復(fù)合酶解蛋白質(zhì)工藝在食品工業(yè)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

許新月，李昶，崔文玉，弓志青，王延圣，王文亮

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所（濟(jì)南 250100）

復(fù)合酶水解工藝是指根據(jù)不同酶的水解特性，針對(duì)不同底物進(jìn)行特異性選擇，將大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)換為活性小分子的過(guò)程。目前復(fù)合酶水解工藝已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多糖、纖維素等物質(zhì)的水解過(guò)程中，得到的小分子物質(zhì)在抗氧化、降血壓和提高機(jī)體免疫力等方面功效顯著。同時(shí)，利用復(fù)合酶水解技術(shù)開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品以及改善傳統(tǒng)加工工藝也是食品工業(yè)發(fā)展的方向之一。復(fù)合酶解蛋白質(zhì)制備小分子活性肽是當(dāng)前一大研究熱點(diǎn)，利用該技術(shù)可以進(jìn)一步豐富功能性活性物質(zhì)種類(lèi)庫(kù)，提高工業(yè)生產(chǎn)效率，減少?gòu)U棄物資源浪費(fèi)。介紹了復(fù)合酶水解蛋白質(zhì)工藝在動(dòng)物、植物、藻類(lèi)等不同來(lái)源蛋白質(zhì)加工中的應(yīng)用，綜述了該技術(shù)在國(guó)內(nèi)外食品工業(yè)中的研究進(jìn)展，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了論述。

1 復(fù)合酶水解在動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)中的應(yīng)用

目前復(fù)合酶解的方法已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織蛋白質(zhì)的生產(chǎn)加工，在制備抗氧化肽以及其他生物活性肽方面效果明顯。

1.1 畜牧類(lèi)

羊骨中含有大量的膠原蛋白，普通加工方式膠原蛋白水解率低，造成不必要的浪費(fèi)。酶水解羊骨粉，水解度大、多肽得率高，適合羊骨粉深加工生產(chǎn)。王鈺慧等[1]以羊骨粉作為原料，通過(guò)復(fù)合蛋白酶以及風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行雙酶水解，同時(shí)比較了同步水解和順序水解的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同步水解的多肽生成量和短肽得率明顯高于單酶水解和順序水解，最高為87.13 mg/g和57.24%。

將動(dòng)物腦組織進(jìn)行水解，得到的腦蛋白水解物在系統(tǒng)發(fā)育、生理功能的維持以及神經(jīng)損傷的恢復(fù)中都具有重要的作用。劉守峰等[2]以雞腦為原料制作雞腦蛋白粉，使用中性蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)雞腦蛋白質(zhì)進(jìn)行分步雙酶水解，肽得率為70.38%，效果顯著。

卵黃高磷蛋白磷酸肽能夠促進(jìn)人體對(duì)鈣、鐵、鋅等金屬元素的吸收，蛋黃是卵黃高磷蛋白磷酸肽的優(yōu)質(zhì)來(lái)源，徐彩娜等[3]以蛋黃粗蛋白為原料，利用多種酶單酶水解與雙酶水解的方式提取卵黃高磷蛋白磷酸肽。選擇胰蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase酶，經(jīng)過(guò)單酶水解與雙酶水解進(jìn)行比較，最佳酶組合方式是胰蛋白酶與Alcalase酶分步水解，經(jīng)過(guò)水解蛋黃粗蛋白水解率最高，為18.12%。蛋清是食品中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源，水解后產(chǎn)生抗氧化活性肽。Yuan等[4]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了胰凝乳蛋白酶與胃蛋白酶水解乳清蛋白制備抗氧化肽的水解條件。通過(guò)氧化損傷模型和IgE結(jié)合能力，分別對(duì)所制備的肽的抗氧化活性和潛在致敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)。超濾后，乳清蛋白肽的抗氧化活性為30.86 μmol AAE/g DW，且具有較低的致敏性。該方法經(jīng)濟(jì)有效，可用于工業(yè)生產(chǎn)抗氧化肽。

1.2 海洋動(dòng)物類(lèi)

刺參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、脂肪含量少，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源。隨著刺參加工行業(yè)的發(fā)展，刺參內(nèi)臟利用率低，產(chǎn)生大量刺參內(nèi)臟廢料。閆鳴艷等[5]以廢棄刺參內(nèi)臟為原料，提取刺參內(nèi)臟蛋白質(zhì)，利用菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)內(nèi)臟蛋白進(jìn)行同步酶解，測(cè)試取得的水解蛋白抗氧化活性。雙酶水解后的刺參內(nèi)臟蛋白清自由基清除率為49.65%，超氧陰離子自由基清除率為52.66%，抗氧化活性明顯。

海洋中豐富的動(dòng)物資源提供了大量的功能活性物質(zhì)，研究人員通過(guò)利用復(fù)合酶水解的方法對(duì)海洋動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，得到了各種各樣的生物活性物質(zhì)，應(yīng)用于各個(gè)方面的研究。王欣等[6]通過(guò)利用1%的中性蛋白酶以及0.1%的木瓜蛋白酶對(duì)直接打漿的哈氏仿對(duì)蝦進(jìn)行酶解，促進(jìn)海洋蛋白水解成小分子咸味肽來(lái)提高咸度。在酶解過(guò)程中定時(shí)取樣進(jìn)行感官評(píng)定，測(cè)定其咸度同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果表明，雙酶水解有效提高了咸度，通過(guò)雙酶水解海洋蛋白提高咸度的方法能夠促進(jìn)開(kāi)發(fā)適合心血管疾病病人的無(wú)鈉調(diào)味劑。

鄧尚貴[7]以青鱗魚(yú)為原料提取得到青鱗魚(yú)蛋白，利用木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶對(duì)青鱗魚(yú)蛋白進(jìn)行復(fù)合酶解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著時(shí)間增加，蛋白水解度增加。青鱗魚(yú)蛋白水解產(chǎn)物在小鼠實(shí)驗(yàn)輔助治療骨質(zhì)疏松過(guò)程中與單一利用雌激素替代療法治療骨質(zhì)疏松相比有著明顯優(yōu)勢(shì)，超濾后的青鱗魚(yú)蛋白水解產(chǎn)物和傳統(tǒng)治療骨質(zhì)疏松的己烯雌酚同時(shí)使用，可降低單一用藥對(duì)小鼠子宮的刺激作用，治療效果明顯。

丁樹(shù)慧等[8]以脫脂海洋魚(yú)粉為原料，通過(guò)中性蛋白酶與堿性蛋白酶進(jìn)行雙酶水解，得到脫脂海洋魚(yú)粉低聚肽。并且通過(guò)響應(yīng)面分析的方法得到雙酶水解的最優(yōu)條件，水解度最高可達(dá)41.84%，有效提高了低聚肽的產(chǎn)量。

膠原蛋白因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，不易被人體消化吸收，將膠原蛋白進(jìn)行酶解后生成小分子的膠原蛋白肽，具有人體易吸收的特點(diǎn)，對(duì)降血壓、抗腫瘤、促進(jìn)皮膚膠原代謝具有明顯效果。隨著我國(guó)水產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，許多廢料被產(chǎn)生，魷魚(yú)加工中產(chǎn)生的魷魚(yú)皮廢料是理想的膠原蛋白肽來(lái)源。劉振峰等[9]以魷魚(yú)皮作為原料，使用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行雙酶分步水解。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)雙酶分步水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)水解度為24.32%，DPPH清除率為90.34%，多肽轉(zhuǎn)化率為58.68%。該方法為廢棄?mèng)滛~(yú)皮的利用提供了理論依據(jù)，同時(shí)為魷魚(yú)皮膠原蛋白肽的進(jìn)一步分離純化具有較高的指導(dǎo)意義。

1.3 昆蟲(chóng)類(lèi)

黃粉蟲(chóng)作為一種較為常見(jiàn)的昆蟲(chóng)，是優(yōu)質(zhì)的蛋白來(lái)源。蟲(chóng)體中含有豐富的氨基酸，其中人體必需氨基酸達(dá)到氨基酸總量的39.14%。研究人員在黃粉蟲(chóng)水解蛋白方面進(jìn)行了大量的研究。張莎莉等[10]利用胰蛋白酶和堿性蛋白酶Alcalase對(duì)黃粉蟲(chóng)進(jìn)行雙酶同步水解，并且對(duì)雙酶水解過(guò)程中各個(gè)影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)后進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，使用優(yōu)化后的條件，水解度最高為21.61%，為黃粉蟲(chóng)的深加工提供了依據(jù)。何桂梅等[11]在張莉莎研究的基礎(chǔ)上使用堿性蛋白酶和胰蛋白酶，對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的水溶性蛋白進(jìn)行水解，對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)以確定最佳水解條件，制備抗氧化肽。其羥自由基清除率最高達(dá)85.46%，復(fù)合酶酶水解效果顯著。

2 復(fù)合酶水解在植物來(lái)源蛋白質(zhì)中的應(yīng)用

植物蛋白質(zhì)與動(dòng)物蛋白質(zhì)相比，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，相對(duì)分子質(zhì)量小。酶解后的植物小分子蛋白活性高，易被人體吸收，具有抗氧化、降血壓、抑菌等功效[12]。

2.1 豆類(lèi)

大豆中含有豐富的植物蛋白，是簡(jiǎn)單易得的蛋白質(zhì)來(lái)源。大豆多肽中所含有的氨基酸與大豆蛋白質(zhì)基本相同，但大豆多肽具有的易消化、低過(guò)敏性的特點(diǎn)，更適合開(kāi)發(fā)大豆深加工產(chǎn)品。現(xiàn)已有研究人員對(duì)大豆蛋白水解形成大豆多肽進(jìn)行研究，通常是利用一種蛋白酶對(duì)大豆蛋白進(jìn)行水解。宋永康等[13]以大豆蛋白為原料，利用Alcalase蛋白酶、Protes.7L蛋白酶對(duì)豆粕蛋白進(jìn)行單酶、雙酶分步、雙酶同步水解的比較。其中，先Alcalase酶后加Protes.7L蛋白酶分步水解，水解液的水解度最高達(dá)23.5%。

綠豆多肽相對(duì)分子質(zhì)量小，水溶性好，易吸收，具有降膽固醇、抗氧化、提高機(jī)體免疫力等功能。馬詩(shī)文等[14]以綠豆蛋白為原料，利用堿性蛋白酶與中性蛋白酶對(duì)綠豆蛋白進(jìn)行水解，以水解度為指標(biāo)優(yōu)化水解工藝。通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳水解條件，水解度達(dá)到33.95%，DPPH自由基清除率達(dá)到82.8%，超氧陰離子自由基清除率達(dá)到76.82%，羥自由基清除率達(dá)到56.85%，綠豆蛋白水解產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性。

2.2 玉米

我國(guó)玉米產(chǎn)量的增長(zhǎng)，帶動(dòng)了玉米精深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。玉米加工副產(chǎn)物玉米黃粉蛋白質(zhì)含量高，玉米蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶水解能夠得到大量的活性多肽。王曉杰等[15]以玉米黃粉為原料，利用Alcalase酶、Protamex酶、Flavourzyme酶分別進(jìn)行雙酶分步水解，研究雙酶分步水解對(duì)玉米肽功能性質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Alcalase酶、Flavourzyme酶雙酶分步水解與Alcalase酶、Protamex酶雙酶分步水解，兩種水解方式抗氧化活性最佳出現(xiàn)時(shí)間均為150 min，表明在實(shí)際加工過(guò)程中可以通過(guò)控制雙酶分步水解的時(shí)間來(lái)提高水解液的抗氧化活性。

2.3 大米

大米產(chǎn)量豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，蛋白質(zhì)含量豐富。大米蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)水解得到的大米多肽穩(wěn)定性好，可作為添加劑應(yīng)用于化妝品等工業(yè)生產(chǎn)。問(wèn)題大米不符合我國(guó)食品安全法加工原料要求，不能食用。彭斕蘭等[16]利用問(wèn)題大米生產(chǎn)抗氧化肽，為問(wèn)題大米的處理提供了新途徑。該研究以抗氧化活性為指標(biāo)，利用胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶對(duì)大米蛋白進(jìn)行水解研究。對(duì)單酶水解與雙酶水解進(jìn)行比較，結(jié)果表明胰蛋白酶與堿性蛋白酶進(jìn)行復(fù)合水解的水解產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性，可應(yīng)用于功能食品的開(kāi)發(fā)。徐敏等[17]以大米米渣蛋白為原料，先將大米米渣進(jìn)行超聲處理，后通過(guò)堿性蛋白酶進(jìn)行水解，確定超聲與堿性蛋白酶聯(lián)合使用條件，在此基礎(chǔ)上使用中性蛋白酶進(jìn)一步水解，測(cè)定降血壓肽活性。將中性蛋白酶水解、堿性蛋白酶水解以及雙酶復(fù)合水解后血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin-converting Enzyme，ACE）活性進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組試驗(yàn)不具有明顯差距，雙酶水解時(shí)間縮短了，并提高了生產(chǎn)效率。

2.4 小麥

谷朊粉是活性小麥面筋蛋白，經(jīng)過(guò)酶水解得到生物類(lèi)活性多肽，喬曉林等[18]利用活性小麥面筋蛋白（谷朊粉）進(jìn)行雙酶水解以得到抗氧化肽，以水解后多肽的抗氧化活性為指標(biāo)，對(duì)雙酶水解的過(guò)程進(jìn)行了研究。該研究選擇木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶進(jìn)行研究，將3種蛋白酶分別進(jìn)行雙酶復(fù)配，研究不同復(fù)配方式對(duì)水解蛋白抗氧化活性的影響。結(jié)果顯示，木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶分步水解組分表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧護(hù)活性，對(duì)小麥加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了參考。小麥蛋白中含有大量的谷氨酰胺，潘麗軍等[19]以小麥蛋白為原料，選擇堿性蛋白酶與胰蛋白酶分步水解制備谷氨酰胺活性肽。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化水解過(guò)程，得到最佳雙酶水解條件：先利用堿性蛋白酶進(jìn)行水解，再利用胰蛋白酶水解效果。谷氨酰胺活性肽得率最高達(dá)61.38%，效果顯著。

2.5 胡蘿卜

Yu等[20]以胡蘿卜為原料，采用復(fù)合酶法、超細(xì)粉碎法和高靜水壓法對(duì)胡蘿卜渣中提取的不溶性膳食纖維進(jìn)行改性，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、理化和功能特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。通過(guò)纖維素酶和木聚糖酶雙酶水解的方法水解胡蘿卜超微粉碎渣，復(fù)合酶法將不可溶性膳食纖維含量提高到15.07%，有效提高了胡蘿卜不可溶性膳食纖維提取量，對(duì)接下來(lái)的試驗(yàn)提供了幫助。

2.6 菜籽

菜籽蛋白作為良好的蛋白來(lái)源，已逐漸成為研究熱點(diǎn)。葛焱等[21]以菜籽蛋白為原料，對(duì)復(fù)合酶水解過(guò)程進(jìn)行研究，以蛋白水解度為指標(biāo)，先利用堿性蛋白酶對(duì)菜籽蛋白進(jìn)行水解，再利用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解過(guò)程，此時(shí)蛋白水解度最高，最終選定利用雙酶分步水解的方法進(jìn)行菜籽蛋白研究。

3 其他

3.1 酪蛋白

酪蛋白作為寡肽，具有比氨基酸更好的吸收效果。王桂春等[22]以酪蛋白為原料，采用單酶水解與復(fù)合酶分步水解得到ACE抑制肽。首先使用胃蛋白酶水解酪蛋白，得到活性較高的ACE抑制肽，以此水解物為底物使用胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶水解，研究復(fù)合酶水解條件。將堿性蛋白酶水解進(jìn)行雙酶復(fù)合水解后，ACE抑制率提高不明顯，其中小分子肽含量明顯升高。該試驗(yàn)方法為蛋白酶水解小分子肽提供了研究方向。

3.2 乳清蛋白

在乳產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)中會(huì)產(chǎn)生大量的乳清廢料，包怡紅等[23]利用乳清蛋白制備ACE抑制肽，為乳清廢料的利用提供了參考。以乳清蛋白作為原料，通過(guò)堿性蛋白酶與胰蛋白酶進(jìn)行雙酶分步水解，以ACE抑制肽為指標(biāo)，確定最優(yōu)水解工藝，水解度最高為11.29%，ACE抑制肽抑制能力最強(qiáng)達(dá)到60.19%。

3.3 明膠

膠原水解后產(chǎn)生明膠，明膠蛋白含量高，不含有脂肪，是良好的蛋白來(lái)源，被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。安廣杰等[24]以明膠為原料，通過(guò)胰蛋白酶與中性蛋白酶雙酶水解的方法制備水解明膠。首先使用單酶水解的方法對(duì)水解酶進(jìn)行篩選，選擇水解度較高的水解酶進(jìn)行復(fù)配，在雙酶水解單因素試驗(yàn)后進(jìn)行正交篩選最優(yōu)雙酶水解條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙酶水解效果明顯，水解度最高為15.79%，多肽含量為56.87%。

3.4 藻類(lèi)蛋白

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)藻類(lèi)植物中含有大量的生物活性成分，海洋微藻多肽具有抗氧化、降血壓的功效。武瓊等[25]利用裂壺藻廢料提取抗氧化肽，以裂壺藻廢料提取得到的蛋白質(zhì)為原料，采用復(fù)合蛋白酶與Alcalase酶復(fù)配（1∶1，W/W）水解，6 h后抗氧化活性最高，還原力為1.417（質(zhì)量濃度3 mg/mL），具有較好的抗氧化活性。馬瑩等[26]以螺旋藻為原料，提取得到藻膽蛋白，使用胃蛋白酶與胰蛋白酶對(duì)藻膽蛋白進(jìn)行雙酶分步水解，提取得到血管緊張度轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽，并確定最佳酶解工藝。其ACE抑制肽抑制率為80.35%，超濾后得到小于3 kDa的藻膽蛋白肽，抑制率為94.3%。通過(guò)雙酶分步水解得到的螺旋藻蛋白肽，水解效果好，抑制率高，為藻蛋白開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

巖藻黃素是一種類(lèi)胡蘿卜素，存在于海洋褐藻中，對(duì)人體健康有多種有益的作用，如抗糖尿病、抗肥胖、抗癌和抗氧化等。海帶是海洋褐藻的一種，胡蘿卜素含量豐富。Xu等[27]以海帶為原料，微波協(xié)同果膠酶與纖維素酶水解得到巖藻黃素，結(jié)合響應(yīng)面法和Box-Behnken設(shè)計(jì)法對(duì)酶用量、復(fù)合酶配比和微波溫度進(jìn)行了研究和優(yōu)化。在優(yōu)化的提取工藝參數(shù)下，巖藻黃素提取率為0.443 mg。因此，在高效率、低能耗的系統(tǒng)中，這種方法可以實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié)語(yǔ)

復(fù)合酶水解工藝因其環(huán)保、綠色、節(jié)約等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。根據(jù)原料的不同需要，選擇不同的復(fù)合酶水解工藝，得到所需活性產(chǎn)物。復(fù)合酶水解工藝在蛋白質(zhì)水解領(lǐng)域使用最為普遍，在其他來(lái)源大分子物質(zhì)（膠原蛋白、纖維素）等方面的應(yīng)用也比較廣泛。復(fù)合酶水解工藝在食品行業(yè)中的規(guī)模性廣泛應(yīng)用還要取決于高效能的酶制劑的研究。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)酶的選擇性、操作可靠性、穩(wěn)定性不斷深入研究，復(fù)合酶水解工藝效率不斷提高，人類(lèi)終將能解決復(fù)合酶水解工藝中如酶失活、費(fèi)用較高等缺點(diǎn)。復(fù)合酶水解工藝在食品工業(yè)中的應(yīng)用前景十分廣闊，其優(yōu)越性日益顯著，將推動(dòng)21世紀(jì)食品研究開(kāi)發(fā)產(chǎn)業(yè)向前發(fā)展。