均腐土不同亞綱典型土系土壤細(xì)菌群落多樣性研究

焦 峰，呂淑敏，唐 雷，張東萌，王光華

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319；2.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所， 黑土農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081）

均腐土（Isohumisols）是中國土壤系統(tǒng)分類（CST）體系中提出并使用的土綱級分類單元，指具暗沃表層、均腐殖質(zhì)特性和土體鹽基飽和度≥50%的一類土壤，其中均腐殖質(zhì)特性（Isohumic property，Ihp）是最早由法國發(fā)生土壤學(xué)及土壤制圖委員會提出并用于土綱級的劃分，CST引入并在高級分類研究階段采用了這個指標(biāo)，并限定Ihp土表至20 cm與土表至100 cm土層腐殖質(zhì)儲量比值≤0.4。Isohumosols檢索應(yīng)首先具有暗沃表層，因此可以理解Isohumosols與美國的Mollisols有大致相似的特點，但因診斷特性Ihp的引入，使Mollisols中大部分不具備Ihp的Albolls很難實現(xiàn)均腐土土綱級的檢索，致使均腐土與Mollisols以及世界土壤資源參比基礎(chǔ)的Phaeozems、俄羅斯的Chernozems、中國土壤發(fā)生分類（GSGC）的Black soil有很大的不同，同時，均腐土又是我國重要的土壤類型［1］，在東北平原多有分布。CST將均腐土分為干潤均腐土、濕潤均腐土和巖性均腐土3個亞綱［2-3］，其中巖性均腐土分布在中國南海諸島［1］，而東北平原因其獨(dú)特的氣候環(huán)境和地理位置主要發(fā)育干潤均腐土和濕潤均腐土兩個亞綱，并成為均腐土的主要類型。在均腐殖質(zhì)特性的環(huán)境中生存的細(xì)菌形成了特有的結(jié)構(gòu)和機(jī)能，而均腐土不同亞綱典型土系的土壤組分可能成為驅(qū)動土壤細(xì)菌差異的重要因素。近年來，我國學(xué)者對于CST體系下均腐土的研究較少且集中于理化指標(biāo)、土壤質(zhì)量評價等方面［4-5］，對于均腐土生物學(xué)性質(zhì)的變化情況還未涉及。

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成及土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)等生物化學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用［6-9］。土壤微生物對土壤條件變化非常敏感，能在較短時間內(nèi)發(fā)生大幅度變化，因而土壤微生物量的變化通常作為土壤質(zhì)量演變的重要依據(jù)［10-12］。土壤微生物是否存在與植物和動物等大型生物相似或不同的地理分布格局，以及哪些因素驅(qū)動著這種格局的存在是當(dāng)前學(xué)者們研究的交叉熱點課題之一。GSGC體系下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)地理分布規(guī)律與化學(xué)性質(zhì)關(guān)系及其驅(qū)動因素已有研究而結(jié)果不盡相同［13-16］，同時，以往的研究均以固定的土壤深度為對比單元，忽略了成土過程和成土條件對土壤性質(zhì)的影響，很難與土壤本質(zhì)屬性結(jié)合分析。土壤細(xì)菌占土壤微生物總量的70%～90%，是土壤最活躍的因素［17］。盡管已有土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)關(guān)系及驅(qū)動因素的研究，但對于Isohumisols典型土系的研究卻尚未報道，特別是對發(fā)生層內(nèi)部土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)間的關(guān)聯(lián)性了解極為有限。本研究采用高通量測序技術(shù)，研究CST體系下的均腐土不同亞綱典型土系腐殖質(zhì)層（Ah層）化學(xué)性質(zhì)及土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系，進(jìn)一步闡明均腐土中驅(qū)動Ah層細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子，為均腐土的科學(xué)保護(hù)利用提供理論基礎(chǔ)和 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2018年10月確定8個土系的樣點位置［主要分布在46.619 57°N～48.967 35oN及124.608 10oE～ 131.860 50oE（表1）］，并采集土樣。土壤樣品采集時按1 m寬、2 m長、2 m深挖掘土壤剖面，確定土系及發(fā)生層后，按發(fā)生層厚度采集土壤，本研究只針對8個典型土系的Ah層土樣進(jìn)行分析，每個樣點3次重復(fù)（n=24），樣點具體概況見表1所示。將采集的土樣去除植物根系和雜草，混勻，分裝兩份，一份風(fēng)干研磨后過2 mm篩，用于土壤化學(xué)性質(zhì)測定，一份直接過2 mm篩，放-80℃冰箱保存，用于土壤細(xì)菌群落多樣性的 測定。

表1 均腐土8個典型土系基本特征

1.2 土壤化學(xué)性質(zhì)的測定

土壤化學(xué)性質(zhì)的測定采用常規(guī)方法［18］：有機(jī)碳（SOC）采用重鉻酸鉀容量法測定；全氮（TN）采用凱式定氮法測定；全磷（TP）采用HF—硝酸混合消煮，鉬銻抗比色法測定；全鉀（TK）采用HF—硝酸混合消煮，AAS法測定；pH采用電位法測定（水土比2.5∶1）；陽離子交換量（CEC）采用乙酸銨—EDTA交換法測定；交換性鉀（EXK）、交換性鈉（EX-Na）、交換性鈣（EX-Ga）、交換性鎂（EX-Mg）采用乙酸銨交換-AAS法測定。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和Illumina HiSeq測序

使用mobio土壤微生物DNA強(qiáng)力提取試劑盒（PowerSoil? DNA Isolation Kit）提取土壤微生物DNA，用NanoDrop 2000分光光度計檢測DNA 濃度。

根據(jù)文獻(xiàn)［19］的方法對細(xì)菌16S rRNA基因（V3+V4）區(qū) 域 的PCR進(jìn) 行 擴(kuò) 增。338F（5’- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）為 正 向 引 物，806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）為反向引物。目標(biāo)區(qū)域PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，15個循環(huán)（95℃，1 min，50℃，1 min，72℃，1 min），72℃，7 min，然后將樣品與磁珠按照1∶1.5混勻后進(jìn)行磁珠篩選片段，純化完后進(jìn)行SolexaPCR，反應(yīng)條件為98℃，30 s，10個循環(huán)（98℃，10 s，65℃，30 s，72℃，30 s），72℃，5 min，然后進(jìn)行磁珠純化，將純化后的產(chǎn)物進(jìn)行Nanodrop2000定量后，按照質(zhì)量比1∶1進(jìn)行混樣，通過1.8%的瓊脂糖凝膠，120V，40 min電泳后，切目的片段，并回收。每個樣品做3次重復(fù)，送至北京百邁克生物科技有限公司，利用Illumina Hiseq 2500平臺進(jìn)行測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接（FLASH［20］，version 1.2.11），將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過濾（Trimmomatic［21］，version 0.33），并去除嵌合體（UCHIME［22］， version 8.1），得到高質(zhì)量的Tags序列。

在相似性97%的水平上對序列進(jìn)行聚類（USEARCH［23］，version 10.0），以測序所有序列數(shù)的 0.005%作為閾值過濾 OTU［24］。采用RDP Classifier（version 2.2）基于Sliva（細(xì)菌，Release 132）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，置信度閾值為0.8［25］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

Alpha多樣性分析，包括群落豐富度指數(shù)（Chao1和ACE）、群落多樣性指數(shù)（香農(nóng)Shannon和辛普森Simpson），使用Mothur（version 1.30）軟件，對樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評估［26］。

數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 21.0、SigmaPlot 12.5進(jìn)行整理和分析，數(shù)據(jù)分析使用單因素方差分析，多重比較運(yùn)用Duncan檢驗（P<0.05，n=24）。具體制圖運(yùn)用北京百邁克生物科技有限公司的BMKCloud云平臺分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 均腐土典型土系化學(xué)性質(zhì)分析

均腐土不同亞綱8個典型土系pH值為5.85～ 8.25，由低到高依次為裴德系、衛(wèi)星農(nóng)場系、大西江系、富牧西系、新發(fā)北系、保國系、明水系、春雷南系，其中干潤均腐土高于濕潤均腐土。土壤SOC總體差異較大，大西江系的SOC含量最高，達(dá)46.24 g/kg，而富牧西系含量最低，僅12.11 g/kg。8種土系中TK、EX-Ga均為干潤均腐土高于濕潤均腐土。均腐土的土壤化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)普遍較高，其中，大西江系土壤10種化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)，除TP、CEC、EX-Na外均顯著（P<0.05）高于其他7種土系（表2）。

表2 均腐土土壤化學(xué)性質(zhì)

2.2 均腐土典型土系細(xì)菌α-多樣性

表3顯示，均腐土的覆蓋率均為99%以上，說明該樣品測序已趨于飽和，表明Hiseq測序結(jié)果中含蓋了大多數(shù)微生物種群，可以真實反映均腐土微生物的群落結(jié)構(gòu)組成。均腐土24個樣品8個土系測序共獲得1 674 634條Clean tags，各樣品的Clean tags在65 242～73 156之間（表3），有效序列在63 749～72 842之間。8個土系中有效序列的數(shù)量差異較小。干潤均腐土中春雷南系檢測出的OTU最少，保國系的OTU較高。春雷南系Clean tags檢測出的數(shù)量最高，但辛普森指數(shù)、Ace 指數(shù)、Chao1 指數(shù)均較小，表明春雷南系細(xì)菌豐度和多樣性比其他7種土系低。均腐土各土系的Ace 指數(shù)、Chao1 指數(shù)較為接近，表明均腐土8個土系的菌群豐度趨于相似。除春雷南系外，香農(nóng)指數(shù)均表現(xiàn)為干潤均腐土>濕潤均腐土。辛普森指數(shù)表現(xiàn)為富牧西系與裴德系相同，春雷南系與明水系相同，保國系與大西江系、新發(fā)北系、衛(wèi)星農(nóng)場系相同，說明其群落多樣性相似?？傮w來看，在本研究中，均腐土8個土系中，干潤均腐土的細(xì)菌群落多樣性高于濕潤均腐土 （表4）。

表3 均腐土的Hiseq測序結(jié)果和多樣性指數(shù)

表4 均腐土不同亞綱的細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.3 均腐土典型土系細(xì)菌類群

圖1為均腐土不同亞綱8個土系細(xì)菌OTU的數(shù)量和組成。在OTU水平上，8個土系共檢出 2 204個OTU，其中，干潤均腐土共有OTU為528個，占總OTU的23.96%，特有OTU分別為富牧西系13、春雷南系11、保國系43、明水系22個，分別占干潤均腐土共有OTU的2.5%、2.1%、8.1%、4.2%（圖1a）；濕潤均腐土共有OTU為372個，占總OTU的16.88%，特有OTU分別為大西江系40、新發(fā)北系47、衛(wèi)星農(nóng)場系17、裴德系6個，分別占濕潤均腐土共有OTU的10.75%、12.63%、4.5%、1.6%（圖1b）；將24個樣品的3個重復(fù)合并后發(fā)現(xiàn)，均腐土共有OTU為628個，占總OTU數(shù)量的28.5%。8個土系僅富牧西系、春雷南系、明水系、新發(fā)北系、衛(wèi)星農(nóng)場系檢出特有的OTU，分別為3、1、1、21、1個，其中新發(fā)北系特有OTU數(shù)量最多，為21個，保國系、大西江系、裴德系未檢出特有OTU（圖1c）。

圖1 細(xì)菌OTU分布水平上的Venn圖

2.4 均腐土典型土系細(xì)菌群落組成

均腐土不同亞綱8個土系共檢測到25個細(xì)菌門，不同土系間細(xì)菌群落的差異較大。在門水平下，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）為富牧西系、春雷南系、保國系、大西江系、新發(fā)北系、衛(wèi)星農(nóng)場系、裴德系7種土系中均擁有較高的相對豐度，其總相對豐度超過了50%（圖2），這3種菌群為7種均腐土系的優(yōu)勢菌群，但在組成比例上有一定的差異。與其他7種土系相比，明水系細(xì)菌群落中綠灣菌門（Chloroflexi）相對豐度達(dá)9.67%，與變形菌門、放線菌門為該土系的主要優(yōu)勢菌群；而酸桿菌門在明水系中的群落相對豐度僅為5.48%，在其他7類均腐土系中均超過8%，最高達(dá)28.57%。變形菌門在春雷南系中的相對豐度最高，達(dá)45.78%。放線菌門在明水系中的相對豐度達(dá)24.58%，而在大西江系中只有12.48%?？傮w來看，均腐土8個土系細(xì)菌門主要優(yōu)勢菌群僅變形菌門表現(xiàn)為干潤均腐土高于濕潤均腐土。

圖2 均腐土細(xì)菌群落在門水平上的組成和相對豐度

對于屬水平下細(xì)菌的分類組成和豐度分析能更好地為細(xì)菌門類提供完整信息，在屬水平下（圖3），共檢測到497個不同細(xì)菌屬，其中檢出豐度前10的細(xì)菌屬中，除未知菌屬外主要存在5種主要優(yōu)勢菌屬：鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、RB41、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、念 珠 菌 屬（Candidatus_Udaeo-bacter）。均腐土8個土系中，富牧西系鞘氨醇單胞菌屬、RB41的相對豐度均大于5%，但其他細(xì)菌屬均較低。春雷南系鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度達(dá)到12.25%。保國系鞘氨醇單胞菌屬、RB41的相對豐度分別達(dá)到11.13%和6.64%。明水系鞘氨醇單胞菌屬達(dá)10.44%。大西江系鞘氨醇單胞菌屬、節(jié)桿菌屬分別達(dá)到5.77%和7.96%。新發(fā)北系各細(xì)菌屬均較低。衛(wèi)星農(nóng)場系鞘氨醇單胞菌屬的豐度達(dá)7.64%，裴德系達(dá)14.27%。對比土系間細(xì)菌屬水平相對豐度關(guān)系發(fā)現(xiàn)，上述優(yōu)勢菌群中各土系間均呈現(xiàn)顯著差異；總體來看，均腐土8個土系鞘氨醇單胞菌屬、RB41均表現(xiàn)為干潤均腐土高于濕潤均腐土。

圖3 均腐土細(xì)菌群落在屬水平上的組成和相對豐度

將24個樣品的3個重復(fù)合并后，基于bray- curtis距離均腐土不同亞綱8個土系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的樣品熱圖分析如圖4所示。均腐土不同亞綱分別聚為一類，其中干潤均腐土聚為一類，濕潤均腐土聚為一類。說明不同亞綱細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

圖4 均腐土細(xì)菌樣品豐度熱圖

2.5 均腐土細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

均腐土的細(xì)菌群落不僅受生物性質(zhì)的影響，對于土壤環(huán)境因子的影響也至關(guān)重要。利用 Mental test分 析 發(fā) 現(xiàn)，pH、EX-Ca、EX-Mg、TP、CEC、SOC與均腐土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成顯著相關(guān)（P<0.05），因此，為了進(jìn)一步了解驅(qū)動均腐土細(xì)菌群落發(fā)生變化的主要影響因素，利用RDA分析發(fā)現(xiàn)，土壤pH值為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子，其中，EX-Ca、pH、CEC為驅(qū)動干潤均腐土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要影響因素，EX-Mg、SOC、TP為驅(qū)動濕潤均腐土細(xì)菌群落發(fā)生變化的主要影響因素。

表5 均腐土環(huán)境因子與細(xì)菌群落 組成間關(guān)系的Mental test結(jié)果

圖5 均腐土樣品細(xì)菌群落與化學(xué)性質(zhì)的RDA分析

3 討論

道庫恰耶夫認(rèn)為，土壤的成土過程總是由母質(zhì)、氣候、時間、生物等因素相互作用而形成的，其中生物因素在土壤的成土過程中起著至關(guān)重要的作用。而威廉斯卻認(rèn)為，土壤的五大成土因素中，土壤化學(xué)性質(zhì)為主要影響因素［27］。本研究中，均腐土不同亞綱的化學(xué)性質(zhì)有明顯差異，這可能與均腐土不同的母質(zhì)與成土條件所處的環(huán)境有關(guān)，具體的研究還需深入進(jìn)行。不同的土壤類型也會對土壤微生物造成影響。唐杰等［28］對不同若爾蓋濕地4種不同土壤類型細(xì)菌多樣性的研究表明，微生物數(shù)量總體上隨著土壤類型的變化而變化。張崇邦 等［29］對天臺山8種土壤類型的微生物區(qū)系研究也表明，微生物數(shù)量、細(xì)菌群落的組成和多樣性與土壤類型密切相關(guān)。Xu等［30］對不同土壤類型大豆根際細(xì)菌群落影響研究表明，大豆根際土壤細(xì)菌群落的多樣性由土壤類型決定。本研究中，均腐土不同亞綱8個土系的α-多樣性不同，細(xì)菌類群多樣性均表現(xiàn)為干潤均腐土高于濕潤均腐土，表明不同的土壤類型能夠影響土壤微生物群落。

本研究對均腐土不同亞綱8個土系的細(xì)菌群落組成在門、屬和OTU水平進(jìn)行了分析，在8個土系中均存在較為一致的優(yōu)勢菌群。而細(xì)菌菌群豐度相對較低的在均腐土中所占的比例和種類均表現(xiàn)出一定的差異。通過對門水平細(xì)菌群落組成研究發(fā)現(xiàn)，在不同亞綱8個土系的群落組成中豐度較高的有變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠灣菌門（Chloroflexi），這4類細(xì)菌為大多數(shù)均腐土綱中的優(yōu)勢菌群［31-32］。劉紅梅等［32］研究發(fā)現(xiàn)變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠灣菌門大量出現(xiàn)在暗栗鈣土（在中國土壤系統(tǒng)分類中也屬于均腐土綱）中，這也與本研究結(jié)果類似，說明類似的均腐土生境中細(xì)菌群落的分布特征也具有一定的相似性，同時表明此類細(xì)菌群落在均腐土土壤生境中至關(guān)重要，對保持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性有重要作用。此外，通過屬水平的群落組成研究發(fā)現(xiàn)，在不同亞綱8個土系的群落組成中具有降解土壤有毒物質(zhì)的鞘氨醇單胞菌屬、RB41、節(jié)桿菌屬，具有土壤污染物降解功能的芽單胞菌屬、念珠菌屬相對豐度較高，說明均腐土中存在一些對土壤修復(fù)有特殊功能的菌屬，但這尚需進(jìn)一步的研究。另外，對不同亞綱樣品熱圖分析發(fā)現(xiàn)，干潤均腐土和濕潤均腐土在聚類圖譜中被分別單獨(dú)聚為一類，表明即使是同一土綱下的土壤類型，不同亞綱細(xì)菌群落的組成也發(fā)生了明顯 分異。

近年來，關(guān)于土壤化學(xué)性質(zhì)在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)形成中的驅(qū)動作用得到了充分論證［33-34］。如張小青［35］對荒漠土壤細(xì)菌群落研究表明，pH、TN和TC是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子，侯建偉等［36］對貴州黃壤的細(xì)菌群落研究表明，土壤全氮、C/N、pH、有效磷和CEC對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化貢獻(xiàn)較大，且TN與pH為主導(dǎo)環(huán)境因子，Shen等［37］和Zhang等［38］對不同海拔梯度土壤細(xì)菌群落研究表明，土壤pH為決定土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因素。本研究發(fā)現(xiàn)，pH、EX-Ca、EX-Mg、TP、CEC、SOC是均腐土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要影響因子，且pH值為影響均腐土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子，這與前人的研究結(jié)果相同［38］。其中，pH、EX-Ca、CEC為驅(qū)動干潤均腐土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要影響因素，EX-Mg、SOC、TP為驅(qū)動濕潤均腐土細(xì)菌群落發(fā)生變化的主要影響因素，說明不同土壤類型土壤化學(xué)性質(zhì)的變化是引起土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生分異的主要驅(qū)動 因素。

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，干潤均腐土細(xì)菌多樣性均高于濕潤均腐土；同時，通過對均腐土不同亞綱8個土系細(xì)菌群落組成的分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）為富牧西系、春雷南系、保國系、大西江系、新發(fā)北系、衛(wèi)星農(nóng)場系、裴德系7種均腐土系的優(yōu)勢菌群。明水系以綠灣菌門、變形菌門、放線菌門為主要優(yōu)勢菌群。屬水平上，均腐土各土系的群落差異較大。均腐土不同亞綱8個土系土壤細(xì)菌群落主要分為兩類，干潤均腐土為一類，濕潤均腐土為一類；對細(xì)菌群落與環(huán)境因子相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，pH、EX-Ca、EX-Mg、TP、CEC、SOC是均腐土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要影響因子；此外，RDA分析發(fā)現(xiàn)，pH值為影響均腐土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子。而pH、EX-Ca、CEC為驅(qū)動干潤均腐土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要影響因素，EX-Mg、SOC、TP為驅(qū)動濕潤均腐土細(xì)菌群落發(fā)生變化的主要影響因素。