響應(yīng)面法優(yōu)化胰蛋白酶酶解核桃蛋白的工藝

摘要：以液壓冷榨油后的核桃餅粕為原料，綜合單因素試驗(yàn)分析，并利用響應(yīng)面分析方法獲得胰蛋白酶酶解核桃蛋白的優(yōu)化條件：酶解溫度37 ℃、底物質(zhì)量濃度31 g/L、反應(yīng)時(shí)間125 min、加酶量[E] ∶[S]=3.2 ∶100，各因素對核桃蛋白酶解的影響順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>加酶量>底物質(zhì)量濃度。通過驗(yàn)證試驗(yàn)表明，利用優(yōu)化的酶解條件，核桃蛋白利用指數(shù)可達(dá)47.25%，效果較好。

關(guān)鍵詞：胰蛋白酶；酶解條件；蛋白利用指數(shù)；工藝優(yōu)化

中圖分類號： TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0239-04

收稿日期：2013-10-11

基金項(xiàng)目：貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)（編號：黔科合NZ[2013]3016號）。

作者簡介：柳蔭（1987—），女，滿族，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：liuyin0130@163.com。

通信作者：周鴻翔（1975—），男，副教授，主要從事油脂加工和食品生物技術(shù)研究工作。E-mail：zhou-hx@163.com。核桃別稱羌桃、胡桃，隸屬胡桃科胡桃屬。核桃蛋白含有人體所必需的8種氨基酸，且含量接近世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，是一種氨基酸齊全的植物蛋白資源。目前，國內(nèi)外對核桃的研究偏重于對核桃油的提取與精煉，而對核桃蛋白質(zhì)的開發(fā)利用研究很少。生物活性肽是指能夠調(diào)節(jié)生物機(jī)體生命活動或某些生理活性的一類肽的總稱[3-4]。某些低肽不僅能提供人體生長、發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而且還能調(diào)節(jié)人體機(jī)能[5-8]。經(jīng)酶解后的蛋白質(zhì)主要以低肽的形式存在并被吸收。采用現(xiàn)代酶解技術(shù)對核桃蛋白進(jìn)行酶解，不僅可改變其物理化學(xué)性質(zhì)和功能特性，還能產(chǎn)生營養(yǎng)豐富、供人體生長發(fā)育所需要的物質(zhì)。因此，對核桃蛋白的開發(fā)利用具有十分重要的意義。本試驗(yàn)在前期篩選出胰蛋白酶為酶解核桃蛋白最佳用酶的基礎(chǔ)上，利用胰蛋白酶酶解核桃餅粕，對其酶解條件進(jìn)一步優(yōu)化，為核桃功能多肽開發(fā)的利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)原料為實(shí)驗(yàn)室液壓冷榨油后的核桃餅粕；胰蛋白酶，由北京索來寶公司生產(chǎn)；K2SO4、CuSO4、H2SO4、HCl、NaOH、H3BO3及混合指示劑等均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

FW-100高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；FA-1004型電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn)；消化爐、凱氏定氮儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1核桃粗蛋白的制備冷榨后的核桃餅粕加入沸程為60～90 ℃的石油醚，在50 ℃、料液比1 g ∶3 mL、浸提2次的條件下浸泡去除殘油；脫脂后，將蛋白粉置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干72 h，粉碎，過100目篩，即得核桃粗蛋白。

1.3.2氮含量的測定參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用凱式定氮法測定可溶性氮含量和核桃蛋白的總氮含量。

1.3.3核桃蛋白的蛋白利用指數(shù)計(jì)算蛋白利用指數(shù)=可溶性氮含量/核桃蛋白總氮含量×100%。

1.4酶解條件的確定

1.4.1底物質(zhì)量濃度加酶量為[E] ∶[S]=3 ∶100、溫度為37 ℃，在底物質(zhì)量濃度分別為10、30、50、70、90 g/L條件下水解1 h，以蛋白利用指數(shù)為指標(biāo)，分析底物質(zhì)量濃度對核桃蛋白酶解的影響。

1.4.2加酶量底物質(zhì)量濃度為30 g/L、溫度為37 ℃，在加酶量[E] ∶[S]分別為1 ∶100、2 ∶100、3 ∶100、4 ∶100、5 ∶100 的條件下水解1 h，以蛋白利用指數(shù)為指標(biāo)，分析加酶量對核桃蛋白酶解的影響。

1.4.3酶解時(shí)間底物質(zhì)量濃度為30 g/L、加酶量[E] ∶[S]=3 ∶100，在37 ℃分別水解30、60、90、120、150、180 min，以蛋白利用指數(shù)為指標(biāo)，分析酶解時(shí)間對核桃蛋白酶解的影響。

1.4.4酶解條件的優(yōu)化基于單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)Central composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對蛋白利用指數(shù)有影響的3個(gè)因素即底物質(zhì)量濃度、加酶量和酶解時(shí)間，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，酶解溫度固定在37 ℃，經(jīng)過Design-Expert 優(yōu)化胰蛋白酶酶解核桃蛋白的條件。響應(yīng)面分析與水平編碼表見表1。

2結(jié)果與分析

2.1核桃餅粕和去除殘油后的核桃粗蛋白的基本成分

由表2可見，核桃粗蛋白與核桃餅粕相比，粗蛋白含量明顯上升，粗脂肪含量顯著降低；除粗纖維含量有所下降外，其他成分含量均有所增加，且差異不大。表2核桃餅粕和核桃粗蛋白基本成分

原料基本成分的含量（%）粗蛋白粗脂肪水分灰分還原糖淀粉粗纖維核桃餅粕47.8325.647.045.990.997.015.21核桃粗蛋白59.587.349.266.541.3711.93.83

2.2各因素對胰蛋白酶酶解核桃蛋白的影響

2.2.1底物質(zhì)量濃度由圖1可知，底物質(zhì)量濃度低于 30 g/L 時(shí)，蛋白利用指數(shù)隨著底物質(zhì)量濃度的增大而升高，之后蛋白利用指數(shù)上升趨勢趨于平緩甚至有下降趨勢。這可能是因?yàn)榈唾|(zhì)量濃度時(shí)，溶液的流動性較好，酶與底物接觸比較充分；而在高質(zhì)量濃度時(shí)，溶液的流動性較差，酶與底物接觸不夠充分，限制了酶解反應(yīng)的進(jìn)行。綜合考慮，選擇胰蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳底物質(zhì)量濃度為30 g/L。

2.2.2加酶量由圖2可知，隨著加酶量的增加，蛋白利用指數(shù)增加，在加酶量為[E] ∶[S]=3 ∶100達(dá)到最高，隨后基本穩(wěn)定。這是因?yàn)榧用噶窟^大時(shí)，蛋白質(zhì)分子可能已被酶所飽和，過多的酶量并沒有提高蛋白利用指數(shù)，反而使其下降。選擇適宜的加酶量[E] ∶[S]=3 ∶100。endprint

2.2.3酶解時(shí)間由圖3可知，酶解反應(yīng)開始后，蛋白利用指數(shù)隨酶解時(shí)間的延長而升高，胰蛋白酶酶解到達(dá)120 min后，反應(yīng)趨于平緩，變化幅度很小。這可能是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶的濃度逐漸降低，活性降低，酶的活性部位已被核桃蛋白分子所飽和，反應(yīng)趨于平衡。適宜的酶解時(shí)間為120 min。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝

2.3.1二次方程數(shù)學(xué)模型的建立及最佳化分析綜合單因素?cái)?shù)據(jù)，基于Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理[9-10]，以蛋白利用指數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，采用Design Expert 7.1 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案（表3），建立數(shù)學(xué)回歸模型，以反映不同因素間的交互影響，最佳化分析酶解工藝參數(shù)。

2.3.2響應(yīng)面結(jié)果分析為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性，進(jìn)一

步確定各單因素對蛋白利用指數(shù)的影響程度，對回歸模型進(jìn)行了方差分析（表4）。以蛋白利用指數(shù)為響應(yīng)值的函數(shù)二次回歸方程為：R=-342.475 50+38.675 75A+73.878 00B+3.417 01C-2.780 00AB-0.0111 25AC+0.002 5BC-4.558 25A2-10.323 00B2-0.0136 46C2。由表4可見，一次項(xiàng)中A、B、C偏回歸系數(shù)均極顯著，說明加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間對蛋白利用指數(shù)均具有顯著性影響；交互項(xiàng)中AB達(dá)顯著水平，二次項(xiàng)中A2、B2、C2偏回歸系數(shù)達(dá)極顯著水平；失擬項(xiàng)P>0.05，差異不顯著，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起。該模型R2=0.977 6，說明響應(yīng)值的變化有97.76%來源于底物質(zhì)量濃度、加酶量、酶解時(shí)間，影響蛋白利用指數(shù)的因素作用大小為酶解時(shí)間>加酶量>底物質(zhì)量濃度。

由圖4可見，核桃蛋白利用率曲線出現(xiàn)先升高到平緩再略下降的狀態(tài)；提高底物質(zhì)量濃度與加酶量均能提高核桃蛋白利用指數(shù)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度和加酶量分別增大到一定程度時(shí)，蛋白利用率趨于飽和，響應(yīng)曲面變平緩；隨后，若再增大底物質(zhì)量濃度和加酶量，提取率會略有下降。因此，最佳取值點(diǎn)應(yīng)取蛋白利用率不再顯著增高的坐標(biāo)點(diǎn)處。

由圖5可見，底物質(zhì)量濃度在[2，3.1]范圍內(nèi)、時(shí)間在[100，120]范圍內(nèi)時(shí)，兩者的增效作用明顯，蛋白利用指數(shù)隨著底物質(zhì)量濃度和時(shí)間的增加而升高，超過這個(gè)范圍之后趨于平緩，再增加蛋白利用指數(shù)下降。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

為證實(shí)模型預(yù)測值與實(shí)測值之間的擬合程度，在優(yōu)化的理論值下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。由表5可見，試驗(yàn)得到的蛋白利用指數(shù)為47.25%，與預(yù)測值接近，預(yù)測值與試驗(yàn)值之間具有良好的擬合性，表明該模型具有有效性。這說明回歸方程能夠比較真實(shí)地反映各因素對蛋白利用指數(shù)的影響。

3小結(jié)

本試驗(yàn)研究了底物質(zhì)量濃度、加酶量、酶解時(shí)間對蛋白利用的影響，各因素對胰蛋白酶酶解核桃蛋白的影響順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>加酶量>底物質(zhì)量濃度。

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法是一種常用的優(yōu)化試驗(yàn)條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法[11-14]。經(jīng)檢驗(yàn)，證明該模型切實(shí)可行，能較好地預(yù)測蛋白利用指數(shù)。確定核桃蛋白的蛋白利用指數(shù)最佳酶解條件為反應(yīng)時(shí)間125 min、底物質(zhì)量濃度31 g/L、加酶量[E] ∶[S]=3.2 ∶100、酶解溫度37 ℃，蛋白利用指數(shù)可達(dá)47.25%。

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2.2.3酶解時(shí)間由圖3可知，酶解反應(yīng)開始后，蛋白利用指數(shù)隨酶解時(shí)間的延長而升高，胰蛋白酶酶解到達(dá)120 min后，反應(yīng)趨于平緩，變化幅度很小。這可能是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶的濃度逐漸降低，活性降低，酶的活性部位已被核桃蛋白分子所飽和，反應(yīng)趨于平衡。適宜的酶解時(shí)間為120 min。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝

2.3.1二次方程數(shù)學(xué)模型的建立及最佳化分析綜合單因素?cái)?shù)據(jù)，基于Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理[9-10]，以蛋白利用指數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，采用Design Expert 7.1 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案（表3），建立數(shù)學(xué)回歸模型，以反映不同因素間的交互影響，最佳化分析酶解工藝參數(shù)。

2.3.2響應(yīng)面結(jié)果分析為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性，進(jìn)一

步確定各單因素對蛋白利用指數(shù)的影響程度，對回歸模型進(jìn)行了方差分析（表4）。以蛋白利用指數(shù)為響應(yīng)值的函數(shù)二次回歸方程為：R=-342.475 50+38.675 75A+73.878 00B+3.417 01C-2.780 00AB-0.0111 25AC+0.002 5BC-4.558 25A2-10.323 00B2-0.0136 46C2。由表4可見，一次項(xiàng)中A、B、C偏回歸系數(shù)均極顯著，說明加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間對蛋白利用指數(shù)均具有顯著性影響；交互項(xiàng)中AB達(dá)顯著水平，二次項(xiàng)中A2、B2、C2偏回歸系數(shù)達(dá)極顯著水平；失擬項(xiàng)P>0.05，差異不顯著，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起。該模型R2=0.977 6，說明響應(yīng)值的變化有97.76%來源于底物質(zhì)量濃度、加酶量、酶解時(shí)間，影響蛋白利用指數(shù)的因素作用大小為酶解時(shí)間>加酶量>底物質(zhì)量濃度。

由圖4可見，核桃蛋白利用率曲線出現(xiàn)先升高到平緩再略下降的狀態(tài)；提高底物質(zhì)量濃度與加酶量均能提高核桃蛋白利用指數(shù)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度和加酶量分別增大到一定程度時(shí)，蛋白利用率趨于飽和，響應(yīng)曲面變平緩；隨后，若再增大底物質(zhì)量濃度和加酶量，提取率會略有下降。因此，最佳取值點(diǎn)應(yīng)取蛋白利用率不再顯著增高的坐標(biāo)點(diǎn)處。

由圖5可見，底物質(zhì)量濃度在[2，3.1]范圍內(nèi)、時(shí)間在[100，120]范圍內(nèi)時(shí)，兩者的增效作用明顯，蛋白利用指數(shù)隨著底物質(zhì)量濃度和時(shí)間的增加而升高，超過這個(gè)范圍之后趨于平緩，再增加蛋白利用指數(shù)下降。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

為證實(shí)模型預(yù)測值與實(shí)測值之間的擬合程度，在優(yōu)化的理論值下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。由表5可見，試驗(yàn)得到的蛋白利用指數(shù)為47.25%，與預(yù)測值接近，預(yù)測值與試驗(yàn)值之間具有良好的擬合性，表明該模型具有有效性。這說明回歸方程能夠比較真實(shí)地反映各因素對蛋白利用指數(shù)的影響。

3小結(jié)

本試驗(yàn)研究了底物質(zhì)量濃度、加酶量、酶解時(shí)間對蛋白利用的影響，各因素對胰蛋白酶酶解核桃蛋白的影響順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>加酶量>底物質(zhì)量濃度。

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法是一種常用的優(yōu)化試驗(yàn)條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法[11-14]。經(jīng)檢驗(yàn)，證明該模型切實(shí)可行，能較好地預(yù)測蛋白利用指數(shù)。確定核桃蛋白的蛋白利用指數(shù)最佳酶解條件為反應(yīng)時(shí)間125 min、底物質(zhì)量濃度31 g/L、加酶量[E] ∶[S]=3.2 ∶100、酶解溫度37 ℃，蛋白利用指數(shù)可達(dá)47.25%。

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2.2.3酶解時(shí)間由圖3可知，酶解反應(yīng)開始后，蛋白利用指數(shù)隨酶解時(shí)間的延長而升高，胰蛋白酶酶解到達(dá)120 min后，反應(yīng)趨于平緩，變化幅度很小。這可能是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶的濃度逐漸降低，活性降低，酶的活性部位已被核桃蛋白分子所飽和，反應(yīng)趨于平衡。適宜的酶解時(shí)間為120 min。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝

2.3.1二次方程數(shù)學(xué)模型的建立及最佳化分析綜合單因素?cái)?shù)據(jù)，基于Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理[9-10]，以蛋白利用指數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，采用Design Expert 7.1 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案（表3），建立數(shù)學(xué)回歸模型，以反映不同因素間的交互影響，最佳化分析酶解工藝參數(shù)。

2.3.2響應(yīng)面結(jié)果分析為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性，進(jìn)一

步確定各單因素對蛋白利用指數(shù)的影響程度，對回歸模型進(jìn)行了方差分析（表4）。以蛋白利用指數(shù)為響應(yīng)值的函數(shù)二次回歸方程為：R=-342.475 50+38.675 75A+73.878 00B+3.417 01C-2.780 00AB-0.0111 25AC+0.002 5BC-4.558 25A2-10.323 00B2-0.0136 46C2。由表4可見，一次項(xiàng)中A、B、C偏回歸系數(shù)均極顯著，說明加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間對蛋白利用指數(shù)均具有顯著性影響；交互項(xiàng)中AB達(dá)顯著水平，二次項(xiàng)中A2、B2、C2偏回歸系數(shù)達(dá)極顯著水平；失擬項(xiàng)P>0.05，差異不顯著，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起。該模型R2=0.977 6，說明響應(yīng)值的變化有97.76%來源于底物質(zhì)量濃度、加酶量、酶解時(shí)間，影響蛋白利用指數(shù)的因素作用大小為酶解時(shí)間>加酶量>底物質(zhì)量濃度。

由圖4可見，核桃蛋白利用率曲線出現(xiàn)先升高到平緩再略下降的狀態(tài)；提高底物質(zhì)量濃度與加酶量均能提高核桃蛋白利用指數(shù)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度和加酶量分別增大到一定程度時(shí)，蛋白利用率趨于飽和，響應(yīng)曲面變平緩；隨后，若再增大底物質(zhì)量濃度和加酶量，提取率會略有下降。因此，最佳取值點(diǎn)應(yīng)取蛋白利用率不再顯著增高的坐標(biāo)點(diǎn)處。

由圖5可見，底物質(zhì)量濃度在[2，3.1]范圍內(nèi)、時(shí)間在[100，120]范圍內(nèi)時(shí)，兩者的增效作用明顯，蛋白利用指數(shù)隨著底物質(zhì)量濃度和時(shí)間的增加而升高，超過這個(gè)范圍之后趨于平緩，再增加蛋白利用指數(shù)下降。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

為證實(shí)模型預(yù)測值與實(shí)測值之間的擬合程度，在優(yōu)化的理論值下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。由表5可見，試驗(yàn)得到的蛋白利用指數(shù)為47.25%，與預(yù)測值接近，預(yù)測值與試驗(yàn)值之間具有良好的擬合性，表明該模型具有有效性。這說明回歸方程能夠比較真實(shí)地反映各因素對蛋白利用指數(shù)的影響。

3小結(jié)

本試驗(yàn)研究了底物質(zhì)量濃度、加酶量、酶解時(shí)間對蛋白利用的影響，各因素對胰蛋白酶酶解核桃蛋白的影響順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>加酶量>底物質(zhì)量濃度。

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法是一種常用的優(yōu)化試驗(yàn)條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法[11-14]。經(jīng)檢驗(yàn)，證明該模型切實(shí)可行，能較好地預(yù)測蛋白利用指數(shù)。確定核桃蛋白的蛋白利用指數(shù)最佳酶解條件為反應(yīng)時(shí)間125 min、底物質(zhì)量濃度31 g/L、加酶量[E] ∶[S]=3.2 ∶100、酶解溫度37 ℃，蛋白利用指數(shù)可達(dá)47.25%。

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