野豬非洲豬瘟監(jiān)測的規(guī)范化采樣管理初探

張 麗，朱向博，晁青鮮，李金邦

（太原動物園，太原030009）

據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的信息統(tǒng)計，2018年8月3日至2020年11月8日，全國共發(fā)生非洲豬瘟疫情181起。因非洲豬瘟疫情影響，大量生豬被無害化處理，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在181起疫情中野豬疫情6起，約占國內(nèi)總疫情數(shù)的3.3%，疫情分別發(fā)生于吉林白山市、黑龍江農(nóng)墾總局、陜西佛坪縣、湖北神農(nóng)架林區(qū)等6地，加上野豬活動區(qū)域大（8～12 km2），且游走性強(qiáng)，染疫野豬容易散播疫病，僅有的6起疫情大大增加了非洲豬瘟防控的不確定性，增加了生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的風(fēng)險。在有效疫苗成功研制及臨床應(yīng)用之前，野豬非洲豬瘟疫情監(jiān)測工作勢必常態(tài)化。

科學(xué)采樣、規(guī)范送檢是實驗室非洲豬瘟檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的必要保證。關(guān)于動物疫病監(jiān)測（或檢測）的采樣，有國家推薦標(biāo)準(zhǔn)或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[1-5]，以及省（市）的地方標(biāo)準(zhǔn)，但每種疫病的流行病學(xué)、病理學(xué)特征及防控要點不盡相同。這些標(biāo)準(zhǔn)缺乏某種疫病樣品采集的具體操作細(xì)則，參考性相對較低。

2019年至今，太原動物園野生動物疫源疫病監(jiān)測站受山西省自然保護(hù)區(qū)管理站疫源疫病監(jiān)測主管部門的委托，特委派專業(yè)的獸醫(yī)人員進(jìn)行野豬非洲豬瘟樣品的采集及送檢。為了確保所采集樣品的科學(xué)性，保證后期非洲豬瘟實驗室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)合采樣實踐工作，擬定以下采樣細(xì)則及管理規(guī)范，以供同業(yè)參考。

1 采樣前準(zhǔn)備

1.1 采樣物資準(zhǔn)備

防護(hù)用品：生物防護(hù)服、外科醫(yī)用口罩或N95口罩、護(hù)目鏡、乳膠手套和膠靴等。

解剖器械：解剖刀、磨刀棒和手術(shù)刀等。

采樣用品：鑷子、止血鉗、手術(shù)剪、生理鹽水或pH 7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS）、10 mL注射器、0.1 mol·L-1EDTA抗凝劑、EDTA真空采血管、2 mL離心管、采樣袋、酒精棉、酒精燈、油性記號筆、無菌采樣袋和鋁盒等。

消毒用品：75%乙醇溶液、84消毒液和生石灰等。

臨時存儲運(yùn)輸用品：生物冰袋、生物安全運(yùn)輸箱或者泡沫箱及車載冷凍冰箱等。

1.2 工作準(zhǔn)備

科學(xué)采集是有效送檢的前提，科學(xué)采集的重點是要控制采集的時效性。樣品采集原則上要盡可能早，死亡野豬內(nèi)臟樣品不應(yīng)遲于死后6 h[2]。因此應(yīng)提前準(zhǔn)備好采樣的物資，接報有野豬樣品需要采集時，應(yīng)立即攜帶采樣物資前去。

由于林區(qū)或者野外野豬非洲豬瘟樣品采集和送檢的特殊性，24 h內(nèi)往往完成不了，因此在采樣出發(fā)前，需提前預(yù)訂送檢用的干冰和專用泡沫包裝箱（一般需提前24 h預(yù)定干冰），或者提前聯(lián)系專業(yè)冷鏈送檢公司下樣品送檢訂單。

1.3 傳染病防控知識準(zhǔn)備

采樣的對象是被獵殺或感染未知病原死亡的野豬，是常見的野生動物源人獸共患傳染病疫源。采樣人員有感染豬布魯氏桿菌病、豬鏈球菌病、炭疽、豬流感、森林腦炎等人獸共患傳染病的風(fēng)險，如果采樣過程中缺乏防范此類傳染病的防控知識，會嚴(yán)重威脅相關(guān)操作人員的生命安全及環(huán)境安全。所以，采樣前相關(guān)操作人員一定要了解與野豬相關(guān)的重大疫病防感染的防護(hù)知識和防止疫病散播的防控知識。

首先，參與采樣的人員，手或體表其他外露部位有外傷的不得參與解剖、采樣、處理尸體或清掃消毒；其次，采樣人員一定要穿防護(hù)服、膠靴，佩戴護(hù)目鏡、乳膠手套、外科醫(yī)用口罩或N95口罩，做好個人防護(hù)，免受傳染病侵害；最后，解剖采樣結(jié)束后要做好場地的消毒、解剖耗材及尸體的無害化處理，嚴(yán)防采樣過程中把病原散播到環(huán)境中，以免造成潛在疫病的散播、流行。

2 采樣過程

整個采樣過程主要包括采樣前對采樣對象的初判、解剖取樣、采樣后的信息記錄及無害化處理等工作。

2.1 采樣前初判

不論是被獵殺而死的野豬，還是在環(huán)境中正常或非正常死亡的野豬，解剖前均要觀察野豬的整體外觀情況。眼觀野豬尸體的眼睛、鼻腔、口腔、肛門等天然孔是否有出血，如有出血，血的顏色是否為醬油色，是否有血凝不良的現(xiàn)象等，對初判疑似炭疽（天然孔出血，醬油色血，血凝不良）的野豬，嚴(yán)禁解剖。并用無菌注射器采集疑似野豬的血液，送當(dāng)?shù)孬F醫(yī)實驗室涂片鏡檢。鏡檢炭疽陽性的應(yīng)就近進(jìn)行填埋或者焚燒等無害化處理；為炭疽陰性的方可進(jìn)行解剖采樣。

2.2 解剖取樣

2.2.1 場地處理

剖檢采樣要選擇平坦的地方進(jìn)行，且鋪上厚塑料布，防止解剖過程中可能攜帶病原的血液、胸腹水等污染物污染解剖場地，防止疾病散播。

2.2.2 蜱蟲采集

野豬非洲豬瘟本底調(diào)查需采集野豬窩或者野豬身上的蜱蟲（主要為鈍緣軟蜱），故在剖檢前要用細(xì)篩子將豬窩周邊的土層過篩采集泥土中的蜱蟲，或者在野豬的耳后、腋下和腹股溝等軟組織區(qū)域?qū)ふ因缦x。蜱蟲在非洲豬瘟的傳播中充當(dāng)著重要的傳播媒介，檢測蜱蟲的帶毒情況，是野豬非洲豬瘟監(jiān)測的重要一環(huán)。一般情況下，盡可能多地采集蜱蟲，放至2 mL離心管中。

2.2.3 剖檢體位準(zhǔn)備

首先將野豬尸體呈仰臥位放置，然后分別從野豬兩側(cè)腋下處縱切至肩關(guān)節(jié)處下壓，使兩前肢向外平伸，沿腹股溝縱切至髖關(guān)節(jié)處下壓，使兩后肢向外平伸，以便于解剖采樣。

2.2.4 血液采集

如果是活捉的野豬仔豬，可以頸靜脈采血或者心臟采血。如果是被獵槍擊斃的野豬，心臟可能沒有未凝固的血液，在縱切前后肢過程中流出血液時，應(yīng)及時使用提前用EDTA標(biāo)準(zhǔn)液濕潤過的一次性無菌注射器采集血液，每份血液1～3 mL，輕搖混勻后輕輕打入EDTA真空采血管中。

2.2.5淋巴結(jié)采集

非洲豬瘟檢測一般采集頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)或腸系膜淋巴結(jié)，其中腹股溝淋巴結(jié)最不易受到解剖污血、污物的污染，所以一般采集腹股溝淋巴結(jié)。腹股溝淋巴結(jié)在腹股溝皮下，常有脂肪層包裹，腹股溝左右各一個，采集時需觀察淋巴結(jié)是否有水腫或者切面有無炎性癥狀，是否有出血等。淋巴結(jié)作為機(jī)體免疫器官，如為感染性疾病造成野豬死亡的，淋巴結(jié)或多或少會有腫大及出血的情況。

2.2.6 扁桃體采集

仔豬扁桃體可以直接用刀沿口裂切開，上下頜分開在舌根及會厭部，用滅菌的手術(shù)剪和鑷子（或止血鉗）采集扁桃體。亞成體及成年的野豬，采集扁桃體時，需用解剖刀先去除下巴至頸部的皮，再沿下巴下頜骨內(nèi)沿切開頜下肌肉至頸部，切口呈V字形，在下巴處向外拉下巴肌肉，暴露出舌頭，再把舌頭拉向頸部，切開豬舌兩側(cè)的肌肉，直至暴露扁桃體。被血液或者野豬口腔中的污物所污染的扁桃體，采集后需要用生理鹽水或者0.01 mol·L-1、pH 7.4的PBS液沖洗，然后放入病料袋中。

2.2.7 開腹采樣

野豬扒皮后，先用手術(shù)刀切開腹部肌肉層，再用手或者鈍性器械（如鑷子的鈍端）打開腹膜層，打開腹膜禁用尖銳器械，尖銳器械容易刺破腸道，造成腸內(nèi)容物涌出污染腹腔臟器。開腹后首先采集肝臟，如果肝臟眼觀有病變，則采集病變區(qū)的樣品；其次采集脾臟；最后采集腎臟。非洲豬瘟陽性的豬，脾臟一般會腫大到原來的2～3倍，而陽性野豬的脾臟情況暫時未見報道。但是作為免疫器官，如果感染非洲豬瘟，野豬脾臟異常腫大的可能性非常大。

2.2.8 開胸采樣

用解剖刀沿胸骨與肋骨的軟骨結(jié)合處將兩者分離，然后切開橫膈膜即可暴露胸腔。首先觀察胸腔內(nèi)是否有積液或出血，其次觀察心包的情況，然后再觀察肺臟的外觀及按壓情況。最后無菌采集肺臟，并觀察肺臟的切面是否有炎性滲出物及瘀血等。

注意事項：樣品采集前后及過程中均需拍照記錄組織臟器的解剖特征，每采集一種組織臟器，需更換手術(shù)剪、鑷子等采樣器械或者用乙醇擦拭灼燒，以確保各組織臟器樣品不交叉污染。實質(zhì)性組織器官的采樣大小一般1～2 cm2（或10～15 g組織樣）即可。采集胸腹腔內(nèi)的臟器時，臟器有時可能被腸內(nèi)容物、胸腹水、血液等污染，采集的樣品應(yīng)大一些，需2～3 cm2（或者20～30 g組織樣），有污物的組織樣需用生理鹽水或者PBS液稍作沖洗后再放進(jìn)采樣袋中。

2.3 采樣后處理

采樣完成后，首先要及時填寫詳細(xì)的送樣信息表。信息表要如實填寫，跟樣品一起送檢。野豬送樣信息表內(nèi)容應(yīng)包括：采樣負(fù)責(zé)人及聯(lián)系方式、采樣日期及時間、采樣地點、野豬死亡時間、野豬性別、野豬估重、野豬大概年齡、所采樣品類型（肝臟、脾臟、肺臟、蜱蟲等）、每種樣品數(shù)量等。另外應(yīng)簡單備注上野豬的病理解剖描述，如脾臟有無腫大和異常，肺臟表面出血及剖面瘀血情況，腸系膜及腸道表面有無出血等。

其次，將野豬尸體及采樣相關(guān)的廢棄物無害化處理。野豬可以深坑填埋，填埋坑要求遠(yuǎn)離居民區(qū)、養(yǎng)殖區(qū)和水源，坑深要求放進(jìn)野豬尸體后距離地面至少1 m深（保證尸體不被其他動物刨出來），填埋坑底層撒上2～5 cm厚的生石灰，放進(jìn)野豬尸體后，身體上撒上2～5 cm厚的生石灰，再將尸體坑填土夯實，最后在夯實的坑表面撒上約1 cm厚的生石灰。也可連帶解剖用的塑料墊布、防護(hù)服、乳膠手套等可燃廢棄物一起焚燒處理。如有血液、腹水等污染物從塑料墊布浸透到地面的，用1 000 mg·L-1有效氯的84消毒液或2%～5%的火堿溶液對污染場地潑灑浸泡至少60 min，對野豬運(yùn)輸工具進(jìn)行2～3遍的噴灑消毒。采樣工具用酒精棉擦拭并用醫(yī)用乙醇浸泡消毒至少10 min。

3 樣品送檢

從樣品采集到送至檢測機(jī)構(gòu)，24 h內(nèi)能完成的，全程可用添加5～6個500 mL的冷凍冰袋或冰磚的儲存容量為5～10 L的生物安全運(yùn)輸箱或密封泡沫箱4℃冷藏送檢；超過24 h的，樣品需-20℃以下低溫暫時凍存并運(yùn)輸至實驗室-60℃超低溫冷凍保存。送檢運(yùn)輸途中需全程冷鏈凍存運(yùn)輸，一般采用“生物安全運(yùn)輸箱+干冰或者泡沫箱+干冰”包裝運(yùn)輸。干冰的用量需根據(jù)運(yùn)輸時間和干冰的消耗量來計算，常規(guī)狀態(tài)下，條塊狀干冰在4 cm厚的密封泡沫箱內(nèi)或生物安全箱內(nèi)每天損耗2～2.5 kg。樣品應(yīng)交由專業(yè)的冷鏈公司送貨，或由專業(yè)的獸醫(yī)人員送檢，嚴(yán)防在送貨途中將可能存在的病原（如非洲豬瘟病毒、豬流感病毒、豬布魯氏桿菌等）散播到環(huán)境中。

4 小 結(jié)

在野豬非洲豬瘟本底調(diào)查采樣中，采集對象可能是被獵殺的健康狀況未知的野豬，或者是病死的野豬（如陜西佛坪、湖北神農(nóng)架）?？紤]采樣過程中操作人員有感染人獸共患病的風(fēng)險，要求參與采樣操作的人員必須嚴(yán)格做好防護(hù)，從頭到腳，穿戴護(hù)目鏡、口罩、防護(hù)服、乳膠手套和膠靴。且采樣耗材及尸體的無害化處理過程必須由獸醫(yī)人員監(jiān)督執(zhí)行，嚴(yán)防操作不當(dāng)造成人員感染和病原外泄散播。

每頭野豬的每種樣品必須至少采集3份：一份送至國家林草局野生動物疫病研究中心，一份送至省級動物疫病預(yù)防控制中心，一份留作復(fù)檢備檢樣品（-60℃以下超低溫凍存）。每個樣品袋上必須標(biāo)記清楚野豬的性別、大概年齡、組織臟器名稱、采樣時間地點及樣品編號等，并詳細(xì)填寫加蓋有采樣單位公章的采樣送檢單。若剖檢時發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官異常的，送檢時最好附上圖文并茂的解剖描述說明。