• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    吡蟲啉脅迫對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)及酶活力的影響

    2021-01-18 10:24:32候夢(mèng)賞程雪芬邱園妹朱雅楠趙必安李志國(guó)蘇松坤
    環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:意蜂哺育吡蟲啉

    候夢(mèng)賞,程雪芬,邱園妹,朱雅楠,趙必安,李志國(guó),蘇松坤

    (福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蜂學(xué)學(xué)院,福州,350002)

    蜜蜂是重要的授粉性昆蟲,在生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面發(fā)揮著重要作用(Pottsetal., 2010)。自2006年末北美爆發(fā)蜂群崩潰失調(diào)癥(colony collapse disorder, CCD)以來(lái)(Cox-Fosteretal., 2007),世界其它地區(qū)相繼出現(xiàn)蜂群數(shù)量大幅度減少的不正?,F(xiàn)象,(Normanetal., 2010)。大量研究顯示,造成這種現(xiàn)象的原因可能包括殺蟲劑濫用、寄生蟲、病毒、細(xì)菌等因素(Watsonetal., 2016; Magaletal., 2019)。新煙堿類殺蟲劑是全球使用量最多的品種,除了對(duì)靶標(biāo)昆蟲造成神經(jīng)性損傷以及死亡外,對(duì)全球重要授粉昆蟲——蜜蜂也具有高毒作用,嚴(yán)重威脅全球農(nóng)業(yè)環(huán)境生物安全(Peggetal., 2014)。

    新煙堿類殺蟲劑的作用機(jī)制主要是通過(guò)與昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)煙堿型乙酰膽堿酯酶競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合位點(diǎn),阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)(Masaru, 2005)。吡蟲啉作為典型的新煙堿類殺蟲劑,具有活性高、廣譜性的特點(diǎn),能夠?qū)е旅鄯鋫€(gè)體表現(xiàn)出學(xué)習(xí)能力減弱、壽命縮短、生存活力降低等問(wèn)題(Armengaudetal., 2004; Carolinaetal., 2015; Zhangetal., 2015; Raymannetal., 2018);在含有100 μg/kg吡蟲啉飼料喂養(yǎng)條件下蜂群群體表現(xiàn)蜂王交替時(shí)期過(guò)冬能力低下甚至有可能出現(xiàn)盜蜂現(xiàn)象(Ramirez-Romeroetal., 2005);亞致死劑量吡蟲啉能夠降低蜜蜂的嗅覺(jué)靈敏性(Tanetal., 2017);影響蜜蜂的定位功能從而弱化歸巢能力(Tosietal., 2017)。

    近年來(lái)已有關(guān)于不同劑量吡蟲啉脅迫對(duì)意大利蜜蜂影響的相關(guān)研究。在低劑量吡蟲啉脅迫下,激活蜜蜂解毒基因、免疫基因、抗氧化基因表達(dá)(Gong and Diao, 2017)。連續(xù)5 d飼喂意大利蜜蜂幼蟲含吡蟲啉的蔗糖溶液后,幼蟲體內(nèi)多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)表達(dá)量顯著上調(diào)(Tesovniketal., 2019);連續(xù)飼喂意大利蜜蜂0.02 μg/kg吡蟲啉7 d后,蜂王體內(nèi)CPY4G11,CYP6AS14表達(dá)顯著下調(diào)(Chaimaneeetal., 2016)。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GSTs)、乙酰膽堿酯酶(acetylchoinesterase, AChE)、細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)、PPO、羧酸酯酶(carboxylesterase,CE)超氧化物歧化酶(SDS)過(guò)氧化氫酶(CAT)是蜜蜂體內(nèi)重要解毒酶,參與蜜蜂對(duì)殺蟲劑解毒過(guò)程,在維持蜜蜂健康方面扮演重要角色(Boasetal., 2018)。然而目前關(guān)于亞致死劑量吡蟲啉脅迫對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂影響的研究報(bào)道尚少。

    本實(shí)驗(yàn)旨在探究在低劑量吡蟲啉脅迫下,意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)情況及免疫解毒酶系活力。探究飼喂含有低劑量吡蟲啉蔗糖溶液,對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂存活率的影響; 以及飼喂含有低劑量的吡蟲啉蔗糖溶液后,對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因PPOA3、ABA、GLD、CYP4506a2、CYB5612-like、UDP-glucuron-osyltransferase的表達(dá)量情況;以及飼喂含有低劑量的吡蟲啉蔗糖溶液后,對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂細(xì)胞色素P450酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶酶活力的影響。為后續(xù)進(jìn)一步探究亞致死劑量吡蟲啉對(duì)蜜蜂健康影響的分子機(jī)制打下一定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    吡蟲啉純品(Sigma),丙酮(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司),PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa),SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa),總蛋白提取試劑盒DE101(北京全式金生物科技有限公司),TaKaRa Bradford Protein Assay Kit(TaKaRa),昆蟲細(xì)胞色素P450試劑盒m1036261-J(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司),昆蟲多酚氧化酶PPO試劑盒m1062744-J(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司),昆蟲過(guò)氧化氫酶CAT試劑盒ml062687(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司),昆蟲超氧化物岐化酶SOD試劑盒ml036253(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司),NanoDrop 2000型分光光度計(jì)(Thermo Scientific),梯度PCR儀(Applied Biosystems),熒光定量PCR儀(BIORAD公司)。

    1.2 蜜蜂

    試驗(yàn)蜜蜂均取自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。從3個(gè)蜂群中取3張意蜂子脾,放進(jìn)限王產(chǎn)卵框中,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度34.5℃,相對(duì)濕度70%),每天使用熒光標(biāo)記筆標(biāo)剛出房意蜂,標(biāo)記后放入蜂群中進(jìn)行飼養(yǎng)。

    抓取哺育蜂(8日齡),在意蜂飼養(yǎng)盒中飼養(yǎng),每盒20頭意蜂,抓取6盒意蜂(對(duì)照組、處理組各3盒),置于恒溫培養(yǎng)箱中(溫度30℃,相對(duì)濕度70%)用于接受低劑量吡蟲啉處理。另抓取8日齡意蜂6盒(每盒20頭),低劑量吡蟲啉處理,記錄意蜂每天死亡數(shù)量,用于測(cè)定低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂存活率的影響。

    1.3 低劑量吡蟲啉處理

    吡蟲啉純品0.02 g溶于50 mL丙酮中制成400 ng/μL的吡蟲啉母液,使用50%蔗糖溶液稀釋吡蟲啉母液,處理組意蜂飼喂含有0.1 ng/μL吡蟲啉的50%蔗糖溶液,對(duì)照組意蜂飼喂含有等量丙酮的50%蔗糖溶液。每天更換蔗糖溶液并清理死亡意蜂。連續(xù)處理3 d和9 d后,液氮凍斃收取樣本,并將樣本放入-80℃冰箱中儲(chǔ)存,用于后續(xù)免疫、解毒基因表達(dá)及酶活力實(shí)驗(yàn)。

    1.4 提取RNA及cDNA的合成

    從對(duì)照組、處理組每個(gè)日齡樣本中各取3頭意蜂,使用TRIZOL法提取意蜂總RNA。使用NanoDrop 2000檢測(cè)RNA濃度并稀釋至1 000 ng/μL。配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL):5×gDNA Eraser Buffer 2 μL;gDNA Eraser 1 μL;總RNA 1 μL;ddH2O 6 μL;42℃反應(yīng)2 min。然向分別加入:PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL;RT Primer Mix 1 μL ;5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 μL;ddH2O 4 μL;混勻放入PCR儀中37℃,15 min;85℃,5 s;4℃保存。

    1.5 熒光定量PCR

    在384微孔PCR板上配制如下的反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 5 μL;PCR上游引物、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL(表1);DNA模板1 μL;滅菌水3.2 μL,共10 μL反應(yīng)體系。所有操作在冰上進(jìn)行,每個(gè)樣本做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。PCR反應(yīng)條件:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s;40個(gè)循環(huán);4℃保存。

    1.6 免疫解毒酶系活力的測(cè)定

    1.6.1總蛋白提取

    1 mL冰預(yù)冷PBS充分清洗蜜蜂樣本2次,500 g離心5 min,棄上清液;加入1 mL TPEB(Total Protein Extraction Buffer)震蕩勻漿,冰上孵育30 min,每隔10 min震蕩搖勻一次;4℃,14 000 g離心10 min,收集上清液,保存于-80℃冰箱中。

    1.6.2蛋白濃度測(cè)定

    用PBS緩沖液將BSA Standard solution標(biāo)準(zhǔn)品(2 mg/mL)稀釋為1 000、750、500、250、125、25 μg/mL等,取4 μL稀釋后的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液和檢測(cè)樣品溶液加入到96微孔板中;每孔各加入200 μL復(fù)溫的Bradford Dye Reagent,混勻后在室溫下反應(yīng)5 min;把96微孔板放入酶標(biāo)儀 595 nm波長(zhǎng)下檢測(cè),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度。

    表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物對(duì)序列信息

    1.6.3酶活力測(cè)定

    采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定意蜂體內(nèi)CYP450含量,PPO酶活力,CAT酶活力和SOD酶活力,參考試劑盒方法進(jìn)行酶活力的測(cè)定。

    1.7 數(shù)據(jù)分析

    使用Origin 9.0軟件繪制生存函數(shù)Kaplan-Meier對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,構(gòu)建意蜂的生存曲線圖表。本研究以RP49為內(nèi)參基因,采用比較CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)定量(目的基因表達(dá)量=2-△△Ct),并運(yùn)用SPSS軟件中獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)各組意蜂的基因相對(duì)表達(dá)量及酶活力進(jìn)行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂存活的影響

    8日齡哺育蜂飼喂含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液3 d和9 d后與對(duì)照組存活率無(wú)顯著差異(P>0.05),表明哺育蜂自由取食3 d和9 d的含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液對(duì)其沒(méi)有造成致死毒性,8日齡工蜂飼喂含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液11 d后與對(duì)照組存活率有顯著差異(P<0.05),表明長(zhǎng)期取食含吡蟲啉的蔗糖溶液會(huì)對(duì)其造成致死毒性。

    圖1 0.1 ng/μL吡蟲啉處理不同時(shí)間后意大利蜜蜂哺育蜂的存活率Fig.1 Survival rate of nurse bees of Apis mellifera ligustica after exposed to 0.1 ng/μL imidacloprid for different time注:8日齡意蜂抓出籠養(yǎng),處理組飼喂含0.1 ng/μL吡蟲啉的50%蔗糖溶液,對(duì)照組飼喂含0.1 ng/μL丙酮的50%蔗糖溶液。圖2和圖3同。Note:The 8 day-old adult bees were caught and raised in cages. In the treatment group, the bees were fed with 50% (w/v) sucrose solution containing 0.1 ng/μL of imidacloprid ad libitum, while in the control group the bees were fed with 50% (w/v) sucrose solution containing 0.1 ng/μL of acetone ad libitum. The same for Fig.2 and Fig.3.

    2.2 低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)的影響

    8日齡哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液3 d后與對(duì)照組相比(圖2),CYB5612-like、UDP-glucuronosyltransferase2C1、CYP4506a2、Abaecin、Glucosedehydrogenase、PPOA3均出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),其中UDP-glucuronosyltransferase2C1、Abaecin與GlucoseDehydrogenase有顯著上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05);8日齡哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液9 d后與對(duì)照組相比CYB5612-

    圖2 0.1 ng/μL吡蟲啉處理3 d與9 d后意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因的表達(dá)Fig.2 Relative expression levels ofimmune and detoxification related genes in nurse bees of Apis mellifera ligustica exposed to 0.1 ng/μL imidacloprid for 3 d and 9 d注:A,CYB561 2-like;B,UDP-glucuronosyltransferase 2C1;C,CYP450 6a2;D,Abaecin;E,Glucose dehydrogenase;F,PPOA3. 圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3),圖形柱上星號(hào)表示兩組間差異顯著(P<0.05, T檢驗(yàn))。圖3同。Note:Data in the figure are mean±SE(n=3). The single asterisk indicate significant difference (P<0.05) between the two groups by T-test. The same for Fig.3.

    like、UDP-glucuronosyltransferase2C1、CYP4506a2、Abaecin、Glucosedehydrogenase、PPOA3均出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),其中UDP-glucuronosyltransferase2C1、CYP4506a2、Abaecin與GlucoseDehydrogenase有顯著上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)。

    2.3 低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒酶系活力的影響

    8日齡哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液3 d后與對(duì)照組相比(圖3),CYP450含量出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),CAT酶與SOD酶活力均有顯著下調(diào)趨勢(shì)(P<0.05);8日齡哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液9 d后與對(duì)照組相比,CYP450含量,PPO,CAT與SOD酶活力均有顯著下調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)。

    圖3 0.1 ng/μL吡蟲啉處理3 d與9 d后意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒酶系活力Fig.3 Specific activity of immune and detoxification in nurse bees of Apis mellifera ligustica exposed to 0.1 ng/μL imidacloprid for 3 d and 9 d 注:A,PPO;B,CYP450;C,CAT;D,SOD.

    3 結(jié)論與討論

    隨著殺蟲劑的廣泛使用,其對(duì)蜜蜂影響的相關(guān)研究也逐步增多,殺蟲劑不僅影響采集蜂的健康,蜜蜂采集歸巢后,殺蟲劑還會(huì)影響幼蟲、內(nèi)勤蜂、蜂王的健康(Chaimaneeetal., 2016; Gong and Diao, 2017; Tesovniketal., 2019),哺育蜂在蜂群中扮演重要角色,承擔(dān)著哺育幼蟲、飼喂蜂王的重任,哺育蜂的質(zhì)量關(guān)系到蜂群的群勢(shì)與健康(Winston, 1991)。本實(shí)驗(yàn)主要探究低劑量吡蟲啉脅迫對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂的影響,實(shí)驗(yàn)條件下0.1 ng/μL吡蟲啉連續(xù)飼喂8日齡意蜂3 d與9 d對(duì)意蜂的存活率沒(méi)有顯著影響,連續(xù)飼喂11 d對(duì)意蜂的存活率有顯著影響,與候夢(mèng)賞(2019)關(guān)于吡蟲啉對(duì)內(nèi)勤蜂的研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)室條件下,亞致死劑量吡蟲啉短期脅迫對(duì)意蜂哺育蜂的存活沒(méi)有顯著影響,長(zhǎng)期脅迫對(duì)意蜂哺育蜂的存活有顯著影響。

    與哺乳動(dòng)物不同,昆蟲只存在先天免疫,包括體液免疫和細(xì)胞免疫。二者在昆蟲免疫系統(tǒng)中扮演重要角色,昆蟲主要依賴這兩類免疫體系抵御外源性致病因子(Kleinoetal., 2014)。蜜蜂通過(guò)基因表達(dá)、蛋白酶反應(yīng),共同參與對(duì)農(nóng)藥等外源性物質(zhì)的代謝(Mohamedetal., 2015;Cizeljetal., 2016)。CYB561 2-like是細(xì)胞色素b561家族基因中一員,其主要功能是參與細(xì)胞防御機(jī)制及應(yīng)答環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的刺激(Zamanianetal., 2012)。UDP-glucuronosyltransferase2C1編碼的酶在催化過(guò)程中,大大提高受體分子的水溶性,促進(jìn)葡萄糖醛酸從體內(nèi)的外排,參與體內(nèi)免疫機(jī)制。(Goonetal., 1992),CYP450基因家族在昆蟲生長(zhǎng)、發(fā)育及防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Dereckaetal., 2013),Abaecin在脅迫狀態(tài)下能夠編碼特定抗菌肽,是體液免疫基因家族中重要組成部分。(Evansetal., 2006);Glucosedehydrogenase能夠編碼葡萄糖脫氫酶,該酶能夠殺死病原菌,參與蜜蜂細(xì)胞免疫過(guò)程(Cox-Foster and Stehr, 1994)。PPOA3通過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯多酚氧化酶,在蜜蜂生長(zhǎng)過(guò)程中扮演重要角色(Tesovniketal., 2019);本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示0.1 ng/μL吡蟲啉飼喂意蜂9 d后UDP-glucuronosyltransferase2C1,CYP4506a2,Abaecin,Glucosedorydrogenase表達(dá)量均具有顯著下調(diào),這與Tesovnik等(2019)人的研究具有類似的結(jié)果。從基因水平揭示亞致死劑量吡蟲啉脅迫下,可以引起蜜蜂的解毒代謝機(jī)制,長(zhǎng)期的接觸則會(huì)負(fù)面影響意蜂的免疫解毒功能,進(jìn)而影響意蜂的生存健康。此外,吡蟲啉與其它生物性致病因子協(xié)同作用,加劇對(duì)蜜蜂的危害。亞致死劑量吡蟲啉脅迫下,意蜂體內(nèi)微孢子蟲感染量顯著增加,蜜蜂健康水平下降更顯著(Judyetal., 2012)。亞致死劑量吡蟲啉脅迫后,瓦螨對(duì)蜜蜂健康造成更大的危害,說(shuō)明在吡蟲啉脅迫下蜜蜂免疫機(jī)制受到損害,進(jìn)而影響意蜂的抗螨能力(Tesovniketal., 2019)。

    細(xì)胞色素P450酶系、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是蜜蜂體內(nèi)重要的解毒酶系,在抵抗殺蟲劑的脅迫中發(fā)揮著重要功能。多酚氧化酶參與調(diào)節(jié)昆蟲各種生理活動(dòng),包括變態(tài)發(fā)育、免疫機(jī)制等。(Andersen, 2010),細(xì)胞色素P450酶系參與蜜蜂外源解毒,在昆蟲生長(zhǎng)、發(fā)育及防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Igaand Kataoka, 2012)。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶二者功能是清除昆蟲體內(nèi)過(guò)剩的活性氧,保護(hù)機(jī)體免遭環(huán)境脅迫的危害(Mccord and Fridovich, 1969; Bolter and Chefurka, 1990),Li等(2017)使用亞致死劑量吡蟲啉處理意蜂,在48 h內(nèi)檢測(cè)解毒酶系活力的變化,而本實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)到9 d,并且與對(duì)照組相比以上4種酶活性均顯著下調(diào),進(jìn)一步說(shuō)明亞致死劑量吡蟲啉脅迫下抑制意蜂解毒酶系活力,導(dǎo)致蜜蜂對(duì)吡蟲啉的代謝能力下降,大量的吡蟲啉蓄積在體內(nèi)可能會(huì)影響蜜蜂的健康和行為表現(xiàn)。蜜蜂在吡蟲啉脅迫下出現(xiàn)嗅覺(jué)學(xué)習(xí)障礙,同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)蜜蜂腦部細(xì)胞出現(xiàn)相應(yīng)程度的細(xì)胞凋亡和自噬現(xiàn)象,對(duì)蜜蜂食欲行為的不同方面都有不良影響,以及對(duì)食物分配、嗅覺(jué)信息傳播和巢內(nèi)任務(wù)協(xié)調(diào)都有影響。(吳艷艷等, 2014; Lietal., 2019; Carolina Mengoni Goalons and Farina, 2019)

    綜上,本研究通過(guò)存活率、免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)和免疫解毒酶系活力3個(gè)層面探索低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂的影響。結(jié)果表明低劑量吡蟲啉脅迫影響意蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因的表達(dá)及免疫解毒酶系活力,長(zhǎng)期脅迫影響意蜂生存。亞致死劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂行為、代謝和生理影響仍需在自然條件下做進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    意蜂哺育吡蟲啉
    70%吡蟲啉水分散粒劑劑的配方研制
    云南化工(2021年9期)2021-12-21 07:43:42
    如何處理意蜂盜取中蜂群
    蜜蜂雜志(2021年6期)2021-12-05 09:57:44
    噻蟲嗪、吡蟲啉灌根防治蘋果綿蚜及砧穗組合抗性試驗(yàn)
    河北果樹(2021年4期)2021-12-02 01:14:40
    10%吡蟲啉可濕性粉劑在蠶種生產(chǎn)上的應(yīng)用報(bào)告
    詳解意蜂盜劫中蜂之過(guò)程
    蜜蜂雜志(2020年6期)2020-12-02 08:07:09
    母親哺育我 我報(bào)慈母恩
    海峽姐妹(2020年10期)2020-10-28 08:08:10
    母親哺育我 我報(bào)慈母恩
    海峽姐妹(2020年4期)2020-05-30 13:00:10
    意蜂蜂蜜和中蜂蜂蜜的區(qū)別
    蜜蜂雜志(2019年3期)2019-12-30 10:25:52
    2017年巴西進(jìn)口近8000t吡蟲啉價(jià)格上漲感受明顯
    哺育
    寶藏(2017年2期)2017-03-20 13:16:52
    三上悠亚av全集在线观看| 国产单亲对白刺激| 亚洲人成电影免费在线| 很黄的视频免费| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美色视频一区免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久精品91无色码中文字幕| 国产av又大| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 大码成人一级视频| av天堂久久9| 午夜免费鲁丝| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 高清欧美精品videossex| 少妇 在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 成年动漫av网址| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产精品电影一区二区三区 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| a级片在线免费高清观看视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲黑人精品在线| 视频在线观看一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 久久精品成人免费网站| 国产精品久久视频播放| 亚洲人成电影观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产麻豆69| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产1区2区3区精品| 一本大道久久a久久精品| 超碰97精品在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 嫩草影视91久久| 搡老岳熟女国产| 日本黄色日本黄色录像| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产99白浆流出| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩免费av在线播放| 午夜视频精品福利| tube8黄色片| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲一码二码三码区别大吗| av福利片在线| av网站在线播放免费| 精品少妇久久久久久888优播| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲一区中文字幕在线| 动漫黄色视频在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 热99久久久久精品小说推荐| 午夜福利免费观看在线| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 中文字幕色久视频| 国产成人免费无遮挡视频| 手机成人av网站| 不卡一级毛片| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲av美国av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久香蕉激情| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成人av一区二区三区在线看| 天天影视国产精品| 黄色视频不卡| 啪啪无遮挡十八禁网站| 18在线观看网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产免费现黄频在线看| 天堂中文最新版在线下载| 午夜精品在线福利| 老司机福利观看| 国产激情久久老熟女| 久久人妻av系列| 中文字幕精品免费在线观看视频| 中文亚洲av片在线观看爽 | 少妇的丰满在线观看| 国产精品永久免费网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲片人在线观看| 一进一出好大好爽视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美色视频一区免费| 欧美精品av麻豆av| 免费日韩欧美在线观看| 91字幕亚洲| av视频免费观看在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久性视频一级片| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲专区国产一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲视频免费观看视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜成年电影在线免费观看| 黄色毛片三级朝国网站| 国产一区二区三区视频了| 亚洲国产精品sss在线观看 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久精品国产综合久久久| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美性长视频在线观看| 午夜免费成人在线视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久久精品人妻al黑| 国产成人精品无人区| 久久香蕉激情| 国产精品欧美亚洲77777| 男男h啪啪无遮挡| 中文亚洲av片在线观看爽 | 极品人妻少妇av视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 动漫黄色视频在线观看| 人妻 亚洲 视频| 国产成人精品久久二区二区91| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 看片在线看免费视频| av网站在线播放免费| 少妇的丰满在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区 | 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲avbb在线观看| 久久久久视频综合| 精品久久蜜臀av无| 精品欧美一区二区三区在线| 极品人妻少妇av视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久9热在线精品视频| 亚洲人成电影观看| 久久久国产成人免费| 欧美乱妇无乱码| 一区二区三区精品91| 精品电影一区二区在线| 亚洲欧美色中文字幕在线| 在线观看免费视频网站a站| 国产欧美亚洲国产| av网站免费在线观看视频| 欧美黄色淫秽网站| 精品国内亚洲2022精品成人 | 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| av线在线观看网站| 91精品三级在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 国产亚洲欧美98| 精品少妇久久久久久888优播| 麻豆成人av在线观看| 男女午夜视频在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 高清黄色对白视频在线免费看| 女警被强在线播放| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美人与性动交α欧美软件| 中文亚洲av片在线观看爽 | 国产精华一区二区三区| 777米奇影视久久| 午夜日韩欧美国产| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 国产精品永久免费网站| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜免费成人在线视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久99一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 一级片'在线观看视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 妹子高潮喷水视频| av视频免费观看在线观看| 久久香蕉国产精品| 免费观看a级毛片全部| 国产人伦9x9x在线观看| 免费观看精品视频网站| 曰老女人黄片| 亚洲国产精品合色在线| 精品久久久精品久久久| 国产免费男女视频| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| а√天堂www在线а√下载 | 美女国产高潮福利片在线看| 免费在线观看影片大全网站| 18禁国产床啪视频网站| 极品教师在线免费播放| 久久午夜亚洲精品久久| www.熟女人妻精品国产| 香蕉久久夜色| 成人av一区二区三区在线看| 天堂动漫精品| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久ye,这里只有精品| 亚洲av成人一区二区三| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日本黄色视频三级网站网址 | 亚洲精品自拍成人| 黄色丝袜av网址大全| 欧美精品亚洲一区二区| 精品视频人人做人人爽| 男女免费视频国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 狂野欧美激情性xxxx| 9191精品国产免费久久| 亚洲伊人色综图| 午夜福利在线免费观看网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 多毛熟女@视频| 亚洲国产精品合色在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 天堂动漫精品| a在线观看视频网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美日韩精品网址| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲人成77777在线视频| 日韩有码中文字幕| 国产片内射在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 一区福利在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 一级a爱视频在线免费观看| 午夜激情av网站| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲欧美日韩高清在线视频| 激情在线观看视频在线高清 | 国产单亲对白刺激| 高清在线国产一区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 757午夜福利合集在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 国产亚洲精品久久久久5区| 99久久精品国产亚洲精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 中文字幕制服av| 99热只有精品国产| 丝袜人妻中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 超碰97精品在线观看| 亚洲av成人av| 波多野结衣一区麻豆| 国产精品电影一区二区三区 | a在线观看视频网站| 大码成人一级视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 少妇 在线观看| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精华国产精华精| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲专区字幕在线| 欧美在线黄色| 91av网站免费观看| 三级毛片av免费| 窝窝影院91人妻| 国产在线一区二区三区精| 国产有黄有色有爽视频| 中文字幕色久视频| 激情在线观看视频在线高清 | 高清av免费在线| 久热爱精品视频在线9| 午夜福利乱码中文字幕| 18在线观看网站| www.精华液| 在线观看免费视频日本深夜| 在线免费观看的www视频| 久久性视频一级片| 国产1区2区3区精品| 亚洲少妇的诱惑av| av有码第一页| 国产单亲对白刺激| 9热在线视频观看99| 久久精品国产清高在天天线| 欧美色视频一区免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品国产乱码久久久久久男人| e午夜精品久久久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久99久视频精品免费| 色播在线永久视频| 99re在线观看精品视频| 视频在线观看一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成人av一区二区三区在线看| 久久国产精品大桥未久av| 日本wwww免费看| 国产成+人综合+亚洲专区| 日本欧美视频一区| 国产成人精品无人区| 国产亚洲欧美98| 我的亚洲天堂| 欧美日韩av久久| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 国精品久久久久久国模美| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 90打野战视频偷拍视频| 少妇的丰满在线观看| 麻豆成人av在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲av成人av| 日韩有码中文字幕| 亚洲专区字幕在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产高清激情床上av| 又大又爽又粗| svipshipincom国产片| 妹子高潮喷水视频| 女性生殖器流出的白浆| 欧美成人免费av一区二区三区 | 精品乱码久久久久久99久播| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 搡老岳熟女国产| 黄片大片在线免费观看| 99国产精品99久久久久| 欧美在线黄色| 国产成人影院久久av| 一级毛片精品| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲一码二码三码区别大吗| 看免费av毛片| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费在线观看日本一区| 免费看a级黄色片| 日本a在线网址| 最新美女视频免费是黄的| 12—13女人毛片做爰片一| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久久国产一级毛片高清牌| 麻豆乱淫一区二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 伦理电影免费视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲中文av在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲专区国产一区二区| 国产免费现黄频在线看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 黄片播放在线免费| 新久久久久国产一级毛片| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 啦啦啦 在线观看视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产精品二区激情视频| 三级毛片av免费| 亚洲色图av天堂| 在线天堂中文资源库| 1024视频免费在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 精品一区二区三区av网在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜精品在线福利| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 18在线观看网站| 色尼玛亚洲综合影院| 国产一区二区三区视频了| 国产精品二区激情视频| 十八禁人妻一区二区| 热re99久久国产66热| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 美女福利国产在线| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| tocl精华| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产视频一区二区在线看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国精品久久久久久国模美| 亚洲片人在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 丝瓜视频免费看黄片| 十八禁人妻一区二区| 久久精品国产综合久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲国产精品sss在线观看 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一本综合久久免费| 国产91精品成人一区二区三区| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 丝袜人妻中文字幕| www日本在线高清视频| 黑丝袜美女国产一区| xxx96com| 国产av一区二区精品久久| 亚洲欧美激情综合另类| 飞空精品影院首页| 久久精品91无色码中文字幕| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| 欧美大码av| 精品国产一区二区三区四区第35| x7x7x7水蜜桃| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | av不卡在线播放| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| √禁漫天堂资源中文www| 国产又爽黄色视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| www.自偷自拍.com| 国产av一区二区精品久久| 国产成人免费观看mmmm| 999久久久国产精品视频| 大香蕉久久成人网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 99国产综合亚洲精品| 精品少妇久久久久久888优播| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品久久电影中文字幕 | 18禁美女被吸乳视频| 国产在视频线精品| 90打野战视频偷拍视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99热网站在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品免费久久久久久久清纯 | 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲,欧美精品.| 国产片内射在线| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产激情久久老熟女| 国产一区有黄有色的免费视频| 91国产中文字幕| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 极品教师在线免费播放| 日日爽夜夜爽网站| 一进一出好大好爽视频| 国产精品一区二区在线不卡| 国产在线一区二区三区精| 欧美精品一区二区免费开放| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 麻豆av在线久日| 在线观看66精品国产| 亚洲五月天丁香| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜亚洲福利在线播放| 咕卡用的链子| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费观看精品视频网站| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 大片电影免费在线观看免费| av中文乱码字幕在线| x7x7x7水蜜桃| 丝瓜视频免费看黄片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 男人舔女人的私密视频| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美日韩黄片免| 一区二区三区精品91| 老司机在亚洲福利影院| 久久久久久久久久久久大奶| 久久国产精品影院| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品美女久久av网站| 看免费av毛片| 宅男免费午夜| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜福利,免费看| 国产精品 欧美亚洲| 18禁国产床啪视频网站| 久久影院123| 日韩欧美三级三区| 人人澡人人妻人| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 后天国语完整版免费观看| 超碰97精品在线观看| 18在线观看网站| 少妇 在线观看| 亚洲人成电影观看| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美日韩乱码在线| 欧美性长视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 美女国产高潮福利片在线看| 母亲3免费完整高清在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 十八禁人妻一区二区| 丝袜在线中文字幕| 国产麻豆69| 好男人电影高清在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 999久久久国产精品视频| 精品无人区乱码1区二区| 在线观看一区二区三区激情| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 搡老岳熟女国产| 免费av中文字幕在线| 午夜福利,免费看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲人成77777在线视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| videosex国产| 91老司机精品| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲 欧美一区二区三区| 黄色视频不卡| 精品久久久精品久久久| 日本a在线网址| 精品福利观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久久久人人人人人| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 午夜福利欧美成人| 国产精品欧美亚洲77777| 99精品欧美一区二区三区四区| av国产精品久久久久影院| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲专区字幕在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 伦理电影免费视频| 国产精品二区激情视频| 国产成人免费无遮挡视频| 深夜精品福利| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 狂野欧美激情性xxxx| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美成人免费av一区二区三区 | 成人黄色视频免费在线看| 动漫黄色视频在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽 | 三上悠亚av全集在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品免费一区二区三区在线 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产高清激情床上av| 91老司机精品| 黑丝袜美女国产一区| 又黄又粗又硬又大视频| 中亚洲国语对白在线视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 天天影视国产精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品视频人人做人人爽| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久精品人妻al黑| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲三区欧美一区| 操出白浆在线播放| videos熟女内射| 黑人猛操日本美女一级片| 久久久久精品人妻al黑| 又黄又粗又硬又大视频| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 一进一出好大好爽视频| 91精品国产国语对白视频| 90打野战视频偷拍视频| 色综合婷婷激情| 极品教师在线免费播放| 国产免费男女视频| 国产成人精品久久二区二区91| 一级黄色大片毛片| 日韩有码中文字幕| 久久狼人影院| 国产99久久九九免费精品| 欧美日韩乱码在线| 亚洲五月色婷婷综合| 波多野结衣一区麻豆| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃|