象甲科昆蟲轉錄組研究進展

楊紅軍，徐丹萍，胡佳萌，卓志航, 3*，陳 彧

1 西華師范大學生命科學學院, 四川 南充 637002; 2 海南大學林學院, 海南 ?？?570228; 3 農業(yè)部華南作物有害生物綜合治理重點實驗室, 廣東 廣州 510642; 4 海南省林業(yè)科學研究院(海南省紅樹林研究院), 海南 ?？?571100

象甲科Curculionidae是鞘翅目Coleoptera中最大的科，也是動物界中物種數量最豐富的科，目前全世界記錄有超過5萬種象甲科昆蟲，其中我國超過1200種(楊毅等，2012)。然而，象甲科昆蟲作為害蟲時，由于其具有鉆蛀性、隱蔽性等特點，防治效果往往不佳(李成教，2013)。隨著高通量測序平臺的發(fā)展，獲取細胞過程的生物學視角已成為現實，通過轉錄組測序分析，可以有效地識別生物中特定時空的基因表達模式(Ozsolak & Milos，2011)。目前，二代高通量測序分析已廣泛應用于昆蟲學研究，如揭示各種生物學現象、基因挖掘以及基因表達譜構建等(許佳丹等，2019)。此外，轉錄組也常用于識別RNA干擾(RNA interference)目標，進而為害蟲控制提供策略(Wangetal.，2011)。綜上，通過對象甲科昆蟲轉錄組數據的深入剖析，準確鑒定相關靶向基因，可在理論上為象甲科昆蟲免疫、生長發(fā)育、抗藥性等方面的研究奠定分子生物學基礎，進而為探究昆蟲轉錄組在害蟲防治中的作用提供新思路。

本文通過對象甲科昆蟲轉錄組的淺析，旨在探索細胞表達與調控之間的聯系，為進一步揭示象甲科昆蟲的遺傳發(fā)育、免疫、潛在RNA干擾靶點篩選等方面提供參考依據，也為害蟲分子生物學研究和防治提供新的策略與思路。

1 象甲科昆蟲轉錄組研究概述

基于轉錄組測序技術的飛速發(fā)展，非模式生物的基因挖掘速度和效率顯著提高。許多與昆蟲組織(Keelingetal.，2016)和殺蟲劑相關的基因(如殺蟲劑靶標、解毒酶和代謝)(Heetal.，2012; Zimmeretal.，2014)已在多種象甲科昆蟲中通過高通量測序進行了鑒定。轉錄組還可用于推斷與象甲科昆蟲機體發(fā)育及其他進化過程相關的信息。Keelingetal.(2013a)首次對象甲科昆蟲山松甲蟲DendroctonusponderosaeHopkins進行了基因組報道，此項研究給其他象甲科物種轉錄組測序提供了依據。之后,轉錄組學在象甲科多個方面均取得一些重要進展，但主要集中在生長發(fā)育差異、觸角分析、與植物互作、昆蟲防治、進化、RNAi、免疫7個方面，測序平臺主要涉及Illumina HiSeq 2000、羅氏454 FLX Titanium以及PacBio Iso-Seq等。

2 轉錄組在象甲科昆蟲上的應用

2.1 象甲科昆蟲不同發(fā)育階段基因的差異分析

深入了解調節(jié)象甲科昆蟲生命周期和發(fā)育各階段的分子機制，將有助于開發(fā)更容易獲得和環(huán)境相契合的方法來控制害蟲。轉錄測序結果將為多種象甲科害蟲的研究提供豐富的分子資源，并為理解象甲科昆蟲發(fā)育過程中基因表達水平的變化提供框架，同時，該轉錄數據也將闡明昆蟲發(fā)育的分子機理。如，Yangetal.(2020)首次利用PacBio Iso-Seq和Illumina RNA-seq對紅棕象甲Rhynchophorusferrugineus(Oliver)的3個發(fā)育階段(蛹、幼蟲、雌性和雄性成蟲)進行轉錄組測序，共生成63801個非冗余的全長轉錄本，平均長度2964 bp。Wangetal.(2012)利用Roche/454 GS FLX平臺捕獲了紅棕象甲不同發(fā)育階段的500萬條測序reads，同時經基因表達分析顯示，蛹期表達量最高，幼蟲期表達量最低。此外，該研究還鑒定了超過60000個單核苷酸多態(tài)性和1200個簡單序列重復標記。Yinetal.(2015)對紅棕象甲的胚胎發(fā)生系統(tǒng)轉錄組進行了研究，報道了該蟲5個發(fā)育階段的轉錄組，包括4個胚胎階段和1個幼蟲階段，共收集了22532個在不同胚胎階段表達的基因；該研究還分析了幾種保守信號通路(如Hedgehog、JAK-STAT、Notch、TGF-、Ras/MAPK和Wnt)的表達動態(tài)，以及與細胞凋亡、神經發(fā)生和分割相關的關鍵發(fā)育基因。另外，Antonyetal.(2017)通過分析紅棕象甲腸道特異性和不同發(fā)育階段的特異性差異表達，發(fā)現紅棕象甲在成蟲期纖維素酶和果膠酶顯著上調，半纖維素酶RferGH16c4170特異性高表達，表明紅棕象甲的植物細胞壁降解酶的潛力較大。

此外，通過轉錄組學來篩選不同發(fā)育階段的表達基因，有助于研究和挖掘昆蟲免疫及應激反應的關鍵基因。Liu & Wen(2016)利用Roche 454 FLX Titanium平臺獲得不同發(fā)育階段的溝眶象Eucryptorrhynchuschinensis(Oliver)(卵、幼蟲、蛹和成蟲)轉錄組數據，預測了294條涉及生長、繁殖和應激或免疫反應的生化途徑，并檢測到659026個單核苷酸變異、6112個簡單重復序列。Yangetal.(2017)通過構建長足大竹象CyrtotrachelusbuquetiGuer從卵、幼蟲、蛹和成蟲的發(fā)育轉錄組，獲得了高質量的綜合序列資源。此外，為了評估了長足大竹象降解竹子木質纖維素的能力，探索該蟲利用竹子生物量的潛在途徑，Luoetal.(2018)通過轉錄組研究，認為長足大竹象碳水化合物活性酶家族基因在不同發(fā)育階段的表達存在差異。相關研究還表明，長足大竹象成蟲對纖維素降解更有效，幼蟲對木質素降解更有效，并且降解能力在腸道的不同部位也存在差異，中腸對纖維素的降解作用強于后腸，且長足大竹象的腸內消化酶在體內和體外均可降解竹筍木質纖維素(Luoetal.，2018，2019)。Noriegaetal.(2019)通過Illumina Hiseq平臺對咖啡果小蠹Hypothenemushampei(Ferrari)2個發(fā)育階段(幼蟲、雌性和雄性成蟲)轉錄組進行測序并重新組裝，發(fā)現在不同發(fā)育階段中4664個轉錄本呈現差異表達。另外，Panditaetal.(2018)通過轉錄組測序方法，鑒定了大松象甲HylobiusabietisL.編碼神經肽、肽激素以及推定的G蛋白偶聯受體(GPCR)的基因，進一步闡述了神經肽調節(jié)的過程。綜上，隨著測序技術的發(fā)展，昆蟲轉錄組學的研究取得極大進步，為全方位揭示昆蟲學相關研究提供了技術支撐。通過轉錄組技術對不同發(fā)育階段象甲科昆蟲基因表達水平的評估，將為象甲科昆蟲生長發(fā)育的研究提供分子基礎。

2.2 象甲科昆蟲觸角轉錄組分析

象甲科昆蟲觸角是感受外界環(huán)境的重要器官，能夠感知信息素、二氧化碳及水分等環(huán)境因子，而象甲通過識別不同環(huán)境因子，進一步產生取食、交配、產卵等行為。近幾年，轉錄組在象甲科昆蟲觸角的研究發(fā)展迅速，這對昆蟲化學生態(tài)學及行為學等研究有重要意義。例如，Anderssonetal.(2013)通過對云杉樹皮甲蟲IpstypographusL.與山松甲蟲的觸角進行轉錄組測序，發(fā)現了與嗅覺功能相關的轉錄本；針對化學感覺基因家族，從云杉樹皮甲蟲中鑒定了15個氣味結合蛋白(odorant binding proteins，OBP)、6個化學感覺蛋白(chemosensory proteins，CSP)、6個味覺受體(gustatory receptors，GR)、3個感覺神經元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins，SNMP)、7個離子性受體(ionotropic receptors，IR)和43個氣味受體(odorant receptors，OR)；在山松甲蟲中鑒定了31個OBPs、11個CSPs、3個SNMPs、49個ORs、2個GRs、15個IRs。Keelingetal.(2013b)分析了山松甲蟲觸角的細胞色素P450(cytochrome P450)DponCYP345E2轉錄本功能表征，結果表明，細胞色素P450在山松甲蟲嗅覺、萜烯解毒和信息素生物合成中發(fā)揮作用。Chiuetal.(2018)在山松甲蟲觸角轉錄組中也發(fā)現了大量的P450，且對雌性和雄性山松甲蟲不同生命階段和組織的轉錄水平分析顯示，P450s在中腸或脂肪體中有額外表達。更重要的是，山松甲蟲可以使用P450s來解毒松樹防御系統(tǒng)中的其他單萜烯(Chiuetal.，2019)。與此同時，陸續(xù)分析了大量象甲科昆蟲觸角轉錄組，如紅棕象甲(Yanetal.，2015)、紅脂大小蠹DendroctonusvalensLeConte(Guetal.，2015)、稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusKuschel(Yuanetal.，2016；Zhangetal.，2019)、甘薯象蟲CylasformicariusFabr.(Binetal.，2017)、玉米象甲Sitophiluszeamais(Motchulsky)(Tangetal.，2019a，2019b)、棉鈴象甲AnthonomusgrandisBoheman(Paulaetal.，2018)等。綜上，對象甲科昆蟲觸角轉錄組的分析將會發(fā)掘大量的具有潛在應用價值的基因，特別是氣味識別、傳導及降解相關的基因，這些基因將為象甲科觸角基因功能的研究奠定基礎。

2.3 象甲科昆蟲與植物互作的研究

由于寄主植物通常具有多種防御機制，象甲科昆蟲對寄主的選擇和隨后的成功定殖充滿了不確定性。寄主植物通常含有大量潛在毒性的特殊代謝物，象甲科昆蟲必須忍受這些代謝物或具有解毒能力才能成功生存和繁殖(Keeling & Bohlmann,2006)，而轉錄組基因表達分析(RNA-seq)能夠有效解釋象甲科昆蟲的解毒機理以及寄主植物的免疫應答機制。Robertetal.(2013)鑒定了山松甲蟲在寄主定殖早期與其解毒有關的轉錄本，該研究表明，在以寄主組織為食的昆蟲中，發(fā)揮潛在解毒作用的轉錄本為醇脫氫酶。Pittetal.(2014)建立了山松甲蟲在寄主定殖的蛋白質組圖譜，并在對雌蟲與雄蟲進行蛋白質組監(jiān)測過程中發(fā)現雌蟲發(fā)生了重大且快速的生理變化，該變化在伴隨蛋白(chaperone proteins)、細胞色素P450和谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase)具有大量積累，表明次級代謝物誘導的應激生理與早期寄主定殖過程中的化學排毒有關；該研究還發(fā)現，山松甲蟲雌蟲只有在遇到宿主后才激活卵黃蛋白原，這一現象表明資源的分配和分散與繁殖相關。雖然山松甲蟲的信息素生物合成途徑所涉及的酶還沒有全部被識別或鑒定出來，但Nadeauetal.(2017)通過轉錄組已經鑒定了一種細胞色素P450單加氧酶CYP6DE3，并確定了其功能特征是參與樹脂解毒而非信息素生物合成。

植物在受到昆蟲危害后，會改變其防御相關基因的轉錄表達水平。如Articoetal.(2014)利用Illumina HiSeq 2000平臺對受棉鈴象甲幼蟲感染的棉花轉錄組進行測序，結果表明，大量棉花的轉錄本在幼蟲取食后發(fā)生顯著改變，且在基因表達的變化中，該研究識別了幾丁質或昆蟲口腔分泌物的受體/傳感器的轉錄本，同時轉錄因子Ca2+和活性氧有關以及編碼植物激素信號通路的酶轉錄物調控發(fā)生了改變。Giovinoetal.(2015)通過轉錄組分析了紅棕象甲對加拿利海棗PhoenixcanariensisChabaud攻擊的基因調控網絡，該研究發(fā)現，在攻擊的中間階段共有54個基因發(fā)生顯著變化，且途徑富集分析表明，此階段誘導了與苯丙烷相關的途徑；而在攻擊后期，超過3300個基因受到了影響，其中脂質脂肪酸代謝(脂肪酸和甘油脂)、色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝的轉錄本豐度更高。綜上，轉錄組在象甲科昆蟲與植物互作方面，特別是解毒機理與代謝機制的研究，將為象甲科昆蟲的可持續(xù)治理提供參考依據。

2.4 象甲科昆蟲防治的研究

為了更好地了解異源化合物的殺蟲機理，轉錄組技術廣泛運用于殺蟲劑施用對象甲科昆蟲酶活性影響的研究(Francisetal.，2010)。此外，相關研究也證實，象甲科昆蟲基因表達的轉錄調控在各種應激源中起重要作用(Chenetal.，2016)。例如，Liaoetal.(2016)通過分析互生葉白千層MelaleucaalternifoliaL.葉油處理后的玉米象甲Sitophilusoryzae(L.)轉錄組數據，共鑒定出3562個差異表達基因，其中大部分的差異表達基因參與了殺蟲劑解毒和線粒體功能，這為開發(fā)新型且對環(huán)境友好的植物精油害蟲熏蒸劑奠定了良好的基礎。Zhangetal.(2017)利用異硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate)熏蒸玉米象甲，通過轉錄組測定并分析差異基因表達，結果表明,細胞骨架崩潰和線粒體功能障礙是異硫氰酸烯丙酯的重要致死機制。Huangetal.(2018)使用RNA-seq方法評估了二烯醇(terpmen-4-ol)熏蒸玉米象甲的整體基因表達情況，結果表明,玉米象甲解毒基因尤其是P450s的表達水平發(fā)生了改變，這為研究象甲科昆蟲對二烯醇的全身代謝反應提供了候選基因。綜上，利用轉錄組技術對象甲科昆蟲的防治研究將為其生態(tài)可持續(xù)防治提供新思路。

2.5 象甲科昆蟲免疫機制的研究

為適應外界環(huán)境，節(jié)肢動物(如昆蟲)已進化出多種解毒機制，進而減少病原對個體的毒性作用，從而達到免疫的目的(蒲宇辰等,2017)。在轉錄組水平上加強對象甲科昆蟲和外源刺激之間免疫相互作用的研究，將為今后的昆蟲學研究提供豐富的免疫遺傳學信息。Xuetal.(2018)通過鑒定紅脂大小蠹在不同病原菌下的基因表達差異，發(fā)現球孢白僵菌Beauveriabassiana比吐溫菌Leptographiumprocerum(Kendr)能有效地殺滅大多數供試幼蟲，研究還表明，昆蟲病原真菌能在轉錄組水平上比共生真菌引起更強的響應；同時，該研究還鑒定了185個免疫相關基因，包括模式識別受體、信號調節(jié)因子、免疫通路成員(Toll、IMD和JAK/STAT)和免疫效應因子等。轉錄組與生理實驗相結合的研究證實，與無菌環(huán)境的昆蟲相比，傳統(tǒng)飼養(yǎng)的昆蟲具有更強的抗菌活性和更高的酚氧化酶活性，說明無菌昆蟲的系統(tǒng)免疫應答明顯受損，相關研究結果還揭示了腸道共生菌對紅棕象甲幼蟲具有更強的免疫刺激作用(Muhammadetal.，2019)。Valenciaetal.(2016)通過羅氏454測序法對香蕉象甲Cosmopolitessordidus(Germar)幼蟲中腸進行了轉錄組測定，確定了可能涉及免疫相關功能和殺蟲劑抗性的基因。由于先天免疫反應是害蟲對抗病原體的唯一途徑，利用腸道菌群影響宿主免疫被認為是一種很有前途的害蟲防控策略(Muhammadetal.，2019)。在全球環(huán)境變化的情形下，轉錄組測序技術能夠高效且經濟地研究昆蟲種群變化及其對農業(yè)的破壞情況(Clarketal.，2001)。低溫致死是象甲科昆蟲通過免疫調控種群數量的一個重要方面，而轉錄組在其中的應用頗為廣泛。Robertetal.(2016)分別對山松甲蟲幼蟲越冬的早秋、晚秋、早春、晚春4個時間點的基因表達規(guī)律進行了轉錄研究，結果表明，隨著冬季轉錄譜的變化，幼蟲產生了多種生理反應，其主要特征是在秋季參與昆蟲免疫反應和解毒的基因轉錄。

象甲科昆蟲分泌外部免疫物的轉錄組的遺傳和分子機制也有大量的研究。例如，Puetal.(2020)根據轉錄組數據篩選了紅棕象甲苯醌合成所需的基因，分離了3個新的ARSB基因，即RfARSB-0311、RfARSB-11581和RfARSB-14322，通過組織/器官特異性表達譜分析，證實ARSB基因家族可以通過參與醌的生物合成來調節(jié)對苯醌的分泌量，從而改變宿主的外部免疫抑制效率。Gagnonetal.(2019)通過轉錄組評估了不同生命階段的胡蘿卜象甲Listronotusoregonensis(LeConte)感染寄生線蟲Bradynemalistronoti后繁殖力和死亡率的變化，發(fā)現幼蟲更易受感染，且被感染的雌性胡蘿卜象甲的繁殖力顯著降低，其原因可能是生殖激素的產生被抑制。綜上，象甲科昆蟲免疫機制的研究，將改善甚至推動新的象甲科昆蟲控制策略。

2.6 象甲科昆蟲進化的應用

轉錄組測序能夠獲得多個基因片段數據并且可以消除單基因信息不足的劣勢，利用該優(yōu)勢能重現昆蟲的進化史并且提供其系統(tǒng)發(fā)育關系的可靠信息(Zouetal.，2008)。此外，植物細胞壁是地球上最大的有機碳貯存庫，為了充分和有效地利用這一富含碳水化合物的巨大資源，微生物進化出了先進酶解系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以分泌以果膠、纖維素和半纖維素為靶點的植物細胞壁降解酶，而象甲科昆蟲在進化方面也有類似的系統(tǒng)。例如，Royetal.(2014)利用轉錄組對10種葉甲總科和象甲科的甲蟲進行測序，結果表明，葉甲總科和象甲科均有一個大家族的PG編碼基因共享一個共同的祖先，最類似于子囊菌真菌的PG基因；此外，該研究還鑒定了象甲科甲蟲消化系統(tǒng)的50個PG，證實了象甲科昆蟲具有一套特異性連續(xù)的果膠降解酶以及保守但酶活性不高的PG蛋白。研究還發(fā)現，一些食草昆蟲的基因組也可以編碼植物細胞壁降解酶。Neupertetal.(2018)則通過轉錄組學和多肽組學技術，分析了大黑甲Zophobasatratus(Fabricius)和棉鈴象甲中的基因產物，結果表明，即使在具有代表性的一組鞘翅目昆蟲中，神經肽能系統(tǒng)也發(fā)生了截然不同的進化過程。綜上，轉錄組在象甲科昆蟲進化研究中的應用將為研究其進化與起源提供豐富的數據資源。

2.7 象甲科基因沉默的應用

“轉錄組學”不僅是研究昆蟲的分子、遺傳和細胞的重要工具，也是鑒定和選擇RNAi目標基因的重要工具(Zhangetal.，2017a)。如，高特異性RNAi機制顯示出對鞘翅目害蟲管理的良好效果(Zhangetal.，2017b)。Garciaetal.(2017)在棉鈴象甲的轉錄組中鑒定了3種核酸酶(AgraNuc1、AgraNuc2和AgraNuc3)，并評估了這些核酸酶對幾丁質合成酶II(AgraChSII)基因沉默的影響，結果證實，這些核酸酶主要在后中腸區(qū)表達，而棉鈴象甲中腸核酸酶是雙鏈核糖核酸dsRNA傳遞的主要障礙之一，因此需要開發(fā)新的RNAi傳遞策略，保護dsRNA不受腸道核酸酶的影響，進而有效控制棉鈴象甲。相關研究也表明，將幾丁質合酶基因(AntgCHS1)用dsRNA微注射到棉鈴象甲雌成蟲體內，會導致卵無法存活和后代幼蟲畸形(Firminoetal.，2013)。另外，通過構建OBPs文庫，選擇具有特異性的高表達OBPs，通過RNAi進行沉默，也能達到生態(tài)防治象甲科昆蟲的目的。Antonyetal.(2018)發(fā)現，特異性RferOBP1768有助于紅棕象甲捕獲和轉運氣味受體，當負責信息素結合的RferOBP1768被沉默后，信息素的交流將中斷。Hassanetal.(2016)以不同的dsRNA敲除了紅棕象甲5齡和10齡幼蟲的過氧化氫酶基因，結果紅棕象甲幼蟲的死亡率顯著提高并且生長受到抑制。Francescaetal.(2017)通過沉默紅棕象甲3種基因(α-淀粉酶、V-ATPase、蛻皮激素受體)評估死亡率，結果表明，α-淀粉酶和蛻皮激素受體基因更具開發(fā)RNAi靶標的潛力，即顯著的害蟲死亡率和幼蟲生長抑制作用突顯了使用該技術對紅棕象甲種群控制的可能性。綜上，轉錄組在象甲科基因沉默研究中的應用將為作物保護提供新的思路。

3 展望

盡管象甲科昆蟲轉錄組研究已取得了較多進展，但明確象甲科昆蟲與植物互作的機理、免疫機制等仍需要更深入的研究。因此，基于現有象甲科昆蟲的研究現狀及其防治要求，今后象甲科昆蟲轉錄組研究中的熱點和難點可能體現在以下幾個方面：(1)在基因組和轉錄組資源的開發(fā)過程中，可以利用第三代測序平臺捕獲全長轉錄組；與第二代測序平臺轉錄組相比，全長的轉錄本可以極大提高基因組注釋和轉錄組表征的準確性(Dongetal.，2015)。同時，第三代測序技術具有準確性高、序列讀取長、偏差程度低等優(yōu)勢(Robertsetal.，2013)，該優(yōu)勢將為象甲科昆蟲的分子生物學研究提供更可靠的數據支撐。(2)加強多組學間結合(如基因組、代謝組、蛋白組等)，利用多組學對象甲科昆蟲進行更全面和更深層次的研究，多組學的結合對基因功能研究更準確、更快速，如利用RNA干擾技術與CRISPR-Cas9介導的基因組定點編輯技術相結合，將為害蟲的高效防治提供更新、更有效的思路(侯麗等，2017)。(3)對象甲科昆蟲開展非編碼 RNA的研究，該研究方向已成為昆蟲毒理學研究的一個新興領域(朱斌等，2016)。與此同時，非編碼 RNA作為表觀遺傳學調控的新機制是細胞內一種內源的控制因子，能行使多重功能(薛娟，2012)。隨著轉錄技術的發(fā)展，未來昆蟲學在轉錄組的研究將會進入更新更全面的階段，該階段將致力于探究和解決更多更重要的科學問題，這些問題將不局限于基因的表達豐度與動態(tài)變化，而是更多地涉及基因功能及其作用機理，進而為昆蟲遺傳發(fā)育、免疫、潛在RNA干擾靶點篩選等的研究提供參考依據。