利用多重PCR和快提DNA結(jié)合快速鑒定甜瓜雜種純度

賀玉花 戶克云 趙光偉 孔維虎 張健 徐永陽

摘? ? 要：純度是決定種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。以眾天10號和其父母本為研究材料，將快提DNA法與多重PCR法相結(jié)合，成功建立一套三重PCR甜瓜雜種純度快速鑒定體系。采用堿裂解快速提取DNA的方法，可以在5 min內(nèi)提取96個DNA;采用三重PCR，能有效克服單一PCR在種子純度鑒定中速率慢的缺陷。試驗中SSR分子鑒定眾天10號雜交種純度為100%，與田間鑒定結(jié)果一致。為甜瓜乃至作物雜種種子的純度鑒定提供了一套精度更高、速度更快、成本更低的技術(shù)體系。

關(guān)鍵詞：甜瓜;SSR;多重PCR;快提DNA;純度鑒定

中圖分類號：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）12-023-05

Abstract： Purity is one of the most important indicators of seed quality. A hybrid Zhongtian No. 10 and their parents were used in this study; and by combining the rapid DNA extraction method with the multiple PCR， a triple PCR purity identification system of hybrid seeds in melon was established. The rapid alkaline lysis method was used to extract the genome DNA， which can extract the genomic DNA of 96 samples in five minutes. The triplex PCR could effectively overcome the shortcomings of the single-PCR with slow speed in seed purity identification. The result of SSR molecular identification was that the purity of the Zhongtian No. 10 hybrid was 100%， and it was no significant difference with field identification. This study provides a technical system with the advantages of high-accuracy， rapid and low-cost for the purity identification of hybrid seeds in melon and other crop.

Key words： Melon; SSR; Multiplex PCR; Rapid DNA extraction; Purity identification

甜瓜（Cucumis melo L.）又名蜜瓜或香瓜，原產(chǎn)于印度、非洲熱帶沙漠地區(qū)[1-2]，是喜溫、耐熱性較強(qiáng)的一年生蔓生作物。中國甜瓜面積占世界總面積的45%以上，產(chǎn)量占55%以上[3]，是我國重要的經(jīng)濟(jì)水果之一。市面上銷售的甜瓜種子大部分為雜交1代，而種子純度是生產(chǎn)和銷售過程中重要的指標(biāo)之一。目前，種子純度的檢測方法主要采用傳統(tǒng)的田間形態(tài)學(xué)方法，周期較長且花費(fèi)較高，受自然環(huán)境條件影響大。分子標(biāo)記鑒定技術(shù)具有周期短、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)[4]。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）是目前最常用的純度鑒定標(biāo)記之一，具有多態(tài)性、共顯性和高度重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于許多作物的雜種純度鑒定[4-13]。

在利用SSR分子標(biāo)記鑒定雜種純度的過程中，DNA提取和PCR擴(kuò)增是關(guān)鍵的步驟。傳統(tǒng)的DNA提取方法試驗操作復(fù)雜，費(fèi)時費(fèi)力，改良后的堿裂解快提DNA方法可在5 min提取96個DNA，大大縮短鑒定周期[14]。在雜種純度鑒定過程中，一般需要2～3對引物才能準(zhǔn)確鑒定出雜種的純度，而傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)一般加入1對引物。多重PCR（multiplex PCR）可以在同一PCR反應(yīng)體系里加入2對及以上標(biāo)記，能同時擴(kuò)增出多個核酸片段，以盡可能少的消耗獲得盡可能多的遺傳信息，被廣泛應(yīng)用在多種作物雜種純度鑒定中[15-17]。胡倩梅等[15]利用多重PCR對甜瓜雜交1代品種進(jìn)行純度鑒定，多重PCR相較于單一PCR能夠縮短工作時間，減少試劑消耗，增加鑒定的準(zhǔn)確性。目前，快提DNA方法在白菜[18]等作物雜種純度鑒定中得到應(yīng)用，在甜瓜種子純度的檢測中尚未得到應(yīng)用，更沒有和多重PCR結(jié)合，快提DNA的質(zhì)量是否滿足多重PCR對于DNA質(zhì)量的要求，有待進(jìn)一步研究。

筆者以眾天10號雜交種為材料，利用多重PCR和快提DNA法結(jié)合快速鑒定甜瓜雜種純度，結(jié)合田間鑒定進(jìn)行驗證，建立一套快速、準(zhǔn)確的純度鑒定體系。此方法不僅提高了純度鑒定的準(zhǔn)確性，而且大大縮短了鑒定周期，保障了農(nóng)民和銷售商的利益。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2020年9—12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所進(jìn)行。供試材料為雜交甜瓜品種眾天10號及其相對應(yīng)的親本：母本P1和父本P2，其中P1和P2為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所甜瓜育種課題組選育的高代自交系。

1.2 試驗材料種植

選取籽粒飽滿無傷的種子，眾天10號種子200粒，親本種子各20粒，55 ℃溫湯浸種4 h，播種于事先裝有吸好水的紅色陶土的保鮮盒內(nèi)，播種后在種子上蓋上一層吸好水的紅色陶土，用保鮮膜將保鮮盒密封保水（留有少量通氣孔），放置于光照培養(yǎng)箱（全日照，溫度30 ℃）中育苗。待種子破土后，揭去保鮮膜，在種子表面適當(dāng)噴灑水分，保持陶土濕潤即可。待子葉完全展開，進(jìn)行取樣鑒定。

田間種植純度鑒定：父母本各種植10株作為雜種植株表型性狀對比，每個小區(qū)種植雜種1代植株100株，3次重復(fù)，在果實充分發(fā)育成熟時觀察并統(tǒng)計植株表型性狀、進(jìn)行純度鑒定。

1.3 DNA提取方法

DNA提取采用改良的堿裂解快提DNA法[14]，具體如下：首先將96孔PCR板（板1）放在事先存放在-20 ℃冰箱的冰盒上，并用連打槍加入每孔80 μL的滅菌TE緩沖溶液（0.05 mol·L-1 Tris-HCl（pH=7.0）+0.1 mmol·L-1 EDTA）;用鑷子撕取面積約為0.3 mm2的甜瓜子葉葉片組織，放入另一塊放在冰盒上的96孔PCR板（板2）中;將放入葉片的PCR板（板2）中每孔分別加入2個直徑為2 mm的小鋼珠;用連打槍在放有葉片組織的96孔板（板2）中加入100 μL 0.25 mol·L-1的NaOH溶液;用硅膠墊蓋在加入葉片、小鋼珠和NaOH溶液的PCR板上，并放到組織研磨器中將其固定;用組織研磨器在頻率55 Hz、時長60 s的設(shè)置下將葉片搗碎，用排槍快速吸取8 μL組織研磨液加入到事先準(zhǔn)備好的有80 μL的TE緩沖溶液的PCR板（板1）中，用排槍吸打均勻，并用離心機(jī)（2000 r·min-1）離心2 min，放于4 ℃冰箱保存待用。此過程需要注意的是加入NaOH溶液后的操作必須在5 min之內(nèi)完成。

1.4 SSR分析及多重PCR引物組合的選擇

SSR引物來源于Cucurbit Genomics Database網(wǎng)站（網(wǎng)址：http：//www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi），由上海生物工程有限公司合成。將覆蓋甜瓜全基因組的326對SSR引物分別在2個親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，根據(jù)差異引物產(chǎn)物的片段大小，選擇引物間產(chǎn)物片段大小相差60 bp及以上的引物組合，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增[15]。

1.5 PCR程序及電泳檢測

普通PCR反應(yīng)體系及程序：反應(yīng)體系（10 μL）包含：Magic Mix×2.0 5 μL，無菌去離子水3 μL，引物（10 μmol·μL-1） 1 μL，DNA模板（50 ng·μL-1） 1 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。4 ℃保存。

多重PCR反應(yīng)體系及程序：選擇3對SSR標(biāo)記進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（10 μL）包含：Magic Mix×2.0 5 μL，無菌去離子水1 μL，3對SSR引物（10 μmol·μL-1） 各1 μL（上游引物和下游引物各0.5 μL）共3 μL，DNA模板（50 ng·μL-1）1 μL。擴(kuò)增程序：采用Touch-down擴(kuò)增程序，94 ℃變性5 min;94 ℃變性30 s，65～56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低1 ℃;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，27個循環(huán);72 ℃延伸7 min。4 ℃保存。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物加2 μL 6×loading buffer上樣，用8%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，每個點(diǎn)樣孔上樣量1.5 μL，200 V恒電壓電泳1.5 h。采用快速銀染法進(jìn)行檢測。

1.6 分子標(biāo)記的純度鑒定結(jié)果與田間純度鑒定結(jié)果的比較

分子標(biāo)記純度鑒定：根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳條帶，只具有母本帶型的后代為假雜種，具有父本和母本合并特征帶型的為真雜種，統(tǒng)計真雜種和假雜種的數(shù)量，計算雜交種純度。分子標(biāo)記鑒定品種純度/%=（真雜種數(shù)/總檢測數(shù)）×100。

田間純度鑒定：根據(jù)株型、果實性狀等形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行鑒定，取3個重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值為最終的田間鑒定結(jié)果。最終將分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間SSR引物篩選

將覆蓋甜瓜全基因組的326對SSR引物分別在2個親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，其中，79對引物在親本之間顯示出多態(tài)性，多態(tài)性比率為24.23%。

2.2 多重PCR組合的建立和擴(kuò)增條件篩選

從79對差異引物中，選取擴(kuò)增條帶清晰、沒有多余雜帶、可以明顯區(qū)分開的引物9對（表1）。根據(jù)表1中9對SSR引物PCR產(chǎn)物片段長度，選取20組多重PCR組合（表2）進(jìn)行多重PCR組合和擴(kuò)增條件的篩選。

20組多重PCR組合分別利用普通PCR反應(yīng)條件（圖1）和touch-down PCR反應(yīng)條件（圖2），在普通PCR條件下，擴(kuò)增產(chǎn)物中有較多雜帶;在touch-down PCR反應(yīng)條件下，條帶清晰，雜帶較少。因此，touch-down PCR反應(yīng)條件比普通PCR條件更適合作為多重PCR反應(yīng)條件，同時也說明快提DNA的方法可以應(yīng)用到多重PCR。根據(jù)圖2所示，在touch-down PCR反應(yīng)條件下，引物154、242和284沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，引物20、118條帶都不清晰。所以，在9對引物中，5對引物（20、118、154、242和284）不可以和其他引物進(jìn)行組合進(jìn)行多重PCR，4對引物（85、86、157和194）可以重組進(jìn)行多重PCR。引物85、86、157和194分別組成了組合4（引物85、86和194）和組合10（引物86、157和194），而組合4中引物85在父母本間的條帶接近，影響雜交1代雜交帶讀帶的準(zhǔn)確性，而組合10中引物157在雜交F1中條帶清晰。最終，選擇組合10在touch-down PCR反應(yīng)條件下，對雜交種子進(jìn)行純度鑒定。

2.3 多重SSR標(biāo)記純度鑒定與大田純度鑒定的對比

以組合10（引物86、157和194）為三重PCR組合，以touch-down PCR反應(yīng)條件作為PCR反應(yīng)條件，對192份眾天10號雜交種進(jìn)行純度鑒定。圖3顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物可以明顯分為3個區(qū)域，第Ⅰ區(qū)域為引物86，第Ⅱ區(qū)域為引物194，第Ⅲ區(qū)域為引物157，均為父母本雜合帶型，為真雜種，由此得出眾天10號甜瓜品種的純度為100%。田間種植中，通過觀察田間性狀和果實性狀等指標(biāo)，對眾天10號雜交種進(jìn)行純度鑒定，其田間純度為100%，與多重PCR鑒定結(jié)果一致。試驗結(jié)果表明，利用多重PCR和堿裂解快提DNA結(jié)合可以快速鑒定甜瓜雜種純度。

3 討論與結(jié)論

種子純度是種子質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一，SSR分子標(biāo)記純度鑒定技術(shù)被廣泛應(yīng)用于許多作物的雜種純度鑒定中[4-13]。在利用SSR分子標(biāo)記鑒定雜種純度過程中，DNA提取和PCR擴(kuò)增是關(guān)鍵的步驟。傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)一般加入1對引物，而雜種純度鑒定一般需要2～3對引物才能準(zhǔn)確鑒定出雜種的純度，筆者利用多重PCR可以在同一PCR反應(yīng)體系里加入2對及以上分子標(biāo)記，能夠縮短工作時間，減少試劑消耗，提高鑒定的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)的CTAB提取DNA法整個過程至少需要2 h，且試驗操作復(fù)雜，筆者利用改良后的堿裂解快提DNA方法可在5 min內(nèi)提取96個DNA，且不需要稀釋可以直接應(yīng)用于PCR擴(kuò)增，大大縮短鑒定周期。

雜交種子常規(guī)SSR純度檢測流程一般包括DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳、結(jié)果分析等4個步驟。筆者從DNA 提取和PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)對整個過程進(jìn)行了優(yōu)化，而近年來通過優(yōu)化PCR程序來縮短PCR擴(kuò)增時間的快速PCR體系也不斷應(yīng)用于其他作物[17]的純度鑒定中，快速PCR是否能與多重PCR和快提DNA結(jié)合應(yīng)用于甜瓜雜種純度鑒定，有待進(jìn)一步研究。

筆者以雜交甜瓜品種眾天10號及其對應(yīng)親本為材料，利用多重PCR和堿裂解快提DNA結(jié)合快速鑒定甜瓜雜種純度，建立一套快速、準(zhǔn)確的純度鑒定體系，此方法不僅提高了純度鑒定的準(zhǔn)確性，且能夠在1個工作日完成整個分子試驗全部流程，大大縮短了鑒定周期，為利用分子標(biāo)記進(jìn)行甜瓜雜種純度鑒定的相關(guān)研究提供了一定的參考。

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