用分子對(duì)接研究肟類及苯丙素衍生物抗乙肝病毒機(jī)理

王衛(wèi)京，詹世平，丁仕強(qiáng)

（大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連 116622）

乙型肝炎是感染乙肝病毒（HBV）引起的臨床常見(jiàn)的傳染性疾病，乙肝病毒在人體內(nèi)連續(xù)不斷的復(fù)制會(huì)引起肝臟病變，嚴(yán)重危害患者健康?？挂腋尾《境Ｒ?jiàn)的藥物有核苷類似物和干擾素，這些藥物只能功能性抑制乙肝病毒。長(zhǎng)期以來(lái)，研究人員一直在探索抗乙肝病毒的機(jī)理，開(kāi)發(fā)新的抗乙肝病毒的藥物。

婁曉月采用體外篩選，研究了10種中藥化合物體外抗乙肝病毒的活性及其作用機(jī)制。崔新華等設(shè)計(jì)了一系列新型結(jié)構(gòu)的肟及肟類衍生物，測(cè)試了其體外抗乙肝病毒活性，研究了其對(duì)表面抗原 （HBsAg）與 e 抗原 （HBeAg）的半數(shù)抑制濃度 IC50 值。Liu 等則研究了苯丙素衍生物的抗乙肝病毒活性，測(cè)試了該類衍生物對(duì)表面抗原 （HBsAg）與 e 抗原 （HBeAg）的IC50值。王勇翔通過(guò)生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)確認(rèn)了乙肝病毒聚合酶的新功能區(qū)，研究了該功能區(qū)的作用機(jī)制，尋求抑制乙肝病毒聚合酶的藥物。

分子對(duì)接是大規(guī)模藥物分子虛擬篩選的重要方法，廣泛應(yīng)用于藥物研究與設(shè)計(jì)領(lǐng)域。該方法通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬將小分子（配體）放置于大分子靶點(diǎn)（受體）的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)空間構(gòu)象和相互作用在結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)不斷定位并尋找最佳匹配狀態(tài)。分子對(duì)接方法也被許多研究者用于抗乙肝病毒活性有效成分的篩選。姚香草用分子對(duì)接篩選了雞骨草抗乙肝病毒的活性成分，并進(jìn)行了體外抗HBV 活性評(píng)價(jià)。Meng 等利用同源建模的方法構(gòu)建了乙肝病毒DNA 聚合酶三維結(jié)構(gòu)，以此為靶點(diǎn)通過(guò)分子對(duì)接研究了馬蹄金素及其衍生物的抗乙肝病毒活性。Vijayakumar Subramaniyan 等利用分子對(duì)接篩選了40種藥物植物成分，認(rèn)為杠香藤酸是一個(gè)合適的抗乙肝病毒的候選藥物。

乙肝病毒HBV 基因有4 個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼7 個(gè)蛋白，其中的乙肝病毒聚合酶，核衣殼蛋白以及x 蛋白HBx 在病毒復(fù)制過(guò)程中起重要作用。乙肝病毒聚合酶在核衣殼蛋白包裝成核衣殼顆粒中起關(guān)鍵作用，在乙肝病毒復(fù)制過(guò)程中將子代RNA 逆轉(zhuǎn)錄成DNA。核衣殼蛋白能夠自組裝成核衣殼顆粒，并調(diào)節(jié)核衣殼內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。HBx 蛋白可以調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)乙肝病毒的逆轉(zhuǎn)錄和其DNA 復(fù)制，并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，是一個(gè)多功能調(diào)節(jié)蛋白。

由于核衣殼蛋白、乙肝病毒聚合酶和HBx 蛋白在乙肝病毒復(fù)制過(guò)程中均起重要作用，本文利用分子對(duì)接技術(shù)，將肟類衍生物及苯丙素衍生物同這三種蛋白進(jìn)行對(duì)接，得出其結(jié)合自由能，然后再和實(shí)驗(yàn)值對(duì)比，分析這些化合物在抑制乙肝病毒活性時(shí)的作用靶點(diǎn)，從而對(duì)其抗乙肝病毒的機(jī)理進(jìn)行研究。

1 資料與計(jì)算方法

分子對(duì)接采用的肟及肟類衍生物配體來(lái)自崔新華等的研究文獻(xiàn)，苯丙素衍生物配體來(lái)自Liu 等的研究文獻(xiàn)。用ChemDraw和Chem3D 繪圖軟件畫出配體分子3D 結(jié)構(gòu)，采用MM2力場(chǎng)對(duì)配體的分子構(gòu)象進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，然后將其保存為mol2格式，作為分子對(duì)接的配體。用LeDock 分子對(duì)接軟件進(jìn)行分子對(duì)接。在文獻(xiàn)[2]和[3]中，研究人員分別測(cè)出了化合物對(duì)HBsAg 和HBeAg 活性抑制的IC50值，本研究將其轉(zhuǎn)化為與蛋白質(zhì)的結(jié)合自由能，并將其與分子對(duì)接的計(jì)算值進(jìn)行對(duì)比。

在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org）中下載PDB ID為5E0I 的乙肝病毒核衣殼晶體的結(jié)構(gòu)，如圖1所示。目前尚未解析出乙肝病毒聚合酶的三維結(jié)構(gòu)，本研究利用SWISSMODEL 網(wǎng)站對(duì)其進(jìn)行同源模建。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NBCI）數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢序列號(hào)為BAQ95565.1的乙肝病毒聚合酶的一級(jí)序列，利用BLAST 程序在PDB 庫(kù)中搜索，PDB ID 為6IK9的蛋白質(zhì)與其同源性最高，以該蛋白質(zhì)為模板對(duì)聚合酶進(jìn)行建模，模型結(jié)構(gòu)如圖2所示。HBx 蛋白晶體結(jié)構(gòu)目前也沒(méi)有被解析出來(lái)，在PDB 庫(kù)中沒(méi)有找到與之同源性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目較少（154個(gè)），可以采用從頭預(yù)測(cè)的方法建模。在NBCI 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到HBx 蛋白的序列號(hào)為BAQ95563.1，然后在從頭預(yù)測(cè)網(wǎng)站QUARK 上對(duì)其進(jìn)行建模，其三維結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖1 核衣殼蛋白結(jié)構(gòu)

圖2 聚合酶模型結(jié)構(gòu)

圖3 HBx蛋白模型結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果與討論

本研究通過(guò)分子對(duì)接，計(jì)算出配體與核衣殼蛋白、聚合酶蛋白和HBx 蛋白結(jié)合自由能。將配體抑制HBsAg 和HBeAg活性的IC50值轉(zhuǎn)換，得出配體與靶蛋白結(jié)合自由能實(shí)驗(yàn)值。圖4～圖9 是對(duì)接值與實(shí)驗(yàn)值的對(duì)比。在6 個(gè)圖中，配體與HBx 蛋白結(jié)合自由能的對(duì)接值和HBsAg 實(shí)驗(yàn)值之間數(shù)值比較接近，且變化趨勢(shì)吻合，說(shuō)明二者相關(guān)性較強(qiáng)。

圖4 核衣殼蛋白對(duì)接值和HBsAg實(shí)驗(yàn)值對(duì)比

圖5 核衣殼蛋白對(duì)接值和HBe實(shí)驗(yàn)值對(duì)比

圖6 聚合酶對(duì)接值和HBsAg實(shí)驗(yàn)值對(duì)比

圖7 聚合酶對(duì)接值和HBeAg實(shí)驗(yàn)值對(duì)比

圖8 HBx蛋白對(duì)接值和HBsAg實(shí)驗(yàn)值對(duì)比

圖9 HBx蛋白對(duì)接值與HBeAg實(shí)驗(yàn)值對(duì)比

表1 是對(duì)接值和實(shí)驗(yàn)值之間的均方差。對(duì)于配體與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合自由能，從表中可以看出，以HBx 為靶點(diǎn)得出的對(duì)接值和由HBsAg 半數(shù)抑制濃度IC50值求出的實(shí)驗(yàn)值之間的均方差最小，為2.63kJ2/mol2，這說(shuō)明配體與HBx 之間的對(duì)接值和實(shí)驗(yàn)值最為吻合。

表1 對(duì)接值和實(shí)驗(yàn)值的均方差

從以上結(jié)果可以看出，雖然核衣殼蛋白，乙肝病毒聚合酶以及HBx 蛋白均對(duì)乙肝病毒的復(fù)制過(guò)程有重要作用，但肟類和苯丙素衍生物與之對(duì)接時(shí)，與HBx 蛋白的對(duì)接值在數(shù)值上與實(shí)驗(yàn)值相差最小，對(duì)接結(jié)果變化趨勢(shì)與實(shí)驗(yàn)值變化最為一致，表明HBx 的對(duì)接值與實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)性最強(qiáng)。由此可以推測(cè)，肟類和苯丙素衍生物可能是通過(guò)抑制HBx 蛋白起到抗乙肝病毒作用，其對(duì)HBsAg 抗原活性抑制更明顯。HBx 蛋白通過(guò)多種方式促進(jìn)HBV 的復(fù)制。其通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)通路，促進(jìn)HBV DNA 的復(fù)制和HBV 的逆轉(zhuǎn)錄。該蛋白具有反式激活作用，對(duì)病毒或宿主基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子進(jìn)行反式激活，調(diào)節(jié)HBV 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。HBx 蛋白還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，為病毒創(chuàng)造一個(gè)有利于復(fù)制的內(nèi)環(huán)境。肟類和苯丙素衍生物對(duì)HBx 蛋白具有抑制作用，則從多方面抑制了乙肝病毒的復(fù)制，從而起到抗乙肝病毒的作用。這也為開(kāi)發(fā)抗乙肝病毒藥物提供了新思路。

3 結(jié)束語(yǔ)

乙肝病毒編碼的蛋白中，核衣殼蛋白、乙肝病毒聚合酶和HBx 蛋白在乙肝病毒復(fù)制過(guò)程中有重要作用。本研究采用分子對(duì)接技術(shù)，以肟類和苯丙素衍生物為配體，同三個(gè)蛋白進(jìn)行對(duì)接，并將結(jié)合自由能的對(duì)接值和實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行對(duì)比，分析該化合物抑制乙肝病毒活性的機(jī)理。結(jié)果顯示，以HBx 為靶點(diǎn)的對(duì)接值和HBsAg 的實(shí)驗(yàn)值吻合性較好，其變化趨勢(shì)一致，二者之間的均方差最小，這表明肟類和苯丙素衍生物很可能是通過(guò)抑制HBx 蛋白進(jìn)而抑制乙肝病毒的復(fù)制，顯示出較強(qiáng)的抗乙肝病毒活性，該化合物對(duì)HBsAg 抗原活性的抑制作用更強(qiáng)。