HILPDA 在胃癌中表達(dá)及與腫瘤侵襲遷移的關(guān)系

趙雪峰，譚明，趙一杰，檀碧波

在我國(guó)，胃癌發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤的前列［1］，對(duì)健康危害極大，其主要原因在于約80%的患者就診時(shí)已經(jīng)存在腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移［2］，因此很難達(dá)到根治，這是胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后差的主要原因之一。胃癌進(jìn)展迅速的主要原因在于胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲遷移能力，這種能力使胃癌細(xì)胞易于突破基底膜向機(jī)體的其他部位進(jìn)行遷移，這是導(dǎo)致胃癌轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)［3］。胃癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因、多步驟的過程，由于其過程復(fù)雜。目前，其具體機(jī)制尚不明確。HILPDA 基因也被稱為C7orf68、HIG-2、HIG2 基因，在胰腺癌、肝細(xì)胞肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)明顯增高［4-6］，促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展侵襲，但HILPDA 基因在胃癌中表達(dá)情況及意義尚無報(bào)道。為了解HILPDA 基因在胃癌進(jìn)展中的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)檢測(cè)了HILPDA 基因在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，進(jìn)行了預(yù)后分析，探討了HILPDA基因檢測(cè)的臨床價(jià)值。進(jìn)一步驗(yàn)證HILPDA 基因在胃癌細(xì)胞中的作用，為確定新的胃癌預(yù)后因子及治療新靶點(diǎn)提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 HILPDA 基因在胃癌及癌旁組織中表達(dá)的生物信息學(xué)分析 從TCGA〔GDC（cancer.gov）〕數(shù)據(jù)庫中下載胃癌項(xiàng)目的高通量RNA 測(cè)序（RNA-seq）患者和臨床數(shù)據(jù)。TCGA 收錄胃癌樣本407 例，其中包含腫瘤樣本375 例和癌旁樣本32 例。根據(jù)要求篩選符合條件的樣本：（1）基因表達(dá)量不為0；（2）臨床信息完整。篩選后符合要求的樣本數(shù)為402 例。使用perl 語言對(duì)下載篩選后的TCGA 數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，整理為R 語言可讀取的矩陣文件，利用R 軟件的“l(fā)imma”包對(duì)提取的HILPDA 基因表達(dá)量在癌旁組織和腫瘤樣本的表達(dá)進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用箱線圖顯示HILPDA 基因在癌旁組織和腫瘤樣本中的不同表達(dá)水平。

1.2 HILPDA 基因與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃癌臨床數(shù)據(jù)集。使用R 包“survival”和“survminer”進(jìn)行生存分析。根據(jù)HILPDA 基因的表達(dá)水平中位數(shù)值將胃癌樣本分為兩個(gè)子集，并采用Kaplan-Meier 生存曲線比較相應(yīng)兩子集之間的生存差異。

1.3 HILPDA 在胃癌中GSEA 富集分析結(jié)果 選擇c2.cp.HALLMARK.V7.4.symbols.gmt 作為參考基因集進(jìn)行GSEA 分析。通過分析，發(fā)現(xiàn)了HILPDA 高表達(dá)組和低表達(dá)組之間存在生存差異。將每次分析的隨機(jī)排列次數(shù)設(shè)定為1 000 次。以HILPDA 表達(dá)量作為表型標(biāo)記。通過P值和歸一化富集評(píng)分對(duì)每個(gè)表型中富集的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行排序。在本研究中，基因集合使用了通路富集分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為FDR＜0.25 且P＜0.05，分析結(jié)果使用R 軟件進(jìn)行可視化。

1.4 一般資料 選取2019—2020 年于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行外科手術(shù)的胃癌患者的腫瘤組織及癌旁組織。腫瘤組織取材時(shí)去除標(biāo)本表面壞死潰瘍部分，癌旁組織取材時(shí)遠(yuǎn)離腫瘤上下緣＞3 cm。于標(biāo)本離體后在30 min 內(nèi)盡快取材，標(biāo)本均一式兩份，一份用于實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)，一份用于蛋白印跡（Western blotting）檢測(cè)。取材后先置于液氮中，然后轉(zhuǎn)存于-80 ℃超低溫冰箱中。35 例患者中男25 例，女10 例。患者年齡35～71 歲，平均（54.4±8.9）歲。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）第8 版胃癌分期［7］，Ⅰ～Ⅱ期者17 例，Ⅲ期者18 例（由于Ⅳ期患者無并發(fā)癥時(shí)不建議手術(shù)，本研究未納入IV 期胃癌患者）。

1.5 主要試劑 HILPDA、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、周期素依賴性激酶2（CDK2）、高遷移率族盒蛋白2（HMGB2）及內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物序列由上海吉?jiǎng)P生物公司合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑及逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）試劑盒購自美國(guó)Invirtogen 公司。TaqMan Real-Time PCR 試劑盒為美國(guó)Applied Biosystems 公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)定量PCR 儀（AB-7900 型）購自美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.6 qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)HILPDA、VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 基因的表達(dá) 按說明用TRIzol 從組織中提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green I qPCR試劑盒按操作手冊(cè)說明進(jìn)行定量PCR 反應(yīng)。GAPDH 作為內(nèi)參基因，各基因的表達(dá)強(qiáng)度與GAPDH 進(jìn)行對(duì)比。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，63 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 HILPDA 在胃癌及癌旁組織中表達(dá)差異 對(duì)TCGA最新胃癌數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)HILPDA 在胃癌組織中呈現(xiàn)出明顯高表達(dá)（2.535±0.903），高于癌旁組織表達(dá)（2.225±1.451），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=11.563，P＜0.001），見圖1。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫的胃癌組織及癌旁組織HILPDA 的表達(dá)情況

2.2 HILPDA 表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 HILPDA 低表達(dá)組預(yù)后好于高表達(dá)組（χ2=33.268，P＜0.001），見圖2。從TCGA 官網(wǎng)獲得胃癌數(shù)據(jù)集對(duì)HILPDA 進(jìn)行生存分析，并構(gòu)建了COX 比例風(fēng)險(xiǎn)模型。單因素COX分析顯示，年齡、腫瘤分級(jí)、遠(yuǎn)外轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、stage 分期和HILPDA 高表達(dá)是胃癌的潛在危險(xiǎn)因素。此外，多變量COX 分析證實(shí)，腫瘤分級(jí)、stage 分期和HILPDA 在總生存期中可以獨(dú)立于其他因素預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后（P=0.031）。見圖3。

圖2 HILPDA 表達(dá)與胃癌患者預(yù)后關(guān)系的Kaplan-Meier 結(jié)果

圖3 HILPDA 與胃癌患者預(yù)后關(guān)系的COX 生存分析結(jié)果

2.3 HILPDA 在胃癌中GSEA 富集分析結(jié)果 GSEA 結(jié)果顯示，HILPDA 高表達(dá)組中存在乏氧、DNA 修復(fù)、凋亡、P53 等通路的基因富集。其中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 等基因與HILPDA 存在共表達(dá)，可能在HILPDA 的調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用。見圖4。

圖4 HILPDA 高表達(dá)組GSEA 富集分析結(jié)果

2.4 臨床組織中HILPDA mRNA 的表達(dá)水平 胃癌組織中HILPDA 表達(dá)水平為（0.331 4±0.066 0），在癌旁組織中表達(dá)水平為（0.243 0±0.098 2），胃癌組織中HILPDA 表達(dá)比癌旁組織增高（t=-4.420，P＜0.001）。胃癌組織中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 的mRNA表達(dá)水平為（0.423 6±0.170 2）（1.013 9±0.305 8）（0.901 9±0.330 5）（1.325 6±0.319 4），在癌旁組織中表達(dá)水平為（0.196 0±0.101 5）（0.342 0±0.138 7）（0.576 8±0.181 9）（0.473 2±0.179 1），胃癌組織中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 的mRNA 表達(dá)均比癌旁組織增強(qiáng)（t=6.795，P＜0.001；t=11.838，P＜0.001；t=5.098，P＜0.001；t=13.771，P＜0.001）。

2.5 胃癌組織中HILPDA 表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 HILPDA 表達(dá)水平與胃癌組織的患者臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（均P＜0.05）。在臨床分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中HILPDA 表達(dá)更高。結(jié)果還顯示，HILPDA 表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、分化程度等無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。

表1 胃癌組織中HILPDA 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系（）

2.6 胃癌組織中HILPDA 與VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 的mRNA 表達(dá)的相關(guān)性 Spearman 相關(guān)分析顯示，HILPDA 與VEGFA、PCNA、CDK2 均存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.396，P=0.019；r=0.462，P=0.005；r=0.548，P＜0.001），HILPDA 與HMGB2 未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性（r=0.220，P=0.205）。

3 討論

胃癌易于進(jìn)展轉(zhuǎn)移，臨床大部分胃癌患者就診時(shí)處于進(jìn)展期，這是胃癌患者治療效果差、預(yù)后差的重要原因［8］。隨著近年來靶向治療的進(jìn)展，胃癌也有了針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）陽性腫瘤的靶向藥物曲妥珠單抗，并取得了較好的治療效果［9］。但HER-2在胃癌中的陽性率僅有10%～15%［10］，因此大部分胃癌患者還不能從靶向治療中獲益。因此，需找新的與胃癌進(jìn)展相關(guān)的基因具有重要價(jià)值。隨著近年來生物信息學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，研究者可以通過軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而探討目的基因的臨床意義和相關(guān)機(jī)制［11］。HILPDA 是一種與乏氧狀態(tài)下脂代謝調(diào)控有關(guān)的基因，其作用機(jī)制尚不完全明確，但該基因在胰腺癌、肝細(xì)胞肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)［4-6］，具有原癌基因特征。HILPDA 基因在胃癌中表達(dá)及意義報(bào)道還很少見。本研究首先對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的胃癌相關(guān)數(shù)據(jù)及差異基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)HILPDA 在胃癌腫瘤中表達(dá)明顯比癌旁組織增強(qiáng)，且HILPDA 高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后差的標(biāo)志。其后筆者又收集了于本研究中心手術(shù)的35 例胃癌及癌旁組織，檢測(cè)了組織中HILPDA 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中HILPDA 表達(dá)水平比癌旁組織增高，與生物信息學(xué)結(jié)果符合。由于組織收集時(shí)間較短，無法確定HILPDA 的預(yù)后價(jià)值，故分析了HILPDA 表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HILPDA 在臨床分期晚、有淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)水平更高，這也提示HILPDA在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。

為初步了解HILPDA 基因在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用GSEA 基因富集分析探討了HILPDA 高表達(dá)組相關(guān)的通路和基因。GSEA 是一種針對(duì)全基因組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的分析方法，將目的基因與預(yù)定義的基因集進(jìn)行比較［12］，從而發(fā)現(xiàn)可能與目的基因有關(guān)的通路和基因。本研究應(yīng)用R 軟件對(duì)胃癌HILPDA 基因的調(diào)控進(jìn)行了GSEA 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HILPDA 高表達(dá)組中存在乏氧、DNA 修復(fù)、凋亡、P53 等通路的基因富集，通路中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 等基因與HILPDA 存在共表達(dá)。VEGFA 是調(diào)控血管生成的重要基因，在惡性腫瘤的血管生成中發(fā)揮了重要作用［13］。PCNA 主要反映腫瘤的增殖狀態(tài)，在腫瘤中高表達(dá)［14］。CDK2 基因是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的催化亞基，可以促進(jìn)細(xì)胞由靜止期向分裂期的轉(zhuǎn)變［15］。HMGB2 基因是高遷移族蛋白家族成員之一，具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力［16］。這4 種基因均為原癌基因，出現(xiàn)在HILPDA 高表達(dá)組提示HILPDA 基因在促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲方面可能發(fā)揮了作用。筆者收集的胃癌標(biāo)本中HILPDA 與VEGFA、PCNA、CDK2 存在正相關(guān)，驗(yàn)證了生物信息學(xué)的研究結(jié)果。但本研究發(fā)現(xiàn)HILPDA與HMGB2 基因無明顯相關(guān)性，這可能與數(shù)據(jù)來源、數(shù)據(jù)樣本量不同有關(guān)，具體情況還需要進(jìn)一步深入分析。