體外棕櫚酸誘導(dǎo)自噬調(diào)節(jié)奶牛淋巴細胞炎癥通路

李樹森 楊曉燕 李 瑩 鄧清華 薛江東 王新波 張玉明 杜立銀

(內(nèi)蒙古民族大學 動物科學技術(shù)學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

棕櫚酸(Palmitic acid，PA)是一種16碳長鏈飽和脂肪酸，血漿中PA占總脂肪酸含量比例較高，對脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的發(fā)展起到關(guān)鍵性作用，如肥胖、糖尿病和心血管疾病等。PA不僅可通過β氧化作為一種能量來源，還可作為多種疾病發(fā)生發(fā)展的標志性分子。此外，還可促進細胞膜合成，構(gòu)成細胞膜骨架，作為致癌信號脂質(zhì)，如甘油磷脂、鞘脂和醚脂質(zhì)等[1-2]。多項研究表明，PA可誘導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生[3-5]。

自噬作為一種穩(wěn)態(tài)機制出現(xiàn)，調(diào)節(jié)受損蛋白質(zhì)和細胞器的周轉(zhuǎn)，并通過回收細胞內(nèi)成分幫助緩沖各種細胞應(yīng)激。研究表明，許多人類疾病的發(fā)病機制與自噬失調(diào)有關(guān)，包括癌癥、感染、退行性疾病和代謝性疾病[6]。自噬機制被認為是一種應(yīng)激反應(yīng)，支持真核生物單細胞在病變條件下生存，可能通過調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)和/或通過蛋白質(zhì)和細胞器降解途徑來實現(xiàn)。自噬機制參與細胞應(yīng)激反應(yīng)通路(包括參與控制免疫反應(yīng)和炎癥的通路)調(diào)節(jié)，自噬蛋白可以和免疫信號分子直接相互作用[[7-8]。在適應(yīng)性免疫中，自噬蛋白也發(fā)揮一定功能，包括免疫系統(tǒng)的發(fā)展和內(nèi)穩(wěn)態(tài)，以及抗原呈遞[8]。患有脂肪肝的奶牛，體內(nèi)細胞長期處于高脂環(huán)境下，容易發(fā)生自噬現(xiàn)象[9]。

越來越多的證據(jù)表明自噬與炎癥之間具有重要聯(lián)系。自噬蛋白在免疫誘導(dǎo)和抑制炎癥反應(yīng)中起作用，免疫和炎癥信號在自噬的誘導(dǎo)和抑制中同樣起作用[10]。在敲除小鼠胚胎造血干細胞自噬基因Atg5后，體內(nèi)的自噬蛋白SQSTM1積聚增加，減少了B細胞、CD4+T細胞及CD8+T細胞數(shù)量，并導(dǎo)致胚胎造血干細胞的死亡[11-13]。在造血細胞缺乏自噬基因Atg16L1的小鼠中，IL-1β和IL-18水平顯示升高，炎癥小體激活關(guān)鍵的促炎細胞因子，表明自噬基因可以激活炎癥信號通路[14-15]。另外，小鼠巨噬細胞特異性的自噬基因缺失使得大量炎癥因子IL-1β釋放，導(dǎo)致引發(fā)葡萄膜炎[16]。

盡管多項研究已經(jīng)表明PA在巨噬細胞和星形膠質(zhì)細胞中損害自噬，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增強[17-18]。但PA對淋巴細胞自噬功能的影響尚未被探索，PA是否可以通過誘導(dǎo)奶牛淋巴細胞的自噬影響免疫功能。因此，本試驗通過分離并培養(yǎng)奶牛淋巴細胞，探討體外不同濃度的PA是否可以通過誘導(dǎo)淋巴細胞自噬調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)應(yīng)答，并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

棕櫚酸(Sigma公司，P0500-100G)粉末；胎牛血清、雙抗、RPMI-1640(Themo公司, PM150122)；Trizol Reagent (Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒和qRT-PCR擴增試劑(Taka-Ra公司)；Percoll分離液(GE Healthcare, 17-0891-09)；生理鹽水；紅細胞裂解液(TIANGEN公司，S1821)；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)(Selleck公司，S2767)粉末。

1.2 淋巴細胞的分離與培養(yǎng)

抽取健康奶牛(內(nèi)蒙古民族大學實驗基地) 50 mL 新鮮血于抗凝管中，與PBS 1∶1稀釋。Percoll原液與生理鹽水混合配制成1.084 g/mL的分離液，取4 mL分離液于離心管中，將PBS稀釋后的抗凝血2 mL小心疊加在分離液上，1 500 rpm水平離心25 min，可觀察到4個細胞層，從上至下分別為：死細胞殘片和血小板層、單核細胞層、淋巴細胞層、中性粒細胞及紅細胞層。分離淋巴細胞，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，接種于24孔板，每孔2×106個細胞。

1.3 棕櫚酸(PA)的溶解

用0.01 mol/L的NaOH溶液配置10 mmol/L的棕櫚酸儲存液，于70 ℃水浴中加入脫脂BSA，0.22 μm濾頭過濾，分別配置0、0.1、0.5、和1 μg/mL質(zhì)量濃度的PA，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 試驗設(shè)計

試驗分為5個處理組(表1)，每組3個重復(fù)，以平均數(shù)±標準差進行數(shù)據(jù)分析。

表1 試驗設(shè)計Table 1 Experimental designing

1.5 CCK-8法檢測細胞活性

按照每孔100 μL細胞液，約2×105個細胞接于96孔板。37 ℃，5% CO2預(yù)培養(yǎng)1 h，向孔內(nèi)加入不同濃度棕櫚酸，培養(yǎng)3 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，再孵育4 h，酶標儀測定450 nm處吸光度。

1.6 qRT-RCR檢測

收集棕櫚酸處理的淋巴細胞，Trizol法提總RNA，微量分光光度計測定RNA濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green Ι qRT-PCR試劑盒檢測自噬及炎癥通路關(guān)鍵因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表1 qRT-PCR引物設(shè)計Table 1 Primer design of qRT-PCR

根據(jù)Genbank中LC3B、Beclin1、mTOR、UKL1、SQSTM1、IL-1β、IL-6、TNF-α和β-actinmRNA序列和引物設(shè)計原則，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物。qRT-RCR反應(yīng)體系(20 μL)如下：ROX 10 μL；上游引物1 μL、下游引物1 μL；模板cDNA 1 μL；ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s；60 ℃ 退火15 s，共計45個循環(huán)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較分析(LSD)，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PA對細胞活力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，與空白對照組相比，隨著PA濃度逐漸升高，細胞活性逐漸降低；而與1 μg/mL PA處理組相比較，添加1 μg/mL PA+3-MA處理后，細胞活性顯著增強(圖1)。這表明PA可能通過自噬影響細胞活性。

*為顯著差異P<0.05，**為極顯著差異P<0.01。* Significant difference P<0.05， ** Extremely significant difference P<0.01.圖1 CCK-8檢測淋巴細胞細胞活性Fig.1 Detection of cell viability of lymphocyte by CCK-8

2.2 PA誘導(dǎo)奶牛淋巴細胞自噬相關(guān)基因mRNA的表達

如圖2所示，不同濃度PA處理細胞3 h后，與對照組相比，ULK1和LC3BmRNA表達極顯著增加(P<0.01)(圖2(b)和(d))，mTOR、SQSTM1和Beclin1mRNA表達極顯著降低(P<0.01)(圖2(a)、(c)和(e))；添加3-MA后，與1 μg/mL PA處理組相比較，SQSTM1和Beclin1極顯著增加，而LC3BmRNA表達極顯著降低(P<0.01)。表明PA可以誘導(dǎo)奶牛淋巴細胞自噬。

圖2 PA誘導(dǎo)淋巴細胞自噬基因mRNA表達Fig.2 The mRNA expression of autophagy related gene in lymphocytes treated with PA

2.3 PA通過自噬調(diào)節(jié)奶牛淋巴細胞促炎細胞因子mRNA的表達

如圖3所示，與對照組相比較，PA處理組顯著增加IL-1β和IL-6mRNA的表達(P<0.01)(圖3(a)和(b))，而顯著抑制TNF-αmRNA的表達(P<0.01)(圖3(c))；與PA處理組相比較，PA+3-MA處理組中IL-1β和IL-6 mRNA的表達極顯著降低，這表明PA可以通過自噬調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)(P<0.01)。

圖3 PA誘導(dǎo)淋巴細胞促炎因子mRNA的表達Fig.3 The mRNA expression of proinflammatory factor in PA-treated lymphocytes..

2.4 PA通過自噬調(diào)節(jié)奶牛淋巴細胞促炎細胞因子的釋放

如圖4所示，與對照組相比較，PA處理組顯著增加IL-1β和IL-6的釋放(P<0.01)(圖4(a)和(b))，顯著抑制TNF-α的釋放(P<0.01)(圖4(c))；與PA處理組相比較，PA+3-MA處理組中IL-1β和IL-6釋放量極顯著降低(P<0.01)，進一步表明PA可通過自噬調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)應(yīng)答。

圖4 PA誘導(dǎo)淋巴細胞促炎細胞因子分泌的釋放水平Fig.4 Level of proinflammatory cytokine in lymphocytes induced by PA

3 討 論

脂肪肝奶牛機體類似2型糖尿病患者(T2DM)，長期存在慢性炎癥，主要由血液中的高濃度脂肪酸(PA)造成，高水平的PA環(huán)境導(dǎo)致細胞對PA的攝取增加。臨床和流行病學研究表明，血漿PA水平升高(而不是其他飽和脂肪酸)可能與代謝綜合征有關(guān)[19-21]。另外，PA可以顯著誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放[22-24]。這與本研究中IL-1β和IL-6水平的顯著升高一致，不同的是，其對TNF-α的分泌產(chǎn)生了抑制作用，這可能與細胞的差異性相關(guān)。

研究表明，高濃度的脂肪酸在肥胖和糖尿病等疾病的發(fā)病機制中起著重要作用，血液中淋巴細胞長期浸潤在高濃度脂肪酸中，由于脂毒性改變其功能[25]，而自噬被認為是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和脂毒性的重要機制，如肝細胞通過自噬來消化和利用脂滴既脂肪的溶酶體降解途徑[26-27]。本研究中，通過分離并培養(yǎng)奶牛淋巴細胞，體外PA誘導(dǎo)淋巴細胞建立奶牛脂肪肝體內(nèi)環(huán)境模型，研究PA通過誘導(dǎo)自噬調(diào)節(jié)奶牛淋巴細胞的炎癥信號通路，并分析其機制。

自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制，直接影響細胞活性，藥理學或遺傳抑制自噬導(dǎo)致凋亡細胞死亡[28]，自噬損傷與代謝性疾病，以及其它病理生理條件有關(guān)[29]。若能消化和利用脂肪滴，降低脂肪酸濃度，可使肝細胞發(fā)生自噬促進細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝[30-32]。在本研究中，隨著PA濃度的升高，自噬基因表達被顯著抑制，這可能與細胞種類和棕櫚酸濃度不同有關(guān)。自噬是一個細胞內(nèi)降解過程，重新利用大分子和受損的細胞器，以及在代謝功能障礙條件下提供能量[31]。自噬通過TRIF依賴的TLR4信號通路來調(diào)節(jié)，siRNA抑制TRIF，完全阻止了LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞GFP-LC3的自噬表達，表明LPS通過TRIF依賴性TLR4信號通路誘導(dǎo)自噬[33]。同樣，TLR介導(dǎo)細胞自噬，自噬也會反過來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)應(yīng)答。有研究表明，TRAF3通過激活TLR4使TBK1被激活，TBK1對P62介導(dǎo)的自噬具有調(diào)節(jié)作用，證明了細胞自噬機制可以負反饋調(diào)節(jié)TLR和炎癥信號通路[34]。當自噬被藥物抑制后，LPS激活的炎癥小體被顯著抑制，炎癥細胞因子IL-1β和IL-18的釋放量顯著下降，進一步證明自噬能調(diào)控炎癥反應(yīng)應(yīng)答。本研究中，自噬被抑制后，促炎細胞因子釋放和mRNA表達顯著下降，這表明PA可以通過誘導(dǎo)淋巴細胞自噬調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)應(yīng)答。這些結(jié)果有助于理解和闡明脂肪肝奶牛并發(fā)癥的分子機制，以及為治療奶牛脂肪肝提供了新的理論依據(jù)。