不同生長(zhǎng)階段靈芝子實(shí)體和孢子粉活性成分分析

李欽艷，鐘瑩瑩，李 忠，肖自添，古培總，何煥清，鐘小云，彭洋洋

（1梅州市農(nóng)林科學(xué)院微生物研究所，廣東 梅州 514071；2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省草菇科技創(chuàng)新中心/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

0 引言

靈芝(Ganoderma lingzhi)為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬食藥用菌，是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥材[1]，并于2019年11月25日被國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)和國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局認(rèn)定為醫(yī)食同源物質(zhì)，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。靈芝化學(xué)成分復(fù)雜，含有多種活性物質(zhì)，如多糖、三萜類、甾醇、腺苷、氨基酸、脂肪類等[2]。其中，多糖和三萜類化合物是靈芝的主要活性成分，是孢子粉和靈芝子實(shí)體的重要生物活性物質(zhì)，其含量可作為衡量靈芝質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)[3]，多糖的生物活性適用于提高免疫力、抗腫瘤和抗衰老[4]，三萜類的生物活性適用于抗炎、保肝護(hù)肝[5-6]。蛋白質(zhì)是靈芝除靈芝多糖和三萜外的又一重要活性物質(zhì)，具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]等作用[10]，靈芝中的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(fungai immunomodulatory protein，F(xiàn)IP)Ling Zhi-8有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、抗炎、抗過(guò)敏、抗排斥、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖等作用[11]。靈芝中有近20種甾醇類，其骨架分為麥角甾醇類和膽甾醇類2種類型，靈芝膽甾醇類化合物有神經(jīng)保護(hù)作用[11]。腺苷也是靈芝主要活性成分之一，屬于核苷類化合物，具有抑制體內(nèi)血小板聚集，提高血紅蛋白含量，加速血液循環(huán)，有效降低血液粘稠度，對(duì)心血管系統(tǒng)有廣泛的調(diào)節(jié)作用[12]。靈芝的脂肪類物質(zhì)同樣具有重要的生理功能，主要物質(zhì)脂肪酸能提供能量、參與細(xì)胞膜組織結(jié)構(gòu)等，還具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗病毒等功效，特別是不飽和脂肪酸，在抗腫瘤、降低心腦血管疾病、延緩免疫功能衰退等方面有重要作用[13-14]。靈芝子實(shí)體生長(zhǎng)經(jīng)歷菌蕾期、菌柄分化期、子實(shí)體分化期、子實(shí)體成熟期、孢子成熟期、孢子收獲后期等階段，其活性成分含量會(huì)因不同生長(zhǎng)階段、栽培環(huán)境、品種、栽培配方、培養(yǎng)方式、采收時(shí)間等而變化[6,14-18]。研究不同生長(zhǎng)發(fā)育階段靈芝子實(shí)體與孢子粉活性成分含量的相關(guān)性，探索靈芝及孢子粉的最佳采收時(shí)期，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)和消費(fèi)指導(dǎo)具有十分重要的意義。

前人的研究大多集中在不同生長(zhǎng)階段靈芝子實(shí)體多糖、三萜類化合物的含量、組成等變化，或者單純比較靈芝子實(shí)體與孢子粉的差異等，未見(jiàn)根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況，對(duì)靈芝子實(shí)體與孢子粉采收時(shí)間進(jìn)行綜合分析，未見(jiàn)報(bào)道不同收集時(shí)期孢子粉的活性成分含量分析。

本研究以梅州本地主栽品種‘梅靈1號(hào)’靈芝為研究材料，結(jié)合當(dāng)?shù)卦耘嗔?xí)慣和栽培方法對(duì)不同階段靈芝子實(shí)體和孢子粉活性成分進(jìn)行研究。旨在通過(guò)分析靈芝不同生長(zhǎng)階段子實(shí)體及不同收粉時(shí)期孢子粉的活性成分，為靈芝子實(shí)體和孢子粉最佳采收期的確定提供理論依據(jù)，也為消費(fèi)者選擇相關(guān)靈芝產(chǎn)品提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

‘梅靈1號(hào)’（梅州本地品種）靈芝菌株來(lái)源于梅州市農(nóng)林科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。試驗(yàn)于2019年6—10月在梅州市農(nóng)林科學(xué)院微生物研究所靈芝示范基地進(jìn)行，靈芝子實(shí)體和孢子粉由該基地栽培采收獲得。孢子粉經(jīng)專用破壁機(jī)低溫破壁處理。

1.2 試驗(yàn)材料

雜木屑、干玉米粒、馬鈴薯、麩皮、玉米粉、石灰、石膏等均購(gòu)自當(dāng)?shù)亟?jīng)銷商。栽培原料符合《食用菌栽培基質(zhì)安全技術(shù)要求(NY 5099—2002)》，不使用任何添加劑和殺菌、殺蟲(chóng)劑等。

1.3 試驗(yàn)配方

1.3.1 母種配方 馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL，pH自然。

1.3.2 原種培養(yǎng)基配方 干玉米粒（不粉碎）99%、石膏1%，含水量約60%，pH 8。

1.3.3 栽培種及栽培菌包配方 雜木屑78%、玉米粉6%、麩皮15%、石膏粉1%，含水量約60%，pH 8。

1.4 栽培方法

1.4.1 子實(shí)體培養(yǎng) 采用常規(guī)靈芝室內(nèi)代料栽培方法，具體操作參照文獻(xiàn)[19]。原材料混勻后調(diào)整含水量至60%，試驗(yàn)選用規(guī)格為17 cm×35 cm、厚5 mm的聚丙烯塑料袋，每袋裝培養(yǎng)料（干重計(jì)）350 g，裝好后用常壓滅菌方式滅菌，保持100℃下恒溫16～18 h。滅菌后冷卻至室溫接種，接種時(shí)嚴(yán)格按無(wú)菌操作規(guī)程進(jìn)行。接種后將菌包搬入培養(yǎng)室進(jìn)行墻式排放，自然溫度條件下培養(yǎng)發(fā)菌，室內(nèi)保持黑暗，早上、中午、晚上各通風(fēng)1 h，培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)受污染的菌包及時(shí)清理出培養(yǎng)室，菌絲滿菌袋時(shí)間約為45天。待菌絲長(zhǎng)滿菌包進(jìn)行出芝管理。用小刀在菌袋的扎口上方開(kāi)一個(gè)十字形的小口，靈芝子實(shí)體將由十字形小口長(zhǎng)出。開(kāi)好口后將菌袋均勻擺放到出菇房，溫度22～28℃，空氣相對(duì)濕度85%～95%，出菇房經(jīng)常通風(fēng)換氣，保持新鮮的氧氣供應(yīng)。

1.4.2 孢子粉收集 試驗(yàn)菌袋上長(zhǎng)出的靈芝子實(shí)體邊沿的金黃色轉(zhuǎn)為棕紅色時(shí)，將菌包清洗干凈，選擇長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)?shù)撵`芝同時(shí)上架（靈芝孢子粉收集培養(yǎng)架采用杉木制作，多層式培養(yǎng)架規(guī)格為長(zhǎng)×寬×高=2 m×1 m×2 m，分3層，層間距為60 cm）。上架完畢后用白紙進(jìn)行密封，采用常規(guī)方法進(jìn)行產(chǎn)粉管理，溫度22～28℃，空氣相對(duì)濕度85%～95%，經(jīng)常通風(fēng)換氣，保持新鮮的氧氣供應(yīng)。

1.5 樣品采集

1.5.1 靈芝子實(shí)體采集 共采集4個(gè)不同生長(zhǎng)階段的靈芝子實(shí)體。（1）菌蕾期子實(shí)體，剛剛長(zhǎng)出菌袋切口的幼嫩靈芝（圖1a）；（2）成熟期子實(shí)體，子實(shí)體邊沿的金黃色轉(zhuǎn)為棕紅色時(shí)，剛剛成熟但未彈粉的子實(shí)體（圖1b）；（3）彈粉期子實(shí)體，上架20天收集孢子粉（頭道孢子粉）后的子實(shí)體（圖1c）；（4）彈粉后期子實(shí)體，上架40天，即頭道孢子粉收集后重新上架培養(yǎng)20天，再收集孢子粉（二道孢子粉）后的子實(shí)體（圖1c）。

1.5.2 靈芝孢子粉采集 按照梅州本地的常規(guī)靈芝孢子粉收粉方法，有一次收集法和二次收集法2種。一次收集法是把靈芝放入收集架里，持續(xù)等到孢子粉彈射完畢后一次性收集孢子粉。二次收集法是孢子粉彈射一定時(shí)間收集孢子粉后，將靈芝重新放回收集架，再培養(yǎng)，再收集。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的上架彈粉階段共計(jì)40天，共采集3種靈芝孢子粉樣品。（1）上架彈粉20天即開(kāi)架收集孢子粉，此階段收集的孢子粉稱為頭道孢子粉；（2）頭道孢子粉收集后重新上架密封，繼續(xù)彈粉20天，開(kāi)架收集孢子粉，此階段收集的孢子粉稱為二道孢子粉；（3）產(chǎn)孢40天孢子粉，收集上架密封后持續(xù)彈粉40天的孢子粉。所有靈芝孢子粉樣品都經(jīng)相同條件破壁后再進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)。

圖1 靈芝子實(shí)體

1.6 營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)

成分分析委托中國(guó)廣州分析測(cè)試中心完成。靈芝多糖、三萜及甾醇類化合物測(cè)定方法參照《中國(guó)藥典（2015年版一部）》靈芝項(xiàng)下；腺苷測(cè)定方法參照NY/T 2116—2012；蛋白質(zhì)測(cè)定方法參照GB 5009.5—2016第一法；脂肪測(cè)定方法參照GB 5009.6—2016第一法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品多糖含量比較

從圖2可以看出，不同生長(zhǎng)階段靈芝子實(shí)體的多糖含量呈下降趨勢(shì)，菌蕾期含量最高，為0.65%，成熟期子實(shí)體多糖下降為0.43%，彈粉后子實(shí)體多糖含量趨于穩(wěn)定，但顯著低于菌蕾期和成熟期，分別為0.28%、0.27%。孢子粉二次收集法比一次收集法多糖含量高，其中二道孢子粉多糖含量最高，達(dá)0.85%，其次是頭道孢子粉，分別比40天一次性收集的孢子粉多糖含量提高21.43%和18.57%，表明采用二次收集法的孢子粉多糖含量更高，但頭道孢子粉與二道孢子粉多糖含量沒(méi)有顯著差異。此外，孢子粉多糖含量高于子實(shí)體，其中二道孢子粉多糖含量比彈粉后期上架40天子實(shí)體高2倍以上。

圖2 不同樣品多糖含量比較

圖3 不同樣品三萜及甾醇含量比較

2.2 不同樣品三萜及甾醇含量比較

從圖3可以看出，靈芝子實(shí)體的三萜及甾醇含量比較穩(wěn)定，不同階段間沒(méi)有顯著差異，菌蕾期含量為2.2 g/100 g，其余時(shí)期含量均為1.9 g/100 g。不同階段的破壁孢子粉三萜及甾醇含量差別也不大，為12～14 g/100 g，上架收集40天的破壁孢子粉含量最高，達(dá)14 g/100 g，其次為二道孢子粉，一次收集法三萜及甾醇含量高于二次收集法。孢子粉三萜及甾醇含量遠(yuǎn)高于靈芝子實(shí)體，約為靈芝子實(shí)體的6～12倍。

2.3 不同樣品腺苷含量比較

從圖4可以看出，不同生長(zhǎng)階段靈芝子實(shí)體的腺苷含量差異很大，菌蕾期和成熟期的子實(shí)體腺苷含量低于檢測(cè)下限（檢測(cè)下限為10 mg/kg），彈粉后開(kāi)始增加，彈粉期為86.5 mg/kg，彈粉后期為99.2 mg/kg。破壁孢子粉腺苷含量顯著高于子實(shí)體，其中二道孢子粉的腺苷含量最高(214 mg/kg)，二次法收集的孢子粉腺苷含量高于一次法收集的。

2.4 不同樣品蛋白質(zhì)含量比較

從圖5可知，不同生長(zhǎng)階段靈芝子實(shí)體的蛋白質(zhì)含量差異較大，隨著子實(shí)體的生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。幼嫩、未成熟的子實(shí)體蛋白質(zhì)含量高，彈射孢子粉后含量下降明顯。菌蕾期蛋白質(zhì)含量最高(25.5 g/100 g)，彈粉后期降到最低(8.14 g/100 g)，彈粉后子實(shí)體蛋白質(zhì)含量沒(méi)有顯著差異，趨于穩(wěn)定。不同采收期的孢子粉蛋白質(zhì)含量比較穩(wěn)定，分別為16.3、16.1、16.6 g/100 g，沒(méi)有顯著差異，孢子粉蛋白質(zhì)含量高于成熟期的子實(shí)體含量。

圖4 不同樣品腺苷含量比較

2.5 脂肪含量分析

從圖6可知，不同生長(zhǎng)階段靈芝子實(shí)體的脂肪含量較低，且差異不大。不同采收期的破壁孢子粉脂肪含量高且較穩(wěn)定，不同采收期沒(méi)有顯著差異，頭道孢子粉含量最高(34.2 g/100 g)，二次收集法脂肪含量高于一次收集法。孢子粉脂肪含量極顯著高于子實(shí)體含量，約為子實(shí)體的9～13倍。

3 結(jié)論

菌蕾期子實(shí)體活性成分含量高，多糖、三萜及甾醇、蛋白質(zhì)、脂肪含量分別為0.65%、2.2 g/100 g、25 g/100 g、3.1 g/100 g，高于其他時(shí)期子實(shí)體活性成分含量，生產(chǎn)中多余的菌蕾往往被修剪下來(lái)，這些菌蕾可以食用或者作為活性成分提取原材料。

子實(shí)體多糖、蛋白質(zhì)含量隨著子實(shí)體生長(zhǎng)而逐漸降低，三萜及甾醇、脂肪含量比較穩(wěn)定，沒(méi)有顯著變化，腺苷隨著子實(shí)體生長(zhǎng)而增加，在未成熟的靈芝子實(shí)體中未檢出。若不收集孢子粉，靈芝采收時(shí)間可適當(dāng)提前至成熟期（孢子粉未彈射），即子實(shí)體剛剛成熟時(shí)，此時(shí)各種活性成分含量較高。

不同階段破壁孢子粉的多糖、三萜及甾醇、腺苷、脂肪含量均高于靈芝子實(shí)體，其中三萜及甾醇含量約為子實(shí)體的6～12倍，脂肪為9～13倍。

頭道孢子粉、二道孢子粉、上架收集40天孢子粉的多糖、三萜及甾醇、腺苷、脂肪、蛋白質(zhì)等活性成分無(wú)明顯差異，粉碎了靈芝孢子粉市場(chǎng)上關(guān)于頭道孢子粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的謠傳。

4 討論

圖5 不同樣品蛋白質(zhì)含量比較

靈芝子實(shí)體不同生長(zhǎng)階段活性成分的含量和變化一直是人們關(guān)注的問(wèn)題，其受生長(zhǎng)階段、栽培環(huán)境、品種、栽培配方、培養(yǎng)方式、采收時(shí)間等因素影響而變化[6,14-18]，目前并沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)律或者標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)靈芝產(chǎn)品質(zhì)量。筆者首次比較完整地研究了靈芝子實(shí)體不同生長(zhǎng)階段以及孢子粉不同收粉階段主要活性成分的含量和變化規(guī)律。試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）子實(shí)體多糖含量隨著子實(shí)體生長(zhǎng)而降低，菌蕾期最高，彈粉后趨于穩(wěn)定，此結(jié)果與李保明[20]、林應(yīng)興[21]等研究結(jié)果相似，推測(cè)子實(shí)體成熟后大部分多糖轉(zhuǎn)移到孢子粉中。試驗(yàn)結(jié)果也顯示，孢子粉多糖含量明顯高于子實(shí)體。陳軍輝[22]、于華崢[23]等對(duì)靈芝子實(shí)體、菌絲體及孢子粉中多糖成分差異比較研究也表明，靈芝孢子粉多糖含量高于子實(shí)體，與本研究結(jié)果一致。（2）子實(shí)體不同生長(zhǎng)階段三萜含量比較穩(wěn)定，各生長(zhǎng)階段間差異不大，菌蕾期最高。而徐新然等[24]指出，靈芝木段栽培法的總?cè)扑岷吭陟`芝現(xiàn)蕾期、菌蓋形成期變化不明顯，彈孢子粉前期最高（與現(xiàn)蕾期、菌蓋形成期差異不顯著），在彈孢子粉后期顯著降低，此結(jié)果與本試驗(yàn)有一定差異，推測(cè)與靈芝品種、栽培方法、栽培環(huán)境等因素有關(guān)。本試驗(yàn)中孢子粉的三萜與甾醇含量極顯著高于子實(shí)體。譚洪升等[25]采用高氯酸顯色法測(cè)定靈芝子實(shí)體和破壁靈芝孢子粉中的三萜含量，證實(shí)破壁靈芝孢子粉中的三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于靈芝子實(shí)體，與本研究結(jié)果一致；于華崢等[26]通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)靈芝菌絲體、子實(shí)體、孢子粉（未破壁）的三萜含量，顯示子實(shí)體的三萜種類多樣且含量高，菌絲體中三萜主要為靈芝酸S且含量低，未破壁孢子粉中基本檢測(cè)不到靈芝三萜，說(shuō)明孢子粉破壁是三萜類物質(zhì)釋放的關(guān)鍵要素。（3）腺苷含量隨著子實(shí)體生長(zhǎng)而增加，在未成熟的靈芝子實(shí)體中未檢出，孢子粉的腺苷含量顯著高于子實(shí)體。于華崢等[26]研究了靈芝菌絲體、子實(shí)體、孢子粉（未破壁）的三萜含量，結(jié)果顯示只在孢子粉中檢測(cè)到靈芝腺苷。（4）蛋白質(zhì)含量隨著子實(shí)生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，菌蕾期最高，孢子粉含量顯著高于子實(shí)體，于華崢等[26]研究結(jié)果也顯示，孢子粉蛋白質(zhì)含量最高，其次是子實(shí)體，菌絲體含量最低。（5）子實(shí)體脂肪含量較低，孢子粉的脂肪含量高，為子實(shí)體的10倍以上，占靈芝脂肪總量的90%左右，子實(shí)體間不同階段、孢子粉間不同階段均無(wú)顯著差異。孟楠楠等[27]對(duì)6個(gè)靈芝子實(shí)體及破壁孢子粉粗脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行比較，結(jié)果顯示破壁孢子粉粗脂肪含量約為子實(shí)體粗脂肪含量的10倍，子實(shí)體間不同處理、孢子粉間不同處理均無(wú)顯著差異，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 不同樣品脂肪含量比較

菌蕾期多糖、三萜類、蛋白質(zhì)、脂肪等活性成分含量較高，生產(chǎn)中修剪下來(lái)的菌蕾可以進(jìn)一步加工利用。課題組將進(jìn)一步對(duì)不同生長(zhǎng)階段靈芝子實(shí)體、孢子粉的活性成分進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)的初步結(jié)論為開(kāi)發(fā)靈芝產(chǎn)品提供了更有針對(duì)性、更有效、更合理的參考，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)和理性消費(fèi)具有一定的指導(dǎo)作用。