CLIC3在胰腺癌中的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)性的生物信息學(xué)分析

龔治忠 李清月 劉 剛

胰腺癌（PAAD）是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，惡性程度極高，該疾病發(fā)病早期較為隱匿且缺乏特異性臨床癥狀，后期治療效果往往不佳，5 年生存率小于6%，且預(yù)后較差。目前，對(duì)PAAD的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不清楚，流行病學(xué)研究表明發(fā)病具有明顯的性別特征和年齡特征，發(fā)病人群以中老年男性為主[1]。

胞內(nèi)氯離子通道蛋白3（CLIC3）是細(xì)胞膜和細(xì)胞器質(zhì)膜上的一類能夠轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子的通道蛋白，CLIC3 通過介導(dǎo)氯離子及水的外流來調(diào)節(jié)細(xì)胞體積和形態(tài)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的分化、遷移及凋亡等行為[2]。研究表明，CLIC3 在腫瘤細(xì)胞中均發(fā)生了不同程度的異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、周期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，能夠作為腫瘤發(fā)生、發(fā)展及惡性進(jìn)展的潛在標(biāo)志基因，此外，CLIC3 蛋白表達(dá)水平?jīng)Q定了患者預(yù)后情況，具有重要的臨床意義[3]。本研究擬利用GEPIA、Ualcan和HPA等數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)的方法，探討CLIC3 在PAAD中表達(dá)情況，分析CLIC3 與PAAD患者的年齡、性別和病理組織學(xué)分級(jí)之間的關(guān)系，同時(shí)分析與PAAD患者預(yù)后的相關(guān)性，以期為PAAD的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)收集與分析方法

1.1 CLIC3 差異表達(dá)分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）分析CLIC3在PAAD組織中的表達(dá)水平，搜索條件如下：Gene=CLIC3，│Log2FC│cutoff=1，p value cutoff =0.01，Dataset selection = PAAD，Log Scale = yes，Matched Normal data = Match TCGA normal and GTEx data。搜索到的樣本總數(shù)為350例，其中PAAD患者179例，正常人群171例。CLIC3與PAAD分期、性別、年齡間的關(guān)系利用UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）分 析 完 成。利用蛋白組HPA數(shù)據(jù)庫（https://www.Proteinatlas.org），分析CLIC3在PAAD中的蛋白表達(dá)情況。

1.2 CLIC3 的預(yù)后分析和無病生存期分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫，采用log-rank檢驗(yàn)，運(yùn)用Kaplan-Meier進(jìn)行PAAD預(yù)后分析（Overall Survival）和無病生存期分析（Disease Free Survival）。參數(shù)設(shè)置如下：Gene=CLIC3，Methods = Overall Survival，Group Cutoff = Median，Hazards Ratio (HR) =yes，95% Confidence Interval = no，Axis Units =Month，Datasets Selection = PAAD。預(yù)后生存期的樣本總數(shù)為107 例，其中CLIC3 高表達(dá)患者為36例，低表達(dá)的患者為71 例；無病生存期的樣本總數(shù)為178 例，其中CLIC3 高、低表達(dá)的患者各89 例。

1.3 CLIC3 協(xié)同表達(dá)分析和甲基化分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫，采用Pearson相關(guān)性分析PAAD中與CLIC3 協(xié)同表達(dá)相關(guān)系數(shù)較高的基因，分析其與CLIC3 之間的協(xié)同表達(dá)關(guān)系。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫，分析正常組織與PAAD組織之間、各個(gè)不同病理分級(jí)之間的甲基化差異性。

2 結(jié) 果

2.1 CLIC3 在PAAD中 的mRNA及 蛋 白 表 達(dá) 分析 通過對(duì)GEPIA數(shù)據(jù)庫分析350 例樣本，其中179 例為PAAD患者、171 例為正常個(gè)體，結(jié)果表明，PAAD組織中的CLIC3表達(dá)水平高于正常組織，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A。在HPA蛋白表達(dá)模塊中查看FKBP10 的表達(dá)情況，通過芯片分析，CLIC3在PADD中的蛋白高表達(dá)和低表達(dá)情況，可以發(fā)現(xiàn)核分級(jí)越高，CLIC3 表達(dá)越高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。

2.2 CLIC3 與臨床特征的相關(guān)性分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫，分別按照年齡、性別和病理組織學(xué)分級(jí)等因素分析PAAD組織和正常組織中CLIC3 的表達(dá)情況。病理組織學(xué)分級(jí)分析結(jié)果表明，正 常vs.3 級(jí)、1 級(jí)vs.2 級(jí)、1 級(jí)vs.3 級(jí)、3 級(jí)vs.4 級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2A）；年齡分析結(jié)果表明正常vs.年齡（41～60 歲）、正常vs.年齡（61～80 歲）之間差異具有顯著性，發(fā)病年齡以中老年患者為主（P＜0.05）（圖2B）；性別分析結(jié)果表明，PAAD具有明顯的性別偏好性，男性患者明顯多于女性患者（P＜0.05）（圖2C）。

圖1 CLIC3在PAAD中的mRNA及蛋白表達(dá)情況

圖2 不同病理組織學(xué)分級(jí)、年齡、性別中PAAD癌中CLIC3表達(dá)差異分析（＊P＜0.05）

2.3 CLIC3 與PAAD預(yù)后、無病生存期的關(guān)系 預(yù)后分析和無病生存期利用GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，以CLIC3 表達(dá)值的中位值分為高、低兩組，采用log-rank檢驗(yàn)，運(yùn)用Kaplan-Meier繪制生存曲線。預(yù)后分析共107 例，分析結(jié)果表明，CLIC3 高表達(dá)組（36 例）的生存期低于低表達(dá)組（71 例），且兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A。無病生存期共分析了178 例，結(jié)果顯示CLIC3高表達(dá)組（89 例）患者無病生存期低于低表達(dá)組（89 例），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B，與預(yù)后分析結(jié)果類似。

2.4 協(xié)同表達(dá)分析 協(xié)同表達(dá)分析表明，在PAAD組 織 中，CLIC3 與MMP28、TRIM29 具 有 顯著的協(xié)同表達(dá)情況，且存在明顯的正相關(guān)性，其R值分別為0.65、0.64，見圖4。

2.5 甲基化分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫，對(duì)PAAD中的CLIC3 甲基化分析表明，正常組織（10例）與PAAD組織（182 例）之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖5A；正常組織（3 例）與1 級(jí)（2 例）、4 級(jí)（4 例）之間存在顯著性差異，而與2級(jí)（145 例）、3 級(jí)（3 例）之間不存在差異性（圖5B）；性別分析結(jié)果表明，正常組織（10 例）與男性（102 例）、女性（82 例）之間差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5C。

圖3 CLIC3表達(dá)水平與PAAD患者生存期的關(guān)系

圖4 CLIC3基因與MMP28,TRIM29的相關(guān)性分析

圖5 PAAD中CLIC3甲基化分析（＊P＜0.05）

3 討 論

PAAD惡性程度極高，診斷和治療都很困難，且預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅著生命健康[4]。目前依靠早發(fā)現(xiàn)、早治療。由于早期PAAD癥狀較為隱匿，給PAAD的診斷和治療帶來了很大困難。近年來，分子生物標(biāo)記和生物信息學(xué)分析為PAAD的早期診斷和治療提供了新的契機(jī)。CLIC3是一類與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的氯離子通道蛋白，研究表明，CLIC3在胃癌、唾液腺黏液表皮樣癌等腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常組織[5]。本研究結(jié)果顯示，CLIC3在PAAD組織中的表達(dá)水平高于正常組織（P＜0.05），提示CLIC3與PAAD的發(fā)生關(guān)系密切。

通過對(duì)CLIC3 分析結(jié)果表明，CLIC3 在41-60Yrs和61-80Yrs中表達(dá)具有顯著性，男性患者明顯多于女性患者，這與PAAD臨床結(jié)果分析相吻合。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照組中的CLIC3表達(dá)水平與PAAD Grande 3 級(jí)之間具有顯著差異性，而與其他各組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CLIC3 的表達(dá)水平并沒有隨著PAAD的分期的提高而表達(dá)增高，更可能是在Grande 3 級(jí)表達(dá)異常增高。研究發(fā)現(xiàn)，CLIC3 表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)，CLIC3 高表達(dá)組的預(yù)后分析和無病生存期的總生存期明顯低于低表達(dá)組，與其他腫瘤相似[6]。DNA甲基化是腫瘤的重要生物標(biāo)記物，對(duì)腫瘤患者的早期診斷和疾病監(jiān)測具有重要意義。研究表明，CLIC3 可能會(huì)起到類癌基因的作用，即CLIC3的低甲基化能夠影響啟動(dòng)子異常，進(jìn)而導(dǎo)致某些蛋白的異常表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)CLIC3在PAAD與正常組織之間，男性與女性之間均存在顯著性差異，推測CLIC3在PAAD的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6]。與CLIC3正相關(guān)性最高的基因?yàn)镸MP28、TRIM29，TRIM蛋白激活TRIM29-P53-Wnt信號(hào)通路，而該信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]；而MMP28在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用，也在腫瘤發(fā)生中起重要的作用。

生物信息學(xué)分析能夠?qū)AAD的診斷發(fā)揮不可替代的作用。本研究通過Ualcan和GEPIA數(shù)據(jù)庫研究表明，CLIC3 在PAAD中高表達(dá)并與預(yù)后密切相關(guān)，能夠影響PAAD的發(fā)生和發(fā)展，因此CLIC3對(duì)于PAAD可能具有重要的臨床意義，將有望成為PAAD的診斷的重要生物標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)。