牦牛ACAA2基因克隆及組織表達(dá)分析

陳 美 ，柴志欣 ，武志娟 ，王 會，王吉坤，王嘉博，鐘金城 ，信金偉

（1. 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南民族大學(xué)，成都 610041；2.青藏高原生態(tài)畜牧業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，西南民族大學(xué)，成都 610041；3.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，拉薩 850000）

牦牛（Bos grunniens）別名旄牛，是主要分布于青藏高原海拔3 000～5 000 m 高寒高原的草食性反芻動物，我國牦牛數(shù)量占世界牦?？倲?shù)95%，因分布區(qū)生態(tài)環(huán)境、地理分布及人文經(jīng)濟(jì)各異，形成不同地方品種及類群[1-2]。類烏齊牦牛主要分布于西藏自治區(qū)東北部類烏齊縣[3]，位于海拔4 500 m以上高山草甸草原地區(qū)，是當(dāng)?shù)貎?yōu)良牦牛遺傳資源，以產(chǎn)肉為主、肉乳兼用型牦牛。麥洼牦牛主要分布在海拔3 000 m以上高山草甸草原，是肉乳兼用的優(yōu)良地方品種，產(chǎn)肉量高，是典型利用肉質(zhì)優(yōu)勢優(yōu)良牦牛品種。牦牛肉是一種高蛋白、低脂肪、高能量的優(yōu)質(zhì)肉資源，牦牛肉氨基酸含量高于黃牛肉[4]，是高原牧區(qū)農(nóng)牧民主要食用肉類和經(jīng)濟(jì)來源。因此，如何利用牦牛肉質(zhì)優(yōu)勢資源，提高牦牛產(chǎn)肉量及肉品質(zhì)，是目前牦牛定向育種重要研究方向。

乙酰輔酶A 酰基轉(zhuǎn)移酶（Acetyl-Coenzyme AAcyltr-ansferase，ACAA）包括乙酰輔酶A ?；D(zhuǎn)移酶1（Acetyl-Co A AcyltransFerase 1，ACAA1）和乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2（Acetyl-coenzyme Aacyltransferase 2，ACAA2），屬于?；o酶A代謝酶超家族中硫解酶家族[5-6]，而ACAA2又稱線粒體3-羰基輔酶A硫解酶，是一種參與脂肪酸代謝過程?；D(zhuǎn)移酶，主要分布于線粒體[7]。研究顯示，ACAA2是脂肪酸氧化步驟中關(guān)鍵酶，催化脂肪酸氧化。李恒德等通過分析ACAA2 基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，該基因在內(nèi)含子8上存在一個SNP，且與日增重和眼肌面積均顯著相關(guān)[8]。李文娟采用基因芯片技術(shù)方法篩選和分析肉品質(zhì)相關(guān)脂肪代謝功能基因，得出ACAA2是參與脂類代謝通路關(guān)鍵基因[9]。De Boer等采用基因組芯片技術(shù)分析不同小鼠脂質(zhì)代謝組織表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，ZPZ 等基因存在差異表達(dá)[10]。Dio 等研究發(fā)現(xiàn)，脂蛋白脂肪酶（LPL）受體基因激活劑NO-1886在治療大鼠肥胖癥中發(fā)揮作用，可使ACAA2 mRNA表達(dá)水平增加1.49 倍，且LPL 活化劑NO-1886 可加速脂肪酸氧化相關(guān)酶表達(dá)，導(dǎo)致呼吸商（RQ）降低，為治療大鼠肥胖提供參考[11]。因此，ACAA2基因在肥胖、脂肪酸氧化或脂肪沉積等方面均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

目前，關(guān)于ACAA2 基因相關(guān)研究在綿羊等物種中均有相關(guān)報(bào)道[12]，探究該基因與不同物種肉質(zhì)性狀相關(guān)性。本研究通過克隆獲得牦牛ACAA2 基因cDNA 序列，檢測該基因在不同組織中表達(dá)情況，為該基因在牦牛脂肪合成、代謝等方面調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

分別選取3 頭健康6 月齡麥洼牦牛（四川省阿壩自治州紅原縣）和類烏齊牦牛（西藏自治區(qū)類烏齊縣），將其宰殺后，迅速采集其臀肌、胸肌、脾臟、肺臟、肝臟、心臟和腎臟組織，用DEPC水沖洗干凈，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

YBR Premix Ex TaqTMⅡ和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ta-KaRa）、 pMD19- T 載體（TaKaRa）、 DL- 2 000 Marker、Trizol（Invitrogen）、QuantStudio?3 實(shí) 時熒光定量PCR儀（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取

采用Trizol法對所需組織進(jìn)行總RNA提取，利用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)分別檢測RNA質(zhì)量、濃度及D260 nm／D280 nm值，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并作為克隆和熒光定量模板。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank 已公布黃牛ACAA2 基因mRNA全長序列（NM_001035342.2），利用Primer 5 設(shè)計(jì)ACAA2基因克隆引物（見表1），根據(jù)克隆所得序列設(shè)計(jì)熒光定量引物。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 ACAA2基因克隆

PCR 擴(kuò) 增 體 系 為15 μL： 2 × Taq Green PCR MasterMix 7.5 μL，上、下游引物各0.6 μL，模板cDNA 0.6 μL，最后加入5.7 μL ddH2O 配至15 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火溫度54 ℃，72 ℃延伸90 s，72 ℃終延伸5 min，35 個循環(huán)；1.0%凝膠電泳檢測其擴(kuò)增產(chǎn)物，使用DNA 純化試劑盒作產(chǎn)物DNA 純化回收，將膠回收產(chǎn)物與pMD- 19T 載體16 ℃過夜連接， 轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌）中37 ℃、170 r·min-1震蕩培養(yǎng)1 h，復(fù)蘇后，將其涂布在含有Amp+的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。從平板中挑取陽性菌落，置于含Amp+的LB 培養(yǎng)液中37 ℃、170 r·min-1震蕩培養(yǎng)10～12 h，將PCR 鑒定后的陽性菌液送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 ACAA2基因序列生物信息學(xué)分析

利用NCBI 中ORF Finder 程序分析牦牛ACAA2基因開放閱讀框；ExPASy中ProtParam預(yù)測該基因的理化性質(zhì)；ExPASy中Prot ScaleNetPhos分析該蛋白疏水性/親水性；PSORTII Prediction 分析亞細(xì)胞定位；TMHMM 和SignalP 分別預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽；Net Phos 2.0 預(yù)測該蛋白磷酸化位點(diǎn)；SOPMA預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)；Lasergene MegAlign 軟件作物種同源性序列比對。MEGA.7軟件中最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；Graphpad prism 5 軟件繪制組織表達(dá)定量圖等。

1.2.5 ACAA2基因組織表達(dá)分析

利用克隆所得ACAA2 序列，設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量特異性引物。以GAPDH為內(nèi)參基因，cDNA為模板，QuantStudio?3實(shí)時熒光定量PCR儀檢測ACAA2基因在各組織相對表達(dá)量。反應(yīng)體系為10 μL：上、下游引物各0.4 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 3.2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM(2×)5 μL。 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。各樣本相對表達(dá)量結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算，利用SPSS 19.0 軟件單因素方差分析中Duncan法分析組織表達(dá)量顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR 擴(kuò)增以類烏齊牦牛臀肌組織cDNA 為模板，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶清晰單一，長度為1 357 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段一致（見圖1）。利用NCBI 中ORF Finder 作開放性閱讀框分析， 得出ACAA2 基因CDS 區(qū)序列長1 101 bp，共編碼366 個氨基酸殘基，序列已上傳至NCBI，GenBank 登錄號：MT861180。

2.2 理化性質(zhì)分析

在分析ACAA2 蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在Ala 和Gly 含量最多，不含Pyl 和Sec。負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）和正電殘基總數(shù)（Arg+Lys）均為37 個。蛋白分子式為C1686H2734N486O527S18，分子質(zhì)量為38 822.27 u，理論等電點(diǎn)pI為7.07，親水性平均值為-0.127，脂肪指數(shù)為85.55，不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為40.88，說明該蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白。

2.3 親水性/疏水性及亞細(xì)胞定位預(yù)測

在分析ACAA2蛋白疏水性/親水性過程中，發(fā)現(xiàn)ACAA2 信號蛋白最小值為-2.533 ，位于193位，其親水性最強(qiáng)；最大值為1.889，位于229位，其疏水性最強(qiáng)，說明此蛋白為親水性蛋白。在分析牦牛ACAA2 蛋白亞細(xì)胞定位過程中，發(fā)現(xiàn)ACAA2蛋白在細(xì)胞質(zhì)中分布最多（47.8%）；其次為線粒體和細(xì)胞核（26.1%和17.4%）；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞骨架內(nèi)分布較少，均為4.3%。

2.4 跨膜區(qū)與信號肽預(yù)測

分析ACAA2 基因編碼蛋白跨膜區(qū)與信號肽，發(fā)現(xiàn)牦牛ACAA2 蛋白即不存在跨膜區(qū)域，也無信號肽區(qū)域，說明該蛋白質(zhì)即為非跨膜蛋白，也是非分泌蛋白。

2.5 蛋白磷酸化分析

預(yù)測ACAA2 蛋白磷酸化位點(diǎn)， 發(fā)現(xiàn)牦牛ACAA2 基因編碼氨基酸中共發(fā)現(xiàn)14 個絲氨酸（Ser）、10個蘇氨酸（Thr）和4個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)。

2.6 二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

預(yù)測牦牛ACAA2蛋白二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ACAA2蛋白主要結(jié)構(gòu)為α-螺旋154 個，占總鏈42.08%；其次為無規(guī)卷曲116 個，占總鏈31.69%；延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別為64 個和32 個，占總鏈17.49%和8.74%。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，該蛋白主要以α-螺旋為主，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致，且兩者序列一致性可達(dá)88.25%。

2.7 一致性比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將牦牛ACAA2 基因CDS 區(qū)序列與其他物種該基因CDS 序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)牦牛ACAA2基因序列與黃牛、馬序列一致性較高，分別為92.0%和88.7%；與鼠類一致性較低，與家犬一致性最低（見表2）。由圖3可看出，牦牛與黃牛親緣關(guān)系最近，與馬和家犬親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，符合物種進(jìn)化規(guī)律。

表2 各物種ACAA2基因序列的同源性比對Table 2 Homology alignment of ACAA2 gene sequence of each species

2.8 牦牛ACAA2基因組織表達(dá)分析

將麥洼牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和臀肌7 個組織總RNA 按照反轉(zhuǎn)錄說明書反轉(zhuǎn)，獲得cDNA，以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用實(shí)時熒光定量PCR 分析麥洼牦牛7 個組織差異，發(fā)現(xiàn)牦牛ACAA2基因在以上組織中均表達(dá)（見圖4），且肝臟、腎臟與其他組織相比，差異極顯著，胸肌和臀肌中表達(dá)量最低。

3 討 論

隨著人們生活水平提高，人們對肉質(zhì)口感要求也越來越高，牦牛肉與黃牛肉相比，口感和嫩度相對較差，但富含豐富蛋白質(zhì)、氨基酸及微量元素，且具有脂肪低、熱量高等優(yōu)勢，深受人們喜愛。影響牛肉品質(zhì)感官指標(biāo)包括色澤、肌內(nèi)脂肪含量及肉質(zhì)柔韌性等[13]，其中肌內(nèi)脂肪（IMF）含量是主要影響因素[14]，脂肪含量又受脂代謝調(diào)控[15]，且關(guān)于IMF發(fā)育規(guī)律及脂肪沉積機(jī)制研究主要集中在肉牛[16]、雞[17]和豬[18]，在牦牛中研究相對較少。因此，如何提高牦牛肉品質(zhì)和肌內(nèi)脂肪含量也成為當(dāng)前研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。

3.1 牦牛ACAA2基因序列特性

ACAA2主要分布在線粒體中，參與體外脂肪細(xì)胞分化，是脂肪酸β-氧化途徑關(guān)鍵酶，脂肪酸在β-氧化時產(chǎn)生乙酰輔酶A，在ACAA2作用下催化進(jìn)入三羧酸循環(huán)徹底氧化，并釋放能量，維持細(xì)胞活性，從而參與脂肪酸代謝、調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡信號等，為參與脂類代謝關(guān)鍵基因[19]。胰島素是脂肪生成主要調(diào)節(jié)因素之一，可促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)葡萄糖合成糖原和儲存葡萄糖，但過量葡萄糖在肝臟中轉(zhuǎn)化為脂肪，影響脂肪合成基因表達(dá)。王倩倩等在探討ACAA2 基因與鵝肝脂肪代謝關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，ACAA2基因表達(dá)與鵝肥肝形成密切相關(guān)，且在對鵝肝作不同濃度油酸、棕櫚酸和胰島素處理時，發(fā)現(xiàn)ACAA2 基因表達(dá)量均變化顯著[20]。

本研究成功克隆牦牛ACAA2 基因CDS 區(qū)序列，分析牦牛ACAA2 基因理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)ACAA2 基因主要在細(xì)胞質(zhì)中分布，細(xì)胞質(zhì)是新陳代謝主要場所，也是絕大部分物質(zhì)中間代謝（如醣酵解作用、氨基酸、脂肪酸和核苷酸代謝）場所，說明ACAA2蛋白在新陳代謝方面發(fā)揮作用，且與脂肪酸代謝有關(guān)。對其磷酸化分析顯示，該蛋白磷酸化位點(diǎn)數(shù)量最多的是絲氨酸（Ser），絲氨酸可促進(jìn)脂肪和脂肪酸新陳代謝，在肌肉組織合成過程中也發(fā)揮一定作用，此外，還是磷脂的主要成分之一，推測ACAA2可能調(diào)控牦牛脂肪代謝。

3.2 ACAA2基因在牦牛各組織中表達(dá)

分析ACAA2 基因在麥洼牦牛各組織中表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因在腎臟中表達(dá)量最高，其次是肝臟，在胸肌和臀肌中表達(dá)量最低。研究表明，研究固始雞×安卡雞F2資源群中胸肌IMF含量存在顯著差異的兩組極端樣品蛋白質(zhì)學(xué)，發(fā)現(xiàn)ACAA2 基因在試驗(yàn)個體對應(yīng)的胸肌和肝臟中均高豐度差異表達(dá)[21]。在檢測ACAA2基因是否受脂肪代謝相關(guān)因子調(diào)控中，發(fā)現(xiàn)脂肪酸和胰島素均可顯著影響該基因表達(dá)[20]。熒光定量結(jié)果顯示，ACAA2基因在肝臟中表達(dá)量較高，推測該基因在肝脂肪代謝過程中發(fā)揮作用。腎臟具有重吸收水分、葡萄糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等作用，腎臟脂質(zhì)含量與腎糖閾值（RTG）相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，腎臟脂質(zhì)沉積可能促進(jìn)腎小管葡萄糖重吸收，導(dǎo)致尿糖排泄減少，且腎臟脂質(zhì)沉積是造成RTG增高重要因素[22]，而該基因在腎臟中表達(dá)量最高，推測該基因在腎臟脂質(zhì)沉積中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外，心臟可為機(jī)體供應(yīng)氧和各種營養(yǎng)物質(zhì)，且心肌脂質(zhì)含量可作為肥胖患者心臟病生物指標(biāo)和治療靶點(diǎn)[23]；對心力衰竭患者心臟活檢發(fā)現(xiàn)，心肌脂肪變性可能參與肥胖相關(guān)性心肌病變發(fā)生[24]。而本研究ACAA2在心臟和腎臟中表達(dá)量相對較高，也間接反映該基因在牦牛心臟、腎臟組織中與脂肪代謝相關(guān)性，同時ACAA2 參與線粒體能量代謝過程，為器官提供能量以維持其生理功能。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功獲取牦牛ACAA2 基因CDS 序列，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白是一種不具有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定親水蛋白，蛋白結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。系統(tǒng)進(jìn)化樹和組織表達(dá)分析顯示，牦牛與黃牛親緣關(guān)系最近。與家犬親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，且ACAA2 基因在腎臟和肝臟組織中表達(dá)水平最高。