雜合型伴性矮小基因?qū)φｓw型雞脂肪沉積的影響

朱星浩，陳青，邵冰豪，郭鈺君，張向麗，杜鵬飛，朱瑤，黃艷群，陳文

河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002

0 引言

【研究意義】通過矮小型母本向正常體型公雞導入雜合狀態(tài)的 dw基因，以探究雜合型伴性矮小基因?qū)φｓw型雞的脂肪沉積及肌肉品質(zhì)的影響?！厩叭搜芯窟M展】性連鎖矮小型（sex-linked dwarf gene，dw基因）雞以其肉質(zhì)優(yōu)良、低飼料消耗、低基礎代謝率、高產(chǎn)蛋率和經(jīng)濟效益等育種價值，在當代家禽業(yè)中得到了廣泛的研究和應用[1-4]。固始雞和廣西瑤雞均是我國著名的地方優(yōu)良品種。固始雞具有肉質(zhì)優(yōu)良、脂肪含量適中等特點，但性成熟較晚；廣西瑤雞具有耐粗飼、皮脂薄、肉質(zhì)細嫩的特點，是培育低脂優(yōu)質(zhì)肉雞的良好遺傳素材[5]。在生產(chǎn)上通常選擇用產(chǎn)蛋性能高的性連鎖型矮小雞作為母本，地方雞種作為父本進行雜交配套，后代公雞表現(xiàn)為體型正常的雜合型，且能保持地方雞種的外貌特征，是保護和利用地方雞種的很好的途徑[6]。性連鎖型矮小雞，是由于生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）基因發(fā)生了錯義突變，導致生長激素受體功能喪失，從而影響生長激素（growth hormone，GH）的分泌[7-11]。dw基因呈隱性伴性遺傳，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一對雞健康無害的矮小基因[12]。dw基因在1935年首次被發(fā)現(xiàn)[13]，在8—10周齡時，純合矮小雞與正常雞在表型上有顯著區(qū)別[14]。純合dw基因可縮短成年雞只的跖骨長度[15]、減輕體重[12]，降低母雞產(chǎn)蛋期的采食量，從而降低規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化過程中的飼料成本，并有效地提高養(yǎng)殖效率[16]。有研究報道純合矮小雞在生長階段脂肪沉積能力遠遠高于正常體型雞[4,17]，其體脂含量約為正常雞的1.5倍[18]，其肌內(nèi)脂肪（IMF）含量也得到提高[19]。IMF在純合矮小雞體內(nèi)的更多沉積可能受到多種信號通路和晝夜節(jié)律相關基因的部分調(diào)控[19]。有研究報道雜合型伴性矮小雞雖表現(xiàn)為正常體型，但體重略低于正常型[20]。LILBURN等發(fā)現(xiàn)2—8周齡的雜合型正常雞比純合型正常肉雞有更多的腹部脂肪[21]。也有報道雜合伴性矮小公雞胴體特征和生長速率與正常型公雞無異，但正常型公雞與雜合型公雞的脂酶活性存在一定的差異[22]?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于雜合型伴性矮小基因?qū)﹄u的脂肪沉積效應尚沒有系統(tǒng)的研究。本研究將正常型母雞（ZDWW）和矮小型母雞（ZdwW）分別與正常體型的地方品種公雞（ZDWZDW）雜交，將雜交后代在同一條件下飼養(yǎng)。對雜交后代進行體尺指標、血清生化指標、肌纖維特性、胸肌、腿肌IMF含量的測定，并對體脂含量及其動態(tài)變化進行研究?！緮M解決的關鍵問題】揭示矮小型母本導入雜合狀態(tài)的dw基因?qū)蟠闹境练e及肌肉品質(zhì)的影響，掌握雜合型正常雞的脂肪沉積動態(tài)變化的規(guī)律，從而為利用母本矮小型生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)肉雞和地方雞種研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在35周齡，選用正常體型的固始公雞（ZDWZDW）分別與正常型母雞（固始雞，G；廣西瑤雞，Y；ZDWW）和矮小型母雞（快大型矮小雞，A；ZdwW）進行雜交，另選取正常體型的廣西瑤雞（ZDWZDW）分別與正常型母雞（固始雞，G；含有 12.5%的海蘭粉血統(tǒng)的固始雞與含淺蘆花基因的高產(chǎn)蛋雞的雜交后代，MH；ZDWW）和矮小型母雞（矮小型黃麻肉雞，R；矮小型黃麻肉雞與含淺蘆花基因的高產(chǎn)蛋雞的雜交后代，RH；ZdwW）進行雜交，雜交均以人工授精的方式進行。分別從不同雜交群體中各收集種蛋200枚進行同批孵化，將同批孵化出的1日齡雛雞在同一飼養(yǎng)條件下分開籠養(yǎng)，自由采食，自由飲水，執(zhí)行正常的免疫程序，實施規(guī)范的飼養(yǎng)管理。試驗地點在河南三高農(nóng)牧股份有限公司，試驗期為120 d，其中0—7周齡、8—17周齡分別飼喂育雛料（810飼料）和育成料（813飼料），日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (%)

1.2 體尺指標的測量

于60日齡、90日齡和120日齡從固始雞和廣西瑤雞的雜交后代中分別隨機選取100只后代（公母各半）進行體尺指標的測定。主要測定指標包括：脛長、脛圍。

測定方法如下：

脛長：從脛部上關節(jié)到第三、四趾間的直線距離。

脛圍：脛骨中部的周長。

1.3 樣品的采集

分別于60日齡和90日齡從固始公雞與正常型和矮小型母雞雜交的每個群體中分別隨機選取 10只后代（公母各半）進行屠宰。另于120日齡從固始雞和廣西瑤雞的雜交后代中各選取雞只10只（公母各半）進行屠宰并收集頸靜脈血樣至促凝管中。取同側同一位置胸肌組織塊（長2 cm，厚0.5 cm，寬0.5 cm）放置 4%多聚甲醛溶液保存以備石蠟切片制作，同時分離胸肌、腿肌用保鮮膜包裹放置-20℃冰箱保存以備進行肌內(nèi)脂肪含量分析。

1.4 體脂指標的測定

屠宰后，分離需測組織并稱重，主要測定指標包括：活重、全凈膛重、腹脂重、皮下脂肪厚、肌間脂肪寬。

測定方法如下：

活重：禁食12 h后的體重。

全凈膛重：屠體重為減去內(nèi)臟器官、頭、腳，保留肺臟、腎臟的重量。

腹脂重：包括腹脂（板油）及肌胃外脂肪的重量。

皮下脂肪厚：從尾根部切線向上沿第一切線剝離兩側皮膚，用游標卡尺測量此處的皮脂厚。

肌間脂肪寬：將胸部的皮掀開，在胸骨側突的部位用游標卡尺測量脂肪帶的寬度。

1.5 血清生化指標的測定

收集頸靜脈血液 10 mL于促凝離心管中傾斜靜置，以4℃，3 000 r/min離心10 min，取上部血清于-20℃冰箱保存，然后用全自動生化分析儀分析測試血清生化指標。主要測定指標為總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）含量。

1.6 肌內(nèi)脂肪含量的測定

每只雞胸肌、腿肌樣品各取10 g，采用索式提取法提取其肌內(nèi)脂肪并測定其含量，測定方法參考肉與肉制品游離脂肪含量的測定（國標GB/T-6434-2006）。每個樣品測定3次，以平均值作為樣品的肌內(nèi)脂肪含量。根據(jù)公式：肌內(nèi)脂肪含量IMF（100%）=（提取前總重-提取后的總重）/提取干物質(zhì)總重×100%，計算干物質(zhì)中IMF的含量。

1.7 肌纖維特性分析

常規(guī)方法制備石蠟切片（厚度為 2 μm），進行H.E.染色，將石蠟切片置于 10×10熒光倒置顯微鏡下，隨機選取3個視野并保存圖像，用圖像分析軟件（Image J）測量單個圖像總面積（S），并統(tǒng)計其中肌纖維數(shù)目（N），計算肌纖維密度（d）。利用Image J進行圖像分析，分別隨機抽測50根肌纖維橫截面積Si，然后用公式計算出肌纖維橫截面的直徑Di，再計算個體胸肌的肌纖維平均直徑。

d=S/N；Di=2(Si/π)0.5；平均肌纖維直徑 D=ΣD i/50。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2016軟件進行整理后，使用SPSS 22.0生物統(tǒng)計軟件進行雙因素和單因素方差分析，并用 Duncan多重比較進行顯著性檢驗。結果以平均值±標準差（mean ± SD）表示。

2 結果

2.1 F1代表型特征

正常型父本與正常型母本（后代簡稱母本正常型群體）和矮小型母本（后代簡稱母本矮小型群體）雜交的F1后代，均表現(xiàn)為正常體型。其中母本矮小型群體中的公雞（ZDWZdw）雖表現(xiàn)為正常型，但其含有隱性的伴性矮小基因（簡稱 dw雜合子），而母本正常型群體中公雞基因型為ZDWZDW（簡稱DW純合子）。其雜交遺傳模式見圖1。

2.2 不同日齡不同群體雞只體尺指標的比較

整合母本正常型和母本矮小型群體的體尺數(shù)據(jù)（包含來自固始雞和廣西瑤雞為父本的雜交群體）發(fā)現(xiàn)：在60日齡、90日齡和120日齡時，公雞的脛長、脛圍均顯著大于母雞（P＜0.01，表2），母本矮小型群體的脛長、脛圍均大于母本正常型群體。在60日齡的公雞中，母本矮小型公雞的脛長顯著大于母本正常型公雞（P＜0.05，表2），母本矮小型公雞的脛圍顯著大于母本正常型公雞（P＜0.01，表2）；在母雞中，母本矮小型母雞的脛長、脛圍顯著大于母本正常型母雞（P＜0.01，表2）。

在90和120日齡時，在公雞中，母本矮小型公雞與母本正常型公雞間的脛長無顯著性差異，母本矮小型公雞的脛圍顯著大于母本正常型公雞（P＜0.05，表2）；在母雞中，母本矮小型母雞的脛長、脛圍顯著大于母本正常型母雞（P＜0.01，表2）。

2.3 固始雞雜交后代脂肪沉積的動態(tài)變化

選擇固始雞雜交后代進行母本正常型和母本矮小型雜交后代的脂肪沉積規(guī)律的分析發(fā)現(xiàn)：在母本正常型群體中，公雞的腹脂重和腹脂率一直處于低水平，甚至120日齡時的腹脂重和腹脂率均顯著低于60日齡（P＜0.05，圖 2-A、B）；公雞的皮下脂肪厚、肌間脂肪寬在不同日齡間差異不顯著（圖2-C、D）；而母雞的體脂總體呈現(xiàn)隨日齡的增加而上升的趨勢，120日齡時母雞的體脂指標（腹脂重、腹脂率、皮下脂肪厚和肌間脂肪寬）較60日齡、90日齡均有顯著的提升（P＜0.05，圖2）；母雞60日齡和90日齡間的體脂指標差異不顯著。而在母本矮小型群體中，公、母雞均呈現(xiàn)了與母本正常型群體中的母雞相似的脂肪沉積變化特性。母本矮小型群體的公、母雞腹脂重、皮下脂肪厚和肌間脂肪寬均隨日齡逐漸升高，特別在120日齡時顯著升高。120日齡的腹脂重、皮下脂肪厚和肌間脂肪寬均顯著高于60或90日齡（P＜0.05，圖2-A、C、D）；此外，母本矮小型基因也一定程度上提高了后代雞只90日齡的脂肪沉積，特別是90日齡的公雞肌間脂肪寬顯著高于60日齡（P＜0.05）。

進行同一群體、同一日齡不同性別雞只間的比較，發(fā)現(xiàn)在母本正常型群體中，120日齡時母雞腹脂重和腹脂率極顯著高于公雞（P＜0.01，圖 2-A、B）；皮下脂肪厚、肌間脂肪寬在三個時間點公、母間均無顯著差異（圖 2-C、D）。而在母本矮小型群體中，60日齡、90日齡、120日齡公、母雞間的體脂指標（包括腹脂重、腹脂率、皮下脂肪厚和肌間脂肪寬）均無顯著差異（P＞0.05，圖2）。

進行同一日齡、同一性別不同群體雞只的比較發(fā)現(xiàn)，母本矮小型群體公雞（dw雜合子）在90日齡和120日齡時各項體脂指標（腹脂重、腹脂率、皮下脂肪厚和肌間脂肪寬）均顯著或極顯著高于同日齡的母本正常型群體公雞（DW純合子），而僅120日齡母本矮小型母雞的腹脂重顯著高于母本正常型群體中的母雞（P＜0.05，圖2-A）。

表2 不同日齡不同群體雞只體尺性狀的比較Table 2 Comparison of body measurement traits among different populations at different ages

2.4 120日齡不同群體雞只體脂指標的比較

進一步整合120日齡固始雞和廣西瑤雞雜交后代的體脂數(shù)據(jù)，進行雙因素方差分析（表 3），發(fā)現(xiàn)群體因素和性別因素對活重和脂肪沉積相關指標（包括腹脂重、腹脂率、肌間脂肪寬和皮下脂肪厚）的效應均達到顯著水平，此外皮下脂肪厚的群體和性別的互作效應也達到顯著水平，故對皮下脂肪厚這一指標分別以群體和性別進行單因素分析。

在活重指標中，總體上公雞的活重大于母雞，母本矮小型群體的活重大于母本正常型群體。在公雞中，母本矮小型公雞的活重極顯著大于母本正常型公雞（P＜0.01，表3）。在母雞中，母本矮小型母雞的活重也大于母本正常型母雞（P＜0.01，表3）。

進一步的分析發(fā)現(xiàn)，在母本正常型群體中，公雞的脂肪沉積少，母雞的腹脂重、腹脂率、肌間脂肪寬、皮下脂肪厚均顯著高于公雞（P＜0.01，表 3），腹脂重、腹脂率在公母間有近10倍的差異。而在母本矮小型群體中，公母雞間在腹脂重、腹脂率、肌間脂肪寬、皮下脂肪厚指標上均無顯著差異。母本矮小型公雞的脂肪沉積能力較母本正常型公雞有大幅提升，母本矮小型群體公雞（dw雜合子）的腹脂重、腹脂率、肌間脂肪寬、皮下脂肪厚均顯著高于母本正常型群體公雞（DW純合子，P＜0.01，表3）；而在母雞中，母本矮小型群體的體脂相關指標和母本正常型差異不顯著（表3）。

2.5 120日齡雞只的血脂指標的比較

采用雙因素方差分析對血脂指標進行分析，發(fā)現(xiàn)群體因素對幾個血脂指標的效應均未達到顯著水平，而性別因素對TG、HDL的效應達到顯著水平，群體因素和性別因素對血脂指標的互作效應均不顯著（表4）。母本矮小型與母本正常型群體間在 TC、TG、LDL、HDL含量上均無顯著差異。母本矮小型母雞的TG含量顯著高于公雞（P＜0.05）。母本正常型公雞的HDL極顯著高于母雞（P＜0.01）。

表3 性別和群體對120日齡不同雜交組合雞脂肪沉積的影響Table 3 Effects of sex and population on fat deposition capacity of chicken cross combinations on 120 days

表4 性別、群體對120日齡不同雜交組合雞血清生化指標的影響Table 4 The interaction of sex and population on serum biochemical indexes of chicken cross combinations on 120 days

2.6 120日齡雞只IMF含量的比較

雙因素方差分析（表 5）顯示，群體因素對胸肌IMF含量達到顯著水平（P=0.017），對腿肌IMF的效應接近顯著水平（P=0.076）。母本矮小型后代胸肌（P=0.017）和腿?。≒=0.076）IMF含量均高于母本正常型。其中母本矮小型母雞與母本正常型母雞的胸肌IMF含量的差異未達到顯著水平，母本矮小型公雞（DW雜合子）的胸肌IMF含量顯著高于母本正常型公雞（DW純合子，P＜0.01）。總體來說，腿肌的IMF含量顯著高于胸肌（P＜0.05，圖3）。

2.7 120日齡雞只的肌纖維特性的比較

母本正常型后代肌纖維密度均呈現(xiàn)高于母本矮小型的趨勢（P=0.089），肌纖維面積、肌纖維直徑在母本矮小型和母本正常型間無顯著差異。母雞肌纖維密度顯著低于公雞（P=0.018），而其肌纖維面積（P= 0.088）、肌纖維直徑（P=0.064）呈現(xiàn)高于公雞的趨勢（表6）。

表5 性別、群體對120日齡不同雜交組合雞IMF含量的影響Table 5 Effects of sex and population on intramuscular fat content of chicken cross combinations on 120 days

表6 性別、群體對120日齡不同雜交組合雞胸肌肌纖維特性的影響Table 6 Effects of sex and population on breast muscle fiber of chicken cross combinations on 120 days

3 討論

3.1 雜合型伴性矮小基因?qū)φｓw型雞體尺性狀的影響

MARKS[15]研究發(fā)現(xiàn)純合dw基因可縮短成年雞只的跖骨長度。BLOHOWIAK等[23]研究發(fā)現(xiàn)純合正常型與雜合型正常雞的脛長差異不顯著，但均大于矮小雞。LILBURN[21]等研究發(fā)現(xiàn)8周齡時慢速型的純合正常型雞的脛長顯著低于雜合型正常雞，而快速型的純合正常雞的脛長略高于雜合型正常雞。MERAT[24]等研究發(fā)現(xiàn)在8、17和52周齡時，由于dw基因的導入脛長性狀存在雜種優(yōu)勢。因此我們猜測在不同日齡間母本矮小型雞只的脛長不僅沒有短于母本正常型雞只反而長于母本正常型雞只?？赡芘c dw基因的雜交優(yōu)勢有關，其具體的原因還值得進一步研究。

3.2 雜合型伴性矮小基因?qū)φｓw型雞脂肪沉積的影響

雞過量脂肪主要沉積在腹部和皮下，腹脂率和皮下脂肪厚是評價家禽脂肪含量高低的重要指標[25]。在正常情況下，公雞的脂肪沉積較少，而母雞的脂肪沉積相對較多[26-27]。因此在生產(chǎn)上有通過公雞的閹割以提高其體脂沉積[28]，進而提高雞肉風味的傳統(tǒng)。

性別對屠體性狀的影響主要與雄性激素有關，雄性激素會促進肌肉發(fā)育,但會降低脂肪沉積[29]。據(jù)文獻報道純合的dw基因不僅可以縮短跖骨的長度，還可以增加胴體脂肪含量[18-19]。本研究根據(jù)不同生長速度的地方優(yōu)質(zhì)雞的上市日齡及雞只體脂沉積多發(fā)生在育成期的特點[30]，首先對固始雞雜交后代不同生長時期的脂肪沉積變化進行研究發(fā)現(xiàn)60日齡母本矮小型公雞比母本正常型公雞有更多的腹部脂肪（圖2-A）。此外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)母本矮小型公雞（ZDWZdw）表現(xiàn)了完全不同于母本正常型公雞（ZDWZDW）的脂肪沉積變化規(guī)律，在90日齡后脂肪沉積顯著增加。其90日齡和120日齡的體脂沉積能力顯著高于母本正常型群體的公雞（圖2）。顯示了用正常公雞與性連鎖dw母雞雜交的后代盡管體型正常，但雜合狀態(tài)的dw基因在發(fā)揮作用。進一步整合來源于固始雞和廣西瑤雞為父本的雜交群體分析雜合型矮小基因?qū)?20日齡雞只脂肪沉積的效應發(fā)現(xiàn)，母本矮小型公雞的脂肪沉積能力顯著高于母本正常型群體的公雞（表 3），進一步顯示雜合狀態(tài)的 dw基因可顯著促進生長階段公雞的腹部脂肪、皮下脂肪和肌間脂肪的沉積。

3.3 雜合型伴性矮小基因?qū)φｓw型雞 IMF含量的影響

IMF是改善肌肉口感和嫩度的關鍵因素，其含量對評價肉的感官特性具有重要作用[31-32]。YE等[19]研究報道7周齡時，矮小雞的IMF含量是正常雞的1.2倍。本研究證明母本矮小型公雞的胸肌IMF含量極顯著高于母本正常型公雞，顯示隱性伴性的 dw基因在正常體型的雜合公雞IMF沉積中仍在發(fā)揮著重要的作用，也進一步顯示了利用 dw基因可改善公雞的脂肪沉積特性從而提高雞肉品質(zhì)的潛在應用價值。此外本研究也發(fā)現(xiàn)了母本矮小型群體的母雞（ZDWW）的脂肪沉積在一定程度上高于母本正常型群體里的母雞（ZDWW），顯示母雞盡管不含有dw基因，但母本效應仍在發(fā)揮著一定的作用。有研究表明性連鎖矮小雞的骨骼肌纖維直徑小于正常雞，肌纖維密度顯著高于正常雞[6,31]，dw基因在8—12周齡之間對肌肉纖維發(fā)育有影響，dw基因?qū)蝹€肌纖維橫截面積有顯著影響，而對肌纖維總數(shù)沒有影響[14]。本研究發(fā)現(xiàn)雜合狀態(tài)的dw基因?qū)±w維特性無明顯影響。

3.4 雜合型伴性矮小基因?qū)φｓw型雞血脂指標的影響

血清脂類生化指標是反映機體脂肪代謝的重要指標。BURGHELLE-MAYEUR等[33]研究發(fā)現(xiàn)dw基因沒有顯著改變血漿中甘油三酯、卵磷脂、總膽固醇或極密度脂蛋白的含量。我們的研究結果與之一致，母本矮小型群體公雞與母本正常型群體公雞的血脂指標沒有顯著的差異，說明雜合伴性 dw基因?qū)φ１硇碗u的血脂指標沒有顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)120日齡母本矮小型群體的公雞的腹部脂肪等指標顯著高于母本正常型群體的公雞，但兩者的血脂指標并沒有顯著的差異。進而說明了母本矮小型群體公雞的血脂指標是獨立于腹部脂肪沉積。WALTON等[34]在人類中研究發(fā)現(xiàn)男性的TG、TC、HDL的含量獨立于體脂含量和分布。也有研究在肉雞品系中發(fā)現(xiàn)血漿蛋白與體脂之間無顯著關系[35]。

4 結論

雜合伴性矮小型基因顯著改善了正常體型公雞的脂肪沉積特性，提高了公雞的腹部脂肪、皮下脂肪和肌間脂肪的沉積；改善了胸肌的肌內(nèi)脂肪含量；而對血脂指標無顯著影響；對肌纖維特性無顯著影響。提示，生產(chǎn)上可以用性連鎖矮小雞做母本來改善商品代公雞的脂肪沉積。