非優(yōu)質(zhì)胚培養(yǎng)至第7天囊胚凍融移植成功獲得活產(chǎn)1例

屈春鳳，莫鳳明，韋霽蕓，班婷

(河池市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，河池 547000)

一、病例資料

女方，33 歲，2019年3月因繼發(fā)性不孕11年到我中心就診?；颊咦栽V2004年足月順產(chǎn)1女，產(chǎn)后3個(gè)月放置宮內(nèi)節(jié)育器避孕；2008年行取環(huán)術(shù)，術(shù)后月經(jīng)規(guī)律，性生活正常，未避孕，但一直未孕。就診時(shí)，體質(zhì)量指數(shù)26.7 kg/m2，基礎(chǔ)FSH 7.41 U/L，LH 5.79 U/L，AMH 6.32 ng/ml，B超監(jiān)測排卵正常。2019年5月行子宮輸卵管造影提示雙側(cè)輸卵管通暢，染色體核型分析為46，XX，無基礎(chǔ)疾病，無不良孕史。

男方，38歲，2019年3月行精液檢查結(jié)果為精液量2.2 ml，精子濃度16.4×106/ml，精子活動(dòng)率54.1%，前向運(yùn)動(dòng)精子率32.5%，正常形態(tài)精子率4%。2019年4月再次行精液檢查結(jié)果為精液量4.8 ml，精子濃度7.8×106/ml，精子活動(dòng)率47.2%，前向運(yùn)動(dòng)精子率31.0%，正常形態(tài)精子率4%。兩次結(jié)果均提示為少弱精子癥，無煙酒嗜好，無基礎(chǔ)疾病史，染色體核型分析為 46，XY。

夫婦雙方曾于2019年7月在我院行第一周期人工授精助孕，精液處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)未達(dá)標(biāo)(<10×106/ml)，患者及家屬簽字要求繼續(xù)行人工授精手術(shù)，但未孕。2019年8月在我院行第2周期人工授精助孕，精液處理后仍不達(dá)標(biāo)，取消人工授精周期。于2019年10月轉(zhuǎn)體外受精-胚胎移植技術(shù)助孕，采用短效長方案進(jìn)行降調(diào)節(jié)，注射用尿促卵泡素(珠海麗珠制藥)進(jìn)行促排卵，2019年10月16日在陰道超聲引導(dǎo)下穿刺獲得5枚卵母細(xì)胞。取卵當(dāng)天男方采用手淫法取精，將密度梯度離心法處理后的精子用于體外受精。體外受精4 h后，根據(jù)脫顆粒細(xì)胞第二極體出現(xiàn)情況進(jìn)行成熟和受精判斷，發(fā)現(xiàn)5枚卵母細(xì)胞均為成熟卵母細(xì)胞(MⅡ)，立即對未受精的成熟卵母細(xì)胞行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)，獲得4枚正常受精卵。培養(yǎng)至第3天獲得2枚優(yōu)質(zhì)胚胎(8Ⅱ級胚胎)和2枚非優(yōu)質(zhì)胚胎(1枚5Ⅲ級，1枚4Ⅲ級)，新鮮移植 2 枚(8Ⅱ級)胚胎，剩余1枚5Ⅲ級和1枚4Ⅲ級進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。培養(yǎng)第5天未形成囊胚，第6天形成1枚I期囊胚，延長培養(yǎng)至第7天形成1枚4BC 囊胚，采用商品化玻璃化冷凍試劑及載體(KITAZATO，日本)，予以冷凍保存。

胚胎評分：卵裂期胚胎評級根據(jù)卵裂球數(shù)目、碎片、卵裂球的均勻程度等情況評估胚胎質(zhì)量，第3天卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)為7～9個(gè)、碎片比例不超過20%的Ⅰ級和Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。囊胚評分參照 Gardner 評分系統(tǒng)[1]，第5～6天≥3BB評為優(yōu)質(zhì)囊胚，第5～7天≥3BC評為可用囊胚。

凍融胚胎移植患者內(nèi)膜準(zhǔn)備：新鮮移植失敗后，患者于2020年1月回我院行凍融囊胚移植。月經(jīng)周期第2天行B超監(jiān)測內(nèi)膜，口服戊酸雌二醇片(拜耳，德國)2.0 mg/次，2次/d，6 d后增至6 mg/d，再6 d后增至8 mg/d；第17天開始肌注黃體酮(天津金耀藥業(yè))60 mg/次，1次/d進(jìn)行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化第7天進(jìn)行解凍囊胚移植。

復(fù)蘇移植：采用商品化玻璃化解凍試劑(KITAZATO，日本)進(jìn)行胚胎復(fù)蘇。對解凍囊胚行透明帶激光打孔輔助孵化，于37℃、三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，待囊腔擴(kuò)張后移植。移植后口服14 d戊酸雌二醇片(拜耳藥業(yè)，德國)8 mg/d和雪諾酮(默克公司，英國)90 mg/d。第14天抽血查人絨毛膜促性腺激素為 1 746 U/L；第35天進(jìn)行B超超聲檢查單胎妊娠，可見胎芽、卵黃囊及原始心血管搏動(dòng)。孕42周時(shí)，順產(chǎn)一女嬰，體重3 600 g，嬰兒生命體征正常，新生兒評分9分。

二、討論

隨著囊胚體外培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化，囊胚培養(yǎng)作為一種對胚胎發(fā)育潛能進(jìn)一步篩選的方法，已被廣泛應(yīng)用于臨床。大多數(shù)胚胎培養(yǎng)室常規(guī)將胚胎觀察培養(yǎng)至第5～6天，很少培養(yǎng)至第7天再利用。延長胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間，雖然可淘汰沒有發(fā)育潛能或攜帶異常染色體和基因的胚胎，但也存在胚胎質(zhì)量下降的可能性。D7囊胚形成率低，其質(zhì)量不如D5、D6囊胚，且在冷凍過程中容易受到損傷，增加細(xì)胞DNA碎片量、促進(jìn)凋亡基因轉(zhuǎn)錄，從而降低其發(fā)育潛能[2]。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎在體外培養(yǎng)至第5～6天的囊胚形成率約為67%，培養(yǎng)至第7天的囊胚形成率僅為29%[3]。Hammond等[4]研究表明，體外培養(yǎng)至第5天、第6天和第7天的可用囊胚率分別為 65%、30%和5%，且僅少數(shù)患者在第7天有可用囊胚形成。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，D5囊胚移植比D6囊胚移植可以獲得更高的臨床妊娠率及活產(chǎn)率[5-9]。郭娜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，分別移植了D5囊胚、D6囊胚和D7囊胚的患者，其臨床妊娠率分別為60.81%、50.12%和29.17%，活產(chǎn)率分別為 50.69%、39.23%和18.75%。盡管與D5囊胚和D6囊胚相比，D7囊胚形成率較低，但進(jìn)一步延長體外培養(yǎng)時(shí)間可以讓囊胚有更多被選擇的機(jī)會(huì)。Du等[11]研究發(fā)現(xiàn)，移植了15例整倍體D7囊胚，最終2例成功分娩，新生兒評分良好。最近，阮秋燕等[12]報(bào)道了1例凍融移植由第3天優(yōu)質(zhì)胚胎培養(yǎng)至第7天的囊胚，成功獲得活產(chǎn)的案例。本文報(bào)道的該例患者是凍融移植由第3天非優(yōu)質(zhì)胚胎(<6細(xì)胞Ⅲ級胚)培養(yǎng)至第7天的可用囊胚，最終成功單胎妊娠，順利分娩一名健康嬰兒。這說明將第3天發(fā)育遲緩、胚胎質(zhì)量差的卵裂期胚胎延長培養(yǎng)至第7天再進(jìn)行凍融移植，仍然可以獲得臨床妊娠和活產(chǎn)的機(jī)會(huì)。

近年來，利用植入前胚胎遺傳學(xué)非整倍體檢測(PGT-A)技術(shù)分析胚胎非整倍體性發(fā)現(xiàn)，發(fā)育緩慢的胚胎具有較高的非整倍體率。Su等[13]對1 966枚囊胚進(jìn)行活檢分析，發(fā)現(xiàn)D7囊胚中63.3%存在染色體異常。既往研究也發(fā)現(xiàn)，囊胚的非整倍體率與囊胚發(fā)育速度具有相關(guān)性，隨著囊胚形成天數(shù)的增加其非整倍體率也隨之增高[14-15]。Whitney等[16]發(fā)現(xiàn)，與移植D5囊胚相比較，移植D7囊胚的患者流產(chǎn)率顯著升高，活產(chǎn)率顯著降低。然而Hiraoka等[17]比較了分別凍融移植D5、D6、D7囊胚的出生結(jié)局發(fā)現(xiàn)，三組的孕周、早產(chǎn)率和平均出生體重均無顯著差異，故認(rèn)為不同天數(shù)形成的囊胚移植后可獲得相似的發(fā)育潛能。Du等[11]報(bào)道，與D5囊胚相比，凍融移植D7囊胚的活產(chǎn)率下降，但新生兒身體質(zhì)量、畸形發(fā)生率和新生兒死亡率均無顯著差異。因此，這對于部分自身?xiàng)l件差、獲得可用胚胎較少且胚胎質(zhì)量差、不能耐受再次IVF助孕的患者而言，將胚胎延長培養(yǎng)至第6天，可能是一種合適的策略，特別是在發(fā)育遲緩的情況下，可以繼續(xù)培養(yǎng)至第6天甚至第7天。但此類培養(yǎng)至第7天形成的囊胚面臨較高流產(chǎn)率的風(fēng)險(xiǎn)，其臨床應(yīng)用的可行性和安全性存在較大爭議[13]。在利用這類胚胎進(jìn)行凍融移植時(shí)，應(yīng)和患者充分溝通，說明利弊關(guān)系。

選擇利用D7囊胚的 IVF患者僅占很小一部分，對此類囊胚移植臨床結(jié)局的報(bào)道也較少，雖然可以獲得臨床妊娠及活產(chǎn)機(jī)會(huì)，但其應(yīng)用價(jià)值和安全性尚存在爭議，需要長期跟蹤隨訪后代健康來證實(shí)。