1,然后超聲振蕩30 min后高速離心15 min,使用0.22 μm微孔濾膜過濾上層清液,測其在286.0 nm(λmax)處的吸光度。

1.2.2 紅外光譜法

DM-β-CD/Hes物理混合物是通過在瑪瑙研缽中將等摩爾的DM-β-CD與Hes均勻混合獲得,混合時間小于30 s。DM-β-CD/Hes復合物利用研磨法制得[12]。稱取一定量的DM-β-CD于研缽中并加入幾滴水,在紅外燈炙烤條件下研磨幾分鐘后得到均勻的膏狀物,在持續(xù)研磨的同時將等摩爾Hes分3次加入研缽并同時加入少量乙醇。將混合物研磨45 min后,將其轉(zhuǎn)移至50 ℃烘箱中干燥24 h后待用。

1.2.3 分子模擬

β-CD的三維結(jié)構(gòu)來自于劍橋晶體數(shù)據(jù)庫,DM-β-CD、2HP-β-CD與6Glu-β-CD等3個衍生物結(jié)構(gòu)由β-CD結(jié)構(gòu)修飾得到,Hes結(jié)構(gòu)來自PubChem。在進行分子模擬計算前,主客體均采取MMFF94方法[13]進行優(yōu)化。

利用Autodock 4.2.5.1軟件[14]對DM-β-CD與Hes進行分子對接模擬。主客體分子均使用程序默認值進行處理,Autogrid box大小為126 ?×126 ?×126 ?,grid spacing為0.375 ?,選擇Lamarckian genetic algorithm (LGA)算法尋找主客體間最佳的結(jié)合位置。本文采用較大的運算參數(shù)提高了計算量保證對接計算的充分程度,部分參數(shù)設(shè)置如下:ga_num_evals(最大能量評估值)為2500000;ga_pop_size(種群數(shù))為150;ga_run(運算循環(huán)次數(shù))為300。

使用MOPAC 2016(V 20.207 W)軟件[15]對主客體分子及對接所得結(jié)果分別進行半經(jīng)驗水平計算,評價復合物形成前后主客體的能量變化情況。力場采用PM6-D3H4和PM7,溫度為298.15 K,重要參數(shù)還包括XYZ、PRECISE、EF及GNOME=0.1。

為了評價復合物的動力學性能,使用Schr?dinger公司Maestro軟件包(2018.04)的Desmond模塊[16]對分子對接結(jié)果進行分子動力學模擬。最佳對接結(jié)果經(jīng)過Maestro的自動加氫和結(jié)構(gòu)糾錯后,將其置于一個棱長為10 ?且填充滿TIP3P水分子的立方體箱子中心,隨后使用Desmond默認參數(shù)進行體系弛豫和能量最小化,采用等溫等壓(NPT)系綜,溫度設(shè)為300 K,壓力設(shè)為1.013 25 bar,2 ns平衡后體系進行30 ns時長的分子動力學模擬。

2 結(jié)果與討論

2.1 相溶解度結(jié)果分析

圖2為Hes與4種CD的相溶解度曲線。

圖2 CD存在時Hes的相溶解度曲線Fig.2 Phase solubility curves of Hes with four CDs

由圖2可見,Hes溶解度隨著CD濃度的增加而增加,且表現(xiàn)出較好的線性相關(guān)性,擬合直線方程見表1。所有曲線均呈現(xiàn)AL型[17],表明主客體之間形成了1∶1復合物。

(1)

其中K為復合物平衡常數(shù),S0為Hes溶解度,slope為擬合直線斜率。本文已測得Hes的S0為5.2×10-5mol·L-1,由此可以計算出4種CD/Hes復合物的平衡常數(shù),列于表1。從表1可以看出,相同濃度時DM-β-CD對Hes具有最大增溶作用,所形成的復合物也具有最大的K值。當DM-β-CD濃度為5.0×10-3mol·L-1時,Hes溶解度可提高至2.85×10-4mol·L-1。

表1 不同CD/Hes復合物的平衡常數(shù)Table 1 Stability constants of CD/CPT inclusion complexes

2.2 紅外光譜分析

圖3(a)～3(d)分別為DM-β-CD/Hes復合物、物理混合物、DM-β-CD及Hes的紅外光譜圖。對比可以看出,物理混合物的紅外光譜圖呈現(xiàn)為DM-β-CD及Hes紅外光譜圖的直接疊加,而DM-β-CD/Hes復合物的紅外光譜圖則與之稍有不同,例如1 606 cm-1處吸收峰強度減弱,與1 650 cm-1處吸收峰合并為一個寬峰。1 606 cm-1吸收峰為Hes結(jié)構(gòu)中芳香環(huán)的特征吸收,此峰的強度降低表明Hes芳香環(huán)與周圍環(huán)境間存在相互作用,導致振動被抑制,由此可以判斷復合物中主客體間存在一定的相互作用。

圖3 DM-β -CD/Hes復合物(a)、DM-β -CD/Hes物理混 合物(b)、DM-β -CD(c)與Hes(d)的紅外光譜圖

圖4 DM-β -CD/Hes復合物(a)、DM-β -CD/Hes物理混 合物(b)、DM-β -CD(c)與Hes(d)的XRD譜圖

2.3 XRD分析

圖4為DM-β-CD/Lut復合物、物理混合物、DM-β-CD和Hes的XRD譜圖。從圖4可以看出DM-β-CD在5°～30°之間存在2個寬峰,表明主要以無定形方式存在,而Hes則存在一些明顯的特征衍射峰,表明其結(jié)晶狀態(tài)良好。物理混合物的XRD譜圖顯示了主客體特征衍射峰的簡單疊加,而在復合物譜圖中可以看到Hes所有的衍射峰強度下降明顯,12.2°、13.7°、16.3°、18.6°和24.84°等處的特征衍射峰基本消失,可見Hes的結(jié)晶性明顯減弱,呈現(xiàn)無定形狀態(tài),表明復合物中Hes物相發(fā)生重大改變,不再呈現(xiàn)結(jié)晶狀態(tài)而是分散于DM-β-CD中。

2.4 分子模擬計算分析

利用分子對接方法推測了DM-β-CD/Hes復合物結(jié)構(gòu),圖5為能量最低的對接結(jié)果。由圖可見,復合物中Hes分子的糖苷部分完全深入至DM-β-CD疏水性空腔內(nèi),與DM-β-CD的多個羥基間存在3個氫鍵作用,鍵長分別為1.75、2.58與2.17 ?,而苷元部分置于DM-β-CD大口處,且與DM-β-CD間存在疏水作用,作用距離為3.72 ?。主客體分子間的這些弱作用對于復合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用,是維持復合物結(jié)構(gòu)的重要因素。因此可以認為,DM-β-CD/Hes復合物數(shù)量較多的氫鍵作用與疏水作用是復合物形成的主要驅(qū)動力。

利用半經(jīng)驗計算考查了復合物及主客體分子能量變化情況。復合物的復合能ΔE復合能依照下述公式計算[12,18-19]:

ΔE復合能=ΔG復合能-(ΔG主+ΔG客)

(1)

其中ΔG復合物、ΔG主與ΔG客分別表示復合物、主體與客體的標準吉布斯自由能。

所得結(jié)果列于表2。

(a) 側(cè)視圖; (b )俯視圖圖5 DM-β -CD與Hes分子對接結(jié)果Fig.5 The molecular docking result of DM-β -CD and Hes

表2 DM-β -CD、Hes與DM-β -CD/Hes復合物的半經(jīng)驗量子化學計算結(jié)果Table 2 Semiempirical quantum calculation results of DM-β -CD,Hes and DM-β -CD/Hes complex.

圖6 DM-β -CD/Hes復合物的RMSD圖Fig.6 RMSD plots for the DM-β -CD/Hes complex

由表2數(shù)據(jù)可以看出,無論采用PM6-D3H4還是PM7方法計算,都可獲得相近的結(jié)果,即復合能小于0,從而說明DM-β-CD/Hes復合物的形成在熱力學上是自發(fā)的,從而驗證了分子對接結(jié)果的可靠性,也同時說明了DM-β-CD/Hes復合物具有一定的熱力學穩(wěn)定性。

通過分子動力學模擬計算考查了DM-β-CD/Hes復合物的動力學穩(wěn)定性。圖7給出了30 ns動力學模擬過程中復合物主、客體的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)變化情況。當模擬開始后,體系快速到達平衡,主、客體分子中各個原子的位置變化很小。在30 ns的分子動力學模擬時間內(nèi),主客體平均RMSD分別為2.000 7與1.034 7 ?,標準偏差(SD)分別為0.568 0與0.362 7 ?,表明復合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強[20-21]。

3 結(jié) 論

采用相溶解度法研究了β-CD及DM-β-CD、2HP-β-CD、6Glu-β-CD等4種環(huán)糊精及衍生物對Hes的增溶作用,結(jié)果表明這些化合物都是有效的增溶劑,可以通過與Hes形成1∶1型復合物方式促進Hes溶解度,其中DM-β-CD增溶作用最強,濃度為5.0×10-3mol·L-1時,可將Hes溶解度提高至未加入時的5.48倍。

本文還通過IR、XRD等方法表征了DM-β-CD/Hes復合物,采用分子對接推測了復合物的結(jié)構(gòu),結(jié)果表明主客體之間的氫鍵作用與疏水作用是復合物形成的主要驅(qū)動力。半經(jīng)驗量子化學與分子動力學模擬計算結(jié)果表明DM-β-CD/Hes復合物具有較強的熱力學與動力學穩(wěn)定性。