不同激素配比下楊樹組培體系對比

王星斗，王升級，黃娟娟，樊 艷，郭聰慧，韓有志

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西太谷030801）

楊樹（Populus L.）屬于楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus）植物，是世界范圍分布最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的樹種之一，其被廣泛應(yīng)用于生態(tài)保護(hù)及工業(yè)用材等領(lǐng)域[1]。自 2004 年毛果楊（Populus trichoarpa）的全基因組序列被發(fā)表以來，楊樹便成為研究林木分子育種的模式植物[2]，而楊樹的組織培養(yǎng)是楊樹分子育種的重要前提。目前，越來越多的學(xué)者開始以楊樹為研究材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子等分子方面的研究，對轉(zhuǎn)基因楊樹在抗旱、抗鹽堿和抗病蟲害方面作出了很多貢獻(xiàn)[3-6]，使楊樹組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)在轉(zhuǎn)基因前期顯得尤為重要。

自20 世紀(jì)60 年代以來，楊樹組織培養(yǎng)體系得到了迅速發(fā)展。1964 年，國外學(xué)者M(jìn)AHTE[7]以三倍體美洲山楊（Populus tremuloides）莖段為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)，獲得了根和莖，但未獲得完整的植株再生體系。1968 年，WOLTER[8]同樣以三倍體美洲山楊為試驗材料，在培養(yǎng)基中加入植物生長素，成功誘導(dǎo)出根。20 世紀(jì)70 年代，我國學(xué)者開始對楊樹進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，1979 年，李春啟等[9]以山新楊（Populus davidiana×Populus bollena）枝上的腋芽作為外植體，通過初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)及生根培養(yǎng)，最終獲得了完整的植株，并被移栽到土壤中成活。2010 年，楊林娜等[10]以白楊新雜種I-101×84K楊為材料，通過優(yōu)化腋芽最佳增殖培養(yǎng)基、最佳生根培養(yǎng)基，建立了其高效的再生體系。2015 年，馬寧[11]以新疆楊（Populus bolleana Lauche）等 4 個品種作材料，建立了高效的再生體系。2019 年，孫紅英等[12]以中紅楊（Populus×euramericana 'zhonghong'）組培苗的葉片為試驗材料，分化不定芽，獲得了完整的植株。至今，我國的楊樹組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)達(dá)到了一定的水平，很多學(xué)者建立了不同派系和不同樹種的離體再生體系，為我國楊樹組織培養(yǎng)及分子水平的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。然而，不同氣候條件及地理區(qū)域?qū)е虏煌に嘏浔葪l件下，楊樹的組織培養(yǎng)體系存在較大差異。

為獲得最適合山西省氣候條件的楊樹組織培養(yǎng)體系，本研究通過對比分析7 種楊樹愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基及6 種生根培養(yǎng)體系，旨在篩選出最適合愈傷組織誘導(dǎo)及根系組織分化的條件，為山西省乃至黃土高原地區(qū)楊樹快繁及其分子育種提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗以生長狀況良好的 84K 楊（Populus abla×Populus glandulosa）為材料。剪取山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院苗圃中生長狀況良好的1 年生84K 楊枝條，用軟毛毛刷在流動的自來水中刷干凈枝條，以去除附著在外植體表面的浮塵和部分細(xì)菌，然后用洗衣粉水浸泡30 min[13]，流水沖洗1 h[14]；在超凈工作臺中用75%的酒精浸泡消毒20 s，用0.1%的升汞消毒5 min，用無菌水清洗5～6 次（以外植體無升汞殘留為止）；用無菌濾紙將水吸干，獲得無菌外植體材料。將獲得的外植體材料取帶腋芽的莖段置于MS 培養(yǎng)基中接種擴(kuò)繁，獲得組培苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 生根組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別以1/2 MS（蔗糖，20 g/L）和 MS（蔗糖，30 g/L）為基本培養(yǎng)基，加入不同配比激素，瓊脂7.5 g/L，調(diào)節(jié)pH 值至5.8～6.0，煮沸，分裝后在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min。生根培養(yǎng)基對比分析A～F 共6 種激素配比（表1），愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基對比分析A～G 共 7 種激素配比（表 2）。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)試驗 取4～6 周苗齡的組培苗，于超凈工作臺中除頂芽外剪切第3～6 片葉片，去掉葉片的尖端和葉柄，在主葉脈用無菌手術(shù)刀劃長為1～2 cm 的創(chuàng)口，將葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（表 2），置于（24±1）℃、光暗周期 16 h/8 h、光照強(qiáng)度2 000 lx[15]的溫室內(nèi)培養(yǎng)。每組愈傷組織試驗設(shè)4 個重復(fù)，每個重復(fù)接種5 片葉片。

1.2.3 生根培養(yǎng)試驗 取4～6 周苗齡1.1 獲得的組培苗，于超凈工作臺中將其頂芽接種于生根培養(yǎng)基中（表 1），置于溫度為（24±1）℃、光周期為 16 h/8 h（光/暗）、光照強(qiáng)度為2 000 lx 的溫室內(nèi)培養(yǎng)。每組生根試驗設(shè)置5 個重復(fù)，每個重復(fù)接種2 株幼苗。

1.2.4 煉苗試驗 生根培養(yǎng)40 d，將組培苗取出，在流水下洗凈根部附著的培養(yǎng)基[16]，去掉除頂端2～3 片外所有葉片，進(jìn)行水培，設(shè)置水培時間分別為 5、7、10、15、20 d；之后將幼苗移栽至無菌土壤基質(zhì)中，觀察其生長情況。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生長指標(biāo)測定 生根培養(yǎng)40 d 后，將植株從培養(yǎng)瓶中取出，在流水下輕柔地洗凈根部附著的培養(yǎng)基，測定植株株高和主根長。將植株根、莖、葉分別收集至恒溫干燥箱中，于105 ℃殺青15 min，85 ℃持續(xù)烘干至恒質(zhì)量，測定生物量。

1.3.2 淀粉和可溶性糖含量的測定 將植株根、莖、葉混合，在研缽中研磨至無明顯大顆粒物，過0.149 mm 篩2 次，使所有材料充分粉碎混合，使用硫酸蒽酮比色法測定植株淀粉含量和可溶性糖含量[17-18]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均平行測定3 次，采用Photo Shop CS6 軟件制圖；采用IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行分析，顯著性分析采用ANOVA（鄧肯氏）多重差異分析方法（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)情況分析

表3 不同激素濃度處理誘導(dǎo)愈傷組織生長情況分析

84K 楊葉片不同激素濃度培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)情況顯示，A1 組培養(yǎng)基接種葉片卷曲嚴(yán)重，愈傷組織呈現(xiàn)赤紅色，分化程度較高，不定芽葉緣呈紅色，不定芽數(shù)最少；B1 組培養(yǎng)基接種葉片發(fā)黃，間白披綠，愈傷組織呈現(xiàn)淡紅色，不定芽葉尖呈紅色，其不定芽數(shù)偏少；C1 組培養(yǎng)基接種葉片卷曲呈現(xiàn)鮮綠色，愈傷組織呈紅褐色，不定芽嫩綠，且不定芽出芽數(shù)偏多；D1 組培養(yǎng)基接種葉片呈黃綠色，愈傷組織呈淡黃色，不定芽泛紅，不定芽葉尖呈紅色，其不定芽出芽數(shù)較少；E1 組培養(yǎng)基接種葉片呈綠色，且高度分化，愈傷組織呈紅褐色，不定芽葉尖泛紅，其不定芽出芽數(shù)較多；F1 組培養(yǎng)基接種葉片呈黃綠色，葉緣泛紅，愈傷組織呈褐色，不定芽葉尖發(fā)紅，其不定芽出芽數(shù)最高；G1 組培養(yǎng)基（MS 對照組）接種葉片黃綠發(fā)白，無愈傷組織誘導(dǎo)，葉片均被誘導(dǎo)生根（表3）。

2.2 生根培養(yǎng)情況分析

2.2.1 誘導(dǎo)生根情況 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 結(jié)果表明（表4），A 組培養(yǎng)基生根數(shù)最少；B 組培養(yǎng)基生根數(shù)最多；C、D、E、F 各組生根數(shù)之間差異不明顯。

表4 不同激素濃度處理誘導(dǎo)生根情況分析

生根誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d，A 組培養(yǎng)基生根較快，主根粗壯但數(shù)量不多，幼苗葉片膨大，植株開始拔高生長；B 組培養(yǎng)基一級根較多但細(xì)，側(cè)根等二級根數(shù)量很少，呈放射狀分布，葉片膨大但無A 組明顯，植株拔高生長；C 組培養(yǎng)基主根生長緩慢但粗壯，在主根周圍開始萌生側(cè)根，植株未拔高生長；D 組培養(yǎng)基根系生長情況與C 組相似，培養(yǎng)15 d 根系生長最慢，但主根粗壯；E 組培養(yǎng)基根系生長情況均衡良好，培養(yǎng)15 d 植株生長較好，根系生長情況較均衡；F組培養(yǎng)基（對照組）生根較快但是根系瘦弱，主根細(xì)長，培養(yǎng) 15 d 植株較 C、D 組高，幼苗瘦弱（圖 1）。

2.2.2 生長指標(biāo)分析 生根培養(yǎng)40 d 后，對比分析不同激素配比植株生長情況可知，E 組培養(yǎng)基的株高最大，為 10.34 cm，D 組最小，為 8.50 cm，但各組間差異并不顯著；A 組培養(yǎng)基處理的主根最長，為 24.04 cm，顯著大于 C、D、E、F 組處理（表 5）。

生長情況分析結(jié)果表明，A 組植株生長情況較好，側(cè)根較多且延長根生長較快，植株較為粗壯；B組植株根系較為健壯，而且延長根居多；C 組植株粗壯矮小，根系發(fā)達(dá)且呈放射狀分布，推測其生長可能受到了高濃度生長激素的抑制；D 組植株與C組類似，根系較為發(fā)達(dá)且呈放射狀生長；E 組各方面生長情況比較均衡，葉片翠綠膨大，而且植株高、通直，根系較為粗壯；F 組（CK）植株較高而且筆直，通體瘦弱，葉片枯黃，根較長且纖細(xì)，生長情況不佳（圖 2）。

表5 不同激素處理40 d 苗齡生長量和根長分析 cm

2.2.3 生物量分析 生物量分析結(jié)果表明（表6），A 組的根、莖、葉平均干質(zhì)量在所有誘導(dǎo)生根處理中較為良好，而且平均葉干質(zhì)量較高，說明A 組激素濃度在促進(jìn)根部生長的同時，也促進(jìn)了地上部莖葉的生長；B 組葉平均干質(zhì)量最高，莖平均干質(zhì)量較高，情況與A 組類似；C 組根平均干質(zhì)量較高，莖、葉平均干質(zhì)量在各組中最高，可見，雖然C 組生長緩慢，但是生物量積累的量比較高；D 組根平均干質(zhì)量最高，但莖、葉平均干質(zhì)量最低，說明D 組地下部分的生長情況較地上部分要好；E 組植株生長情況一般，根、莖、葉平均干質(zhì)量都略小于A 組；F組（CK）植株通體瘦弱，根部生長不健壯，植株整體情況最差。

表6 不同激素濃度處理40 d 苗齡根、莖、葉干質(zhì)量分析 g

2.2.4 不同激素濃度處理植株可溶性糖和淀粉含量分析 從表7 可以看出，A 組的可溶性糖含量最高，可知其進(jìn)行光合作用在各組中較強(qiáng)，可能是由于A 組生長情況良好，平均葉面積較大，其體內(nèi)葉綠素含量較多，所以糖的合成量較大，且A 組淀粉含量較高，說明其細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的Pi（磷酸基團(tuán)）濃度較低，使淀粉在葉綠體中大量積累，該組激素配比最適合84K 楊生根誘導(dǎo)；B 組可溶性糖含量較低，且淀粉含量也較低，說明其體內(nèi)葉綠素含量較低，多數(shù)有機(jī)物被消耗用于其他生理途徑；C 組淀粉和可溶性糖含量與B 組類似，但其根系較為茂盛，其光合產(chǎn)生的能量全部用來供給根、莖、葉的發(fā)育；D 組可溶性糖含量在各組中最低，淀粉含量最高，說明其生長過程中干物質(zhì)的量積累大于生長發(fā)育，植株健壯；E 組可溶性糖和淀粉含量均略低于A 組，說明生長發(fā)育情況較 A 組略差；F 組（CK）可溶性糖含量略高，但淀粉含量在各組中最低，且植株瘦弱，葉片發(fā)黃，植株生長發(fā)育情況最差。

表7 不同激素濃度處理40 d 苗齡可溶性糖和淀粉含量分析 %

2.3 煉苗情況分析

表8 不同水培時間處理植株生長情況分析

煉苗試驗結(jié)果顯示（表8），水培5 d 后移栽至土壤基質(zhì)中的植株生長情況差，由于水培時間太短，植株沒有適應(yīng)外界環(huán)境條件且未生出新的根系，過早地接觸基質(zhì)使植株難以適應(yīng)，影響其存活；水培7 d 后，植株根部有新生一級根長出，移栽至土壤基質(zhì)后植株生長狀況不佳，說明植株根部發(fā)育不夠健全；水培10 d 后，植株生長情況良好，新的根系開始生長，有利于植株適應(yīng)新的環(huán)境，移栽至土壤基質(zhì)后植株生長狀況較好、生長速度較快；水培15 d 后，植株根部發(fā)育良好，有大量的二級根生成，且移栽至土壤基質(zhì)后生長速度最快，植株葉片鮮綠，長勢最好；水培20 d 后，有大量新的一、二級根生成，但是植株莖部開始木質(zhì)化，葉片變老，移栽至土壤基質(zhì)后植株生長較15 d 慢。因此，可以推測煉苗最適水培時間為（15±1）d；之后將植株移栽至草炭∶蛭石∶珍珠巖＝1∶1∶1 的基質(zhì)中培養(yǎng)[19]，待植株高度生長至30～50 cm 后便可移栽到苗圃中。

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，適當(dāng)?shù)闹参锷L調(diào)節(jié)劑對于培養(yǎng)植株的優(yōu)良性狀以及相關(guān)的遺傳轉(zhuǎn)化很有必要。楊樹組織培養(yǎng)基中常用的生長素有2，4-D、NAA、IAA、IBA，能促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂，常用于幼苗生根，與細(xì)胞分裂素配合用于不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)。6-BA、KT、TDZ 等細(xì)胞分裂素能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂分化，常用作誘導(dǎo)腋芽及不定芽的形成。除生長素與細(xì)胞分裂素外，其他植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物生長也有一定的影響，如赤霉素和脫落酸等。不同配比植物生長調(diào)節(jié)劑，對于植株不同部位的生長會有不同的促進(jìn)或抑制作用，可根據(jù)不同培養(yǎng)需求配置植物生長調(diào)節(jié)劑的含量[20]。

近年來，關(guān)于楊樹組織培養(yǎng)體系建立及優(yōu)化的研究較多，但是不同氣候條件及地理區(qū)域條件下，楊樹組織培養(yǎng)體系存在較大差異。山西省位于黃土高原地區(qū)，全省氣候冬季較長且寒冷干燥，夏季炎熱雨水集中，春季氣候多變且風(fēng)沙較多，秋季短暫且晝夜溫差大。為篩選最適合山西省氣候條件的楊樹組織培養(yǎng)體系，本試驗對比分析了7 種楊樹愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)體系及6 種生根培養(yǎng)體系，結(jié)果表明，最適84K楊葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS＋0.05 mg/L NAA＋0.08 mg/L TDZ，愈傷組織的生長較慢，一般接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上7 d 才開始長出愈傷組織。通過多次試驗發(fā)現(xiàn)，一般出現(xiàn)愈傷的部位都在葉片創(chuàng)口處的葉脈上，因此，若想得到較多的愈傷組織，對葉片的多創(chuàng)口進(jìn)行處理是必要的。通過愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生腋芽，將其接種到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根，可以進(jìn)一步得到優(yōu)質(zhì)的植株。在植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)環(huán)境也會在一定條件下影響植物組織的形態(tài)和發(fā)育[21]。本研究通過試驗得出，在植物葉片的愈傷組織誘導(dǎo)過程中所產(chǎn)生的褐化大多是由于在用接種器械對葉片做切割和創(chuàng)口處理時，過多地破壞了葉面的細(xì)胞，因此，在處理葉片時應(yīng)小心處理。最適84K 楊的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.1 mg/L IBA＋0.01 mg/L NAA。玻璃化苗是由植物在組織培養(yǎng)過程中水分?jǐn)z入過多引起的，可以通過控制外界的環(huán)境條件包括通風(fēng)處理、適當(dāng)提高培養(yǎng)室溫度、加強(qiáng)光照、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH、適當(dāng)提高培養(yǎng)基中凝固劑含量以及適當(dāng)提高蔗糖濃度等來降低植物在組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的玻璃化苗現(xiàn)象[22]。此外，組織培養(yǎng)過程中特別需要注意外植體和接種器械的滅菌消毒以及無菌規(guī)范操作，只有保證規(guī)范操作和器械消毒，才能使后續(xù)的植物組織培養(yǎng)試驗順利進(jìn)行。

在煉苗過程中需要注意，水培過程中須保證環(huán)境空氣濕度在60%～70%，這樣的環(huán)境更有利于幼苗發(fā)育和生根；且生根移栽的過程中使用無菌基質(zhì)幼苗成活率較高，若基質(zhì)不進(jìn)行滅菌處理，會有害蟲大量繁殖，影響植株正常生長發(fā)育。另外，有研究表明[23]，在煉苗過程中水培培養(yǎng)基中加入適量植物激素更有利于植物幼苗的生長發(fā)育。