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    基于重水拉曼技術(shù)的氯己定對(duì)白色念珠菌抑菌效能的研究

    2021-01-13 03:46:00李帆張利娟譚凱璇張穎盧潔李?yuàn)檴?/span>楊芳
    關(guān)鍵詞:重水拉曼念珠菌

    李帆 張利娟 譚凱璇 張穎 盧潔 李?yuàn)檴?楊芳

    1.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 青島266003;2.青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心 青島266071;3.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 大連116044

    氯己定(chlorhexidine,CHX)具有相當(dāng)強(qiáng)的廣譜抑菌、殺菌效果,對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌以及真菌均有效[1]。CHX 作為漱口水和根管沖洗液的添加成分,其效果較為確切[2]。臨床常用CHX 的藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%~2%。白色念珠菌,是口腔中最常分離到的條件致病真菌之一[3],是口腔真菌感染中最常見的真菌種類[4],也是持續(xù)性根管感染、難治性根尖周炎及根管治療失敗患者最常分離到的真菌種類[5]。

    最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentra?tion,MIC)是定量評(píng)價(jià)藥物抑菌效能的金標(biāo)準(zhǔn)和重要指標(biāo)[6],但在該濃度下,微生物生長(zhǎng)雖受到抑制,細(xì)胞代謝的抑制情況卻不清楚。重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼顯微光譜技術(shù),是重水標(biāo)記技術(shù)和拉曼技術(shù)的結(jié)合。重水可以使有代謝活性微生物的拉曼圖譜中特定區(qū)域(2 040~2 300 cm?1)出現(xiàn)重水峰(C?D 峰),基于ΔC?D ratio [(當(dāng)前時(shí)間與0 h 的C?D ratio(重水峰所占比例)差值]測(cè)定的最小代謝活性抑制濃度(minimum inhibitory con?centration based on metabolic activity,MIC?MA)[7?8]能定量評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物實(shí)時(shí)代謝活性的影響[8]。該技術(shù)已普遍應(yīng)用于微生物種類鑒別的研究[7],也曾廣泛用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)菌代謝活性的影響[8],但有關(guān)藥物對(duì)真菌代謝活性影響的相關(guān)文獻(xiàn)及研究還非常少見。

    系統(tǒng)了解CHX 對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)及代謝活性的影響有利于全面了解白色念珠菌的藥敏性,指導(dǎo)臨床合理使用藥物,減少耐藥菌株的產(chǎn)生及疾病反復(fù)感染和治療失敗的發(fā)生概率。本研究采用肉湯稀釋法和重水拉曼技術(shù),研究重水對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響及該菌對(duì)重水的吸收規(guī)律,以評(píng)價(jià)重水拉曼技術(shù)的普適性;同時(shí)測(cè)定CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC 和MIC?MA,評(píng)價(jià)CHX 對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)及代謝的抑制效果。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料與菌株培養(yǎng)

    實(shí)驗(yàn)材料:實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株白色念珠菌CICC32380 購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心;SDA 固體培養(yǎng)基,以蛋白胨10 g、瓊脂20 g、葡萄糖40 g加蒸餾水定容至1 L,115 ℃下高溫滅菌20 min,趁熱倒入培養(yǎng)皿,凝固后備用;RPMI1640培養(yǎng)基用無(wú)菌雙蒸水溶解,每1 L 加入2 g NaHCO3,用HCl 和NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為7.0,過(guò)膜濾菌,備用;質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%~21%CHX,購(gòu)自青島漢爵生物技術(shù)有限公司。

    實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng):將白色念珠菌CICC32380劃線接種到Y(jié)PD 固體培養(yǎng)基,37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h,取白色念珠菌菌落,轉(zhuǎn)種到RPMI1640液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r·min?1搖床中培養(yǎng)12 h,備用。

    1.2 重水拉曼技術(shù)普適性評(píng)價(jià)

    1.2.1 重水環(huán)境對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響 與其他同位素標(biāo)記物相比,重水價(jià)格便宜,對(duì)微生物干擾小[7];但也有研究[9?10]表明,重水可能抑制細(xì)胞的活動(dòng),本實(shí)驗(yàn)在重水環(huán)境中培養(yǎng)白色念珠菌,觀察對(duì)其生長(zhǎng)的影響。將實(shí)驗(yàn)菌株接種于含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%、10%、20%、30%、40%、50%)重水的培養(yǎng)基中(0%為對(duì)照組)培養(yǎng)9 h,利用分光光度計(jì)(上海屹譜儀器制造有限公司)測(cè)定白色念珠菌吸光度值OD600隨時(shí)間的變化,檢測(cè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水對(duì)其生長(zhǎng)的影響。

    1.2.2 白色念珠菌對(duì)重水的吸收規(guī)律 另取上述接種于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水中的實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)12 h,于不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、2、3、4、6、8、12 h)分別取樣進(jìn)行拉曼技術(shù)檢測(cè),以評(píng)價(jià)該菌株對(duì)重水的吸收規(guī)律。

    1.3 采用肉湯稀釋法測(cè)定CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC

    取YPD 固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h 的菌落,置于5 mL 無(wú)菌水中,渦旋15 s;調(diào)整菌密度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn),稀釋1 000 倍,最終菌密度為每毫升1 000~5 000 個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組:只含培養(yǎng)基,以排除培養(yǎng)基污染的可能性;陰性對(duì)照組:含有培養(yǎng)基+實(shí)驗(yàn)菌,以證明實(shí)驗(yàn)菌株可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好;實(shí)驗(yàn)組:含有培養(yǎng)基+實(shí)驗(yàn)菌+不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHX。實(shí)驗(yàn)組中,通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基和CHX 配比,使CHX 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最終為32、16、8、4、2、1 μg·mL?1。37 ℃溫度下培育24 h,利用分光光度計(jì)分別測(cè)量0 h 和24 h 的OD600值,計(jì)算ΔOD600(0 h 和24 h 的OD600吸光度值的差值),ΔOD600≤0.05對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度,即CHX對(duì)白色念珠菌的MIC[11]。

    1.4 采用重水拉曼技術(shù)測(cè)定CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC?MA

    將實(shí)驗(yàn)菌株接種至含0、2、4、8、12 μg·mL?1CHX的RPMI1640培養(yǎng)基(含30%重水)中,37 ℃培養(yǎng)8 h,按時(shí)間梯度取樣,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取0.2μL測(cè)量樣品點(diǎn)在CaF2玻片上,風(fēng)干。利用LabRam HR 型的改良后共聚焦拉曼熒光顯微鏡(Shelab 公司,美國(guó))采集拉曼圖譜(參數(shù)設(shè)定如下:激光源為532 nm 的Nd:YAG 激光,樣品上激光強(qiáng)度為50 mW,照射時(shí)間1 s,分光光柵300 grooves·mm?1,拉曼圖譜范圍400~3 500 cm?1),在不同視野中隨機(jī)采集30~50 個(gè)細(xì)胞的拉曼圖譜。圖譜經(jīng)過(guò)減背景、基線歸一化和最大值標(biāo)準(zhǔn)化處理,即可計(jì)算出C?D ratio值。計(jì)算ΔC?D ratio(培養(yǎng)8 h與0 h的C?D ratio 差值),當(dāng)ΔC?D ratio≤0 且標(biāo)準(zhǔn)差<0.005即為CHX對(duì)白色念珠菌的MIC?MA[8]。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    本實(shí)驗(yàn)中定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,統(tǒng)計(jì)方法采用T檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 重水拉曼技術(shù)普適性評(píng)價(jià)

    2.1.1 重水環(huán)境對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響 白色念珠菌在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水環(huán)境下的生長(zhǎng)狀態(tài)見圖1。生理狀態(tài)下,白色念珠菌的生長(zhǎng)過(guò)程包括延遲期(0~2 h)、對(duì)數(shù)期(2~8 h)、穩(wěn)定期(8~9 h);與對(duì)照組相比,白色念珠菌在10%~30%重水中生長(zhǎng)沒(méi)有受到明顯抑制(P>0.05);在40%~50%重水中,生長(zhǎng)則受到明顯抑制(P<0.05)。該結(jié)果提示,白色念珠菌能夠耐受30%的重水,重水的毒性并不是本實(shí)驗(yàn)的限制性因素。

    2.1.2 白色念珠菌對(duì)重水的吸收規(guī)律 白色念珠菌在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水環(huán)境中培養(yǎng)12 h,在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拉曼檢測(cè)的結(jié)果見圖2 和圖3。與對(duì)照組相比,10%重水環(huán)境下,即出現(xiàn)C?D 峰(圖2);且C?D ratio 與重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正相關(guān)關(guān)系(R2=0.989 4,P<0.05;圖3)。該結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)菌株能活躍代謝重水并通過(guò)拉曼圖譜檢測(cè)到,因此本研究選擇不影響實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)又能產(chǎn)生明顯C?D 峰的重水質(zhì)量分?jǐn)?shù),即30%重水作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的默認(rèn)重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    圖1 白色念珠菌CICC32380在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水中OD600隨時(shí)間的變化Fig 1 Temporal change of OD600 for Candida albicans CICC32380 under various quality score D2O

    圖2 含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水環(huán)境下白色念珠菌CICC32380 的單細(xì)胞拉曼圖譜變化Fig 2 Change of single cell Raman spectrum for Candida albicans CICC32380 under various quality score D2O

    白色念珠菌在30%重水環(huán)境中,其C?D ratio及OD600隨時(shí)間的變化趨勢(shì)見圖4和圖5。C?D峰在加入重水后迅速出現(xiàn)并快速升高,1 h 即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),而吸光度值OD600在2 h 才發(fā)生明顯升高,其變化晚于C?D ratio變化曲線至少1 h?;谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果可見,拉曼圖譜技術(shù)用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)真菌代謝活性的影響時(shí),敏感性更高且省時(shí)。

    2.2 CHX對(duì)白色念珠菌的MIC測(cè)定結(jié)果

    不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC 測(cè)定結(jié)果見表1,ΔOD600≤0.05 對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度,即CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC??瞻讓?duì)照組在培養(yǎng)0 h 與24 h 的吸光度差值(ΔOD600)未發(fā)生明顯變化,可以排除培養(yǎng)基污染的可能。陰性對(duì)照組OD600的變化明顯,表明實(shí)驗(yàn)菌株活力良好。CHX質(zhì)量濃度分別為1、2μg·mL?1時(shí),ΔOD600>0.05;而當(dāng)CHX 質(zhì)量濃度為4、8、16、32μg·mL?1時(shí),ΔOD600≤0.05。由此可見,CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC為4 μg·mL?1。

    圖3 穩(wěn)定期白色念珠菌CICC32380 單細(xì)胞拉曼圖譜中C?D ratio與重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間呈線性關(guān)系Fig 3 There was a linear relationship between the C?D ratio of Candida albicans CICC32380 at stable stage and D2O concentra?tion followed by single cell Raman spectrum measurement

    圖4 30%重水環(huán)境下白色念珠菌CICC32380 隨時(shí)間變化的單細(xì)胞拉曼圖譜Fig 4 Temporal change of single cell Raman spectrum for Candida albicans CICC32380 under 30%D2O

    2.3 CHX對(duì)白色念珠菌MIC?MA的測(cè)定

    CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC?MA 測(cè)定結(jié)果見表2 和圖6。與陰性對(duì)照組相比,CHX 在0.5×MIC(2 μg·mL?1)及MIC(4 μg·mL?1)時(shí),ΔC?D?ratio>0且未見明顯降低(P>0.05);在2×MIC 及3×MIC(8 μg·mL?1及12 μg·mL?1)時(shí),ΔC?D?ratio<0 且標(biāo)準(zhǔn)差<0.005,ΔC?D ratio 值明顯降低(P<0.001)。由此可見,CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC?MA 為8 μg·mL?1,即2×MIC。當(dāng)CHX≤4 μg·mL?1,C?D ratio 隨時(shí)間的變化趨勢(shì)與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05),而CHX>4 μg·mL?1,C?D ratio 在8 h 內(nèi)甚至24 h 內(nèi)均維持在基線水平(圖7),說(shuō)明該質(zhì)量濃度下,藥物作用發(fā)揮迅速,實(shí)驗(yàn)菌株的代謝活動(dòng)瞬時(shí)即可受到完全的抑制,并在一定時(shí)間內(nèi)未見恢復(fù)代謝活性。

    圖5 30%重水環(huán)境下白色念珠菌CICC32380 C?D ratio 曲線和生長(zhǎng)曲線隨時(shí)間的變化Fig 5 Temporal change of C?D ratio curve and growth curve of Candida albicans CICC32380 under 30%D2O

    表1 CHX對(duì)白色念珠菌CICC32380的MIC測(cè)定結(jié)果Tab 1 Measurement of MIC for Candida albicans CICC32380 under CHX

    表2 CHX對(duì)白色念珠菌CICC32380的MIC-MA測(cè)定結(jié)果Tab 2 Measurement of MIC-MA for Candida albicans CICC32380 under CHX

    圖6 CHX對(duì)白色念珠菌CICC32380的MIC?MA測(cè)量Fig 6 Measurement of MIC?MA under CHX for Candida albicans CICC32380

    圖7 C?D ratio在不同質(zhì)量濃度CHX作用下的時(shí)間曲線Fig 7 Temporal dynamics of the C?D ratio under various quality score CHX

    3 討論

    本研究確定了CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC 及MIC?MA,通過(guò)探討CHX 對(duì)微生物生長(zhǎng)及代謝的影響,系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了CHX 對(duì)白色念珠菌的抑菌效能;同時(shí),本研究建立了藥物對(duì)真菌代謝活性的作用模型,為后期評(píng)價(jià)口腔常見藥物對(duì)微生物抑菌效能研究提供了參考依據(jù)。

    CHX 對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的抑制效果已有諸多報(bào)道[12?13]。Ferguson等[12]報(bào)道,CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC<0.63 μg·mL?1;Estrela等[13]則 發(fā) 現(xiàn)MIC 為0.2 μg·mL?1。本實(shí)驗(yàn)探索的MIC 與以往報(bào)道有所差別,分析原因可能是在實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的亞種、培養(yǎng)基組成、儀器設(shè)備及實(shí)驗(yàn)者操作等多種差異造成的。

    在以往的研究中,評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物的抑菌效能均是基于肉湯稀釋法,參考MIC 指標(biāo)僅考慮其對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制效能,耗時(shí)且不能評(píng)價(jià)不生長(zhǎng)但有代謝活性(nongrowing but metabolically active,NGMA)細(xì)胞[14]的抑菌效能。本實(shí)驗(yàn)顯示,菌株在MIC 下生長(zhǎng)受到抑制,但仍具有很高的代謝活性,與前期相關(guān)研究[8]中CHX 對(duì)變異鏈球菌、血鏈球菌、發(fā)酵乳桿菌等細(xì)菌代謝活性影響的研究結(jié)果相似。在基于重水拉曼技術(shù)的MIC?MA 下,白色念珠菌的生長(zhǎng)不僅受到完全抑制,代謝活性也瞬時(shí)受到完全抑制,并且在一定時(shí)間內(nèi),未見代謝活性的恢復(fù)。本研究通過(guò)重水拉曼技術(shù)發(fā)現(xiàn)了真菌的NGMA 細(xì)胞,此種細(xì)胞可能是疾病反復(fù)感染甚至治療失敗的重要原因[15]。

    以往多采用二甲氧唑磺比色法檢測(cè)細(xì)胞代謝活性,然而該方法存在溶液的不穩(wěn)定性、培養(yǎng)體系中過(guò)氧化物及某些代謝產(chǎn)物影響結(jié)果準(zhǔn)確性等因素,從而限制了該方法的應(yīng)用[16]。重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼顯微光譜技術(shù),能夠在不改變細(xì)胞組分、不依賴細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,減少對(duì)細(xì)胞的損傷及人為干擾因素,達(dá)到在單細(xì)胞的水平快速、定量、無(wú)損地評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物實(shí)時(shí)代謝活性的影響[7?8,17]。同時(shí),通過(guò)該技術(shù)測(cè)得的拉曼圖譜包含的信息相當(dāng)豐富,可以反映出物質(zhì)的生化及結(jié)構(gòu)特性,理論上能夠覆蓋細(xì)胞內(nèi)所有物質(zhì)的圖譜,特別是600~1 800 cm?1范圍的“指紋區(qū)”[18],可以區(qū)分細(xì)胞類型、探討微生物應(yīng)激機(jī)制等,具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景及重要的指導(dǎo)意義。

    CHX 是一種帶正電荷的親水親脂分子,可與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁之間的靜電相結(jié)合,導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白的沉淀和凝固,同時(shí)也可導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性發(fā)生改變,使低相對(duì)分子質(zhì)量的胞內(nèi)成分發(fā)生滲漏,影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)。CHX 作為口腔常用藥物,具有低細(xì)胞毒性的特點(diǎn);但CHX 在使用過(guò)程中仍可能導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng),舌、義齒、牙齒著色以及味覺(jué)改變等不良反應(yīng),其發(fā)生概率隨質(zhì)量濃度的增高而增大[19]。本研究發(fā)現(xiàn),CHX 對(duì)白色念珠菌的MIC 和MIC?MA,遠(yuǎn)低于臨床常用濃度(0.12%~2%,即1.2~20 g·L?1)。該結(jié)果提示,盡管在臨床使用過(guò)程中,CHX 可能被稀釋,但對(duì)白色念珠菌的生長(zhǎng)及代謝仍具有很好的抑制作用,甚至稀釋近千倍仍然具有良好的效果。

    本研究采用重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼顯微光譜技術(shù)探討真菌藥敏性和CHX 對(duì)白色念珠菌代謝的影響,技術(shù)手段先進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)建立了藥物對(duì)真菌代謝活性影響的模型,為后期評(píng)價(jià)口腔常見藥物對(duì)微生物抑菌效能的研究提供了參考,可以指導(dǎo)臨床快速篩選藥物,達(dá)到盡快篩選出高效低毒、安全有效且不易產(chǎn)生耐藥菌的目的。

    利益沖突聲明:作者聲明本文無(wú)利益沖突。

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