二樣膏對小鼠免疫功能的影響*

王 強，陳彥文，明海霞，高曉蘭，安彩萍

(1.甘肅中醫(yī)學院，甘肅 蘭州730000;2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州730000)

二樣膏是甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院的院內中藥制劑［1］，由止痛膏(批號為甘藥制字 Z04010876，由浙貝母、白芷、生大黃、木香、薄荷水、樟腦、冰片、麝香組成，具有消腫止痛、祛腐生肌功效，)與鐵箍膏(批號為甘藥制字Z04010877，由大青葉、乳香、大黃、膽礬、五倍子、沒藥、黃連、芙蓉葉、黃柏組成，具有消腫拔毒、止痛散結作用)按1∶1混合而成。省內幾家醫(yī)院已有應用鐵箍膏及止痛膏治療早期瘡瘍等疾病數(shù)十年的歷史。我們通過前期研究［2］證明：二樣膏的療效較單獨使用上述兩味藥顯著，未見有明顯的毒性、皮膚刺激性及過敏性，對金黃色葡萄球菌所致的體表軟組織感染具有明顯的抗炎作用，對IL-1α及TNF-α有顯著的影響，但其抗炎作用機制尚不明確。本實驗旨在從免疫學角度對二樣膏的免疫調節(jié)機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康SPF級小鼠，雌雄各半，體質量(25±2)g，由甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(甘)2004-0006。

1.2 藥物、試劑與儀器

二樣膏由甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科提供;環(huán)磷酰胺(CTX)，南京中標晨曦化學技術有限公司產(chǎn)品，批號100234-201004;體積分數(shù)5%雞紅細胞，由甘肅中醫(yī)學院基礎醫(yī)學實驗中心免疫學實驗室提供;四噻唑鹽(MTT，又稱四甲基偶氮唑鹽)美國Sigma公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)，北京青鴻?？萍加邢薰井a(chǎn)品，批號67-68-5;植物血凝素(PHA)，上海市醫(yī)學化驗所產(chǎn)品，批號0707;RPMI-1640細胞培養(yǎng)基，美國 GiBco公司產(chǎn)品，批號1120708;芬蘭MK-3型酶標儀，產(chǎn)地芬蘭;OLMPUS BX60-32FB2-A03型顯微鏡，上海富眾生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;XYJ80-2型電動離心機，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品。

1.3 動物分組與給藥方法

將60只SPF級小鼠分成6組，每組10只，雌雄各半。正常對照組：生理鹽水灌胃5 mL/d，連續(xù)10 d。二樣膏低、高劑量組分別按10.5，42 g/kg劑量(分別相當于人用量的5，20倍)二樣膏灌胃，1次/d，連續(xù)10 d。CTX組：實驗當天腹腔注射80μg/g CTX，同時生理鹽水0.5 mL/d灌胃，連續(xù)10 d。CTX+二樣膏低劑量組：實驗當天腹腔注射CTX 80μg/g，每天按10.5 g/kg二樣膏灌胃，連續(xù)10 d。CTX+二樣膏高劑量組：實驗當天腹腔注射80μg/g CTX，每天按42 g/kg二樣膏灌胃，連續(xù)10 d。

1.4 檢測指標

1.4.1 胸腺指數(shù)與脾指數(shù)

頸椎脫臼處死小鼠，無菌狀態(tài)下解剖，取出胸腺和脾臟，用濾紙吸干血液后稱質量，計算胸腺指數(shù)及脾指數(shù)。胸腺(脾)指數(shù)(mg/g)=胸腺(脾)質量(mg)/小鼠體質量(g)。

1.4.2 吞噬功能

參照文獻［3］方法進行。第10天稱量各組小鼠體質量;然后每只小鼠腹腔注射50 g/L淀粉肉湯1 mL致敏;24 h后，腹腔注射體積分數(shù)為5%雞紅細胞懸液1 mL;4 h后脫臼處死小鼠，并在腹腔注入5 mL冷Hank液，按摩腹部5 min后，解剖小鼠;無菌吸取腹腔液涂片，晾干，甲醇固定5 min，瑞氏染色，鏡檢。在油鏡下觀察，隨機計數(shù)100個吞噬細胞中吞噬雞紅細胞及吞噬的雞紅細胞總數(shù)，并計算巨噬細胞吞噬百分率與吞噬指數(shù)。吞噬率(%)=(100個吞噬雞紅細胞的吞噬細胞數(shù)/100個吞噬細胞)×100%;吞噬指數(shù)=100個吞噬細胞中吞入的雞紅細胞數(shù)/100吞噬細胞。

1.4.3 T 細胞增殖反應

MTT法［4］測定。無菌狀態(tài)下取脾臟制備小鼠脾細胞懸液，用RPMI-1640不完全營養(yǎng)液洗滌3次;3000 r/min離心;用完全營養(yǎng)液配成3.5×106mL;臺盼藍染色檢測細胞存活率＞95%;取100 mL加入96孔細胞培養(yǎng)內(每孔含3.5×105個細胞，每個樣品做3個復孔);加入240 mg/L的PHA 20 mL(使終濃度為40 mg/L，同時設不加PHA對照孔)，置37℃、體積分積5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;每孔加入MTT 10 mL(5 g/L)，培養(yǎng)4 h，離心，棄上清液;加入體積分數(shù)30%DMSO 100 mL充分振蕩后靜置20 min;用酶標儀于吸光度在0～0.7范圍、波長570 nm處測OD值，結果以3個復孔的平均值±標準差表示。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 二樣膏對小鼠胸腺及脾臟的影響

CTX組小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均較正常對照組低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明造模成功。二樣膏高、低劑量組的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)與正常對照組對比，差別無統(tǒng)計意義(P＞0.05)，表明二樣膏對免疫功能正常組小鼠沒有影響。二樣膏低劑量+CTX組、二樣膏高劑量+CTX組小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均較CTX組高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明二樣膏對免疫功能低下組小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)有影響并以高劑量影響較為顯著。見表1。

表1 各組小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)對比

2.2 二樣膏對小鼠巨噬細胞活性的影響

CTX組小鼠巨噬細胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)均較正常對照組低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明造模成功。二樣膏高、低劑量組的兩指標與正常對照組對比，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明二樣膏對免疫功能正常組小鼠巨噬細胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)沒有影響。二樣膏低劑量+CTX組、二樣膏高劑量+CTX組的吞噬百分率、吞噬指數(shù)均較CTX組高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明二樣膏對免疫功能低下組小鼠巨噬細胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)有影響，且以高劑量影響較為顯著。見表2。

表2 各組小鼠巨噬細胞吞噬百分率與吞噬指數(shù)對比

2.3 二樣膏對小鼠T淋細胞巴增殖的影響

CTX組小鼠T淋細胞巴增殖反應能力較正常對照組低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明造模成功。二樣膏高、低劑量組的T淋細胞巴增殖反應與正常對照組對比，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明二樣膏對免疫功能正常組小鼠T淋細胞巴增殖反應能力沒有影響。二樣膏低劑量+CTX組、二樣膏高劑量+CTX組的小鼠T淋細胞巴增殖反應能力均較CTX組高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明二樣膏對免疫功能低下組小鼠T淋細胞巴增殖反應能力有影響并以高劑量影響較為顯著。見表3。

表3 各組小鼠T淋巴細胞增殖反應對比

3 討論

中草藥對機體的免疫調節(jié)作用已有廣泛報道，如黃芪［5］具有對小鼠的細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫的調節(jié)作用。胸腺、脾臟是周圍性免疫器官，其質量的變化能反應出機體的免疫功能。巨噬細胞為機體非特異性免疫細胞，在機體早期的抗感染中發(fā)揮重要作用。雞紅細胞相對小鼠是異體抗原物質，將其注入小鼠腹腔可引起腹腔巨噬細胞聚集并吞噬雞紅細胞，這可作為機體非特異性免疫功能的重要指標，可用其檢測藥物對機體防御能力的影響［6］。巨噬細胞是機體內生物學作用最為活躍的細胞，具有吞噬、殺傷及消化病原體、殺傷腫瘤細胞、在特異性免疫應答中參與抗原的提呈及免疫調節(jié)作用［7］。T淋巴細胞介導特異性細胞免疫并參與體液免疫應答。機體抗腫瘤免疫效應一般以細胞免疫為主［7］。

本實驗結果顯示，二樣膏能提高免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，增強小鼠腹腔吞噬細胞的吞噬功能，促進T淋巴細胞增殖，且此免疫增強作用與藥物劑量間呈現(xiàn)一定的依存關系，在一定范圍內隨藥物劑量增加而作用增強。此提示二樣膏有助于增加免疫功能低下小鼠的非特異性免疫功能。但二樣膏對于正常小鼠的免疫器官和非特異性免疫功能的影響不明顯。作為臨床上常見的體表如組織感染患者，其免疫功能一定有所下降，用該藥治療體表軟組織感染，應該通過調節(jié)患者的非特異性免疫功能而發(fā)揮治療效果，以抵抗外來病原菌的侵襲。目前有關二樣膏對感染創(chuàng)面抗炎作用及其免疫機制尚未見報道，方中絕大部分中藥的抗炎機制研究還相對淺顯，尤其是細胞和分子水平的研究還較少;各藥物中抗炎成分間是否起到相互協(xié)同作用及如何作用并不清楚;此外，實驗過程中有否存在誤差，有否排除非特異性應激因素的影響等，都有待進一步深入研究。

［1］甘肅省衛(wèi)生廳.醫(yī)院制劑手冊［M］.蘭州：甘肅人民出版社，1982：213-218

［2］王強，李應東.二樣膏治療大鼠局部炎癥的實驗研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2010，12(11)：54-56.

［3］魏偉.藥理實驗方法學［M］.4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：345-346.

［4］曾凡力，周敏，許敏，等.貴州老鷹茶提取物體外抗單純皰疹病毒1型活性的實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(2)：282-284.

［5］陳德宇，蘭偉.黃芪對小鼠機體免疫功能的增強作用［J］.細胞與分子免疫學雜志，2002，18(1)：52-53.

［6］王宇華.參萸保健酒對小鼠機體免疫功能的調節(jié)作用［J］.海峽藥學，2006，18(6)：38-40.

［7］金伯泉.醫(yī)學免疫學［M］.5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：132-133.