貓科動(dòng)物冠狀病毒感染情況調(diào)查及其基因的進(jìn)化分析

楊德全 鞠厚斌 朱九超 葛菲菲楊顯超 李 鑫 沈海瀟 趙洪進(jìn) 王 建

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海，201103)

冠狀病毒(Coronavirus)屬于巢狀病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)，為一種正義單鏈RNA病毒，根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析，可分為α、β、γ和δ 4個(gè)屬。α和β屬冠狀病毒可感染哺乳動(dòng)物，而γ和δ屬冠狀病毒主要感染鳥類，少數(shù)也可感染哺乳動(dòng)物[1]。冠狀病毒有十分廣泛的宿主種類，人(Homosapiens)、豬(Sus)、馬(Equuscaballus)、牛(Bos)、鼠(Rattus)、犬(Canis)、貓科(Felidae)動(dòng)物等，可通過不同機(jī)制進(jìn)行跨種傳播[2]。新型冠狀病毒性肺炎(coronavirus disease 19，COVID-19)疫情發(fā)生以來，人與動(dòng)物的安全已成為當(dāng)今社會(huì)的公共衛(wèi)生大事之一?，F(xiàn)有研究表明，新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)來源于某種或某幾種野生動(dòng)物[3-4]。為了及時(shí)了解貓科動(dòng)物感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)和貓冠狀病毒(Feline coronavirus，F(xiàn)CoV)的情況，本研究采集上海某動(dòng)物園的貓科動(dòng)物樣品進(jìn)行冠狀病毒檢測，不僅可以了解冠狀病毒在貓科動(dòng)物的感染情況，而且對(duì)公共衛(wèi)生及野生動(dòng)物保護(hù)具有重要意義。

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)屬于冠狀病毒亞科β屬 B 亞群，其基因組具有典型的冠狀病毒結(jié)構(gòu)，基因組序列與蝙蝠源的冠狀病毒同源性高達(dá)96%[5]。貓冠狀病毒(FCoV)屬于冠狀病毒亞科α屬，其基因組由1條長約29 000核苷酸的正鏈RNA組成。編碼11個(gè)開放閱讀框(ORFs)：2個(gè)復(fù)制酶蛋白基因(pp1a和pp1ab)、4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因(S、E、M和N)和5個(gè)附屬蛋白基因(ORF3a-c和ORF7a，b)[6]。FCoV 可分為type I 和type Ⅱ兩種血清型；貓腸道冠狀病毒(feline enteric coronavirus，F(xiàn)ECV)和貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV)兩種生物型，兩種血清型在兩種生物型中普遍存在[6]。FECV致病性低，引起輕度腸炎或無明顯感染；FIPV毒力強(qiáng)，致死性強(qiáng)。本研究對(duì)檢測到的3個(gè)陽性肛拭子樣品進(jìn)行FCoVORF3、ORF7和S基因檢測和遺傳進(jìn)化性分析，旨在從分子水平揭示其是否具有致病性，并為貓科動(dòng)物的保護(hù)提供科學(xué)建議。

1 材料與方法

1.1 樣品

2019年12月至2020年1月，收集來自上海某動(dòng)物園的貓科動(dòng)物樣品144份，包括捕捉的野貓(Felissilvestris)、華南虎(Pantheratigrisamoyensis)、美洲獅(Pumaconcolor)、豹(Pantherapardus)、豹貓(Prionailurusbengalensis)、獰貓(Caracalcaracal)、藪貓(Leptailurusserval)、猞猁(Lynxlynx)等動(dòng)物的鼻拭子、肛拭子、糞便樣品(表1)。將樣品-80℃冰箱中保存，備用。

表1 冠狀病毒熒光RT-PCR檢測結(jié)果Tab.1 Results of detection of coronavirus by real-time PCR

1.2 主要試劑

病毒RNA 提取試劑盒購自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)、DNA 純化回收試劑盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、DL-2 000 Marker和EscherichiacoliDH5α Competent Cells，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)購自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3 RNA 的提取

用PBS將糞便以1∶5比例稀釋，混勻后反復(fù)凍融3次，8 000 r/min 離心10 min。參照病毒RNA 提取試劑盒說明書，提取樣品中病毒RNA。

1.4 冠狀病毒熒光RT-PCR檢測

SARS-CoV-2 按照新型冠狀病毒熒光RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行檢測；FCoV 按照本實(shí)驗(yàn)室建立的熒光RT-PCR 方法進(jìn)行檢測。

1.5 ORF3、ORF7和 S2基因序列的擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[7]合成FCoVORF3、ORF7和S2基因的PCR 引物，以1.3 獲得RNA 為模板分別利用一步法試劑PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物電泳切膠后，按照DNA 純化回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收純化，將回收純化產(chǎn)物與pGM-T 載體連接，陽性質(zhì)粒送上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.6 ORF3、ORF7 和S2基因序列的分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

應(yīng)用DNAStar 7.0 軟件的MegAlign 程序?qū)y序獲得的序列進(jìn)行同源性比對(duì)。應(yīng)用NCBI 檢索同源序列，使用MEGA 5.05 軟件中鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，并用Bootstrap 方法重復(fù)1 000 次進(jìn)行檢驗(yàn)，其他參數(shù)使用默認(rèn)值。

2 結(jié)果

2.1 冠狀病毒檢測情況

從2019年12月到2020年1月，共檢測貓科動(dòng)物樣品144份，結(jié)果詳見表1。SARS-CoV-2熒光RT-PCR 檢測全部為陰性；FCoV 熒光RT-PCR 檢測陽性3份，其中野貓肛拭子1份，命名為SH1951；豹貓糞便陽性2份，分別命名為SH2003和SH2004。

2.2 FCoV 部分基因的測序結(jié)果

利用PCR 對(duì)SH1951、SH2003和SH2004 3個(gè)陽性樣品進(jìn)行FCoVORF3、ORF7和S2基因進(jìn)行擴(kuò)增，將所擴(kuò)增出的特異性目的片段進(jìn)行克隆和測序，將所測序列遞交至GenBank，獲得的序列登錄號(hào)：MT112938—MT112946。

2.3 ORF3 的序列分析

SH1951、SH2003和SH2004 3個(gè)樣品擴(kuò)增得到的FCoV 的ORF3a基因的總長度為213 nt，均編碼70 aa，與血清Ⅰ型毒株編碼的氨基酸長度一致。它們之間核苷酸同源性為96.2%—100.0%，氨基酸同源性為93.0%—100.0%，其中SH2003與SH2004核苷酸和氨基酸同源性均為100%。SH1951、SH2003和SH2004均與國內(nèi)毒株HLJ/DQ/2016/01同源性最高，分別為94.4%、95.3%和95.3%；它們分別與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性為93.0%、93.9%和93.9%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性均為70.4%。

SH1951、SH2003和SH2004 3個(gè)樣品病毒的ORF3b基因的核苷酸存在突變，但不引起編碼氨基酸數(shù)量(73 aa)的改變，均與血清Ⅰ型毒株(除Black和FCoV C1Je外)編碼的氨基酸長度一致。它們之間核苷酸同源性為88.3%—99.1%，氨基酸同源性為90.5%—100.0%。SH1951、SH2003和SH2004分別與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性為92.8%、89.6%和88.7%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性為68.5%、67.1%和67.1%。SH1951、SH2003和SH2004與Black和FCoV C1Je之間核苷酸同源性為78.8%—89.2%，氨基酸同源性為52.1%—88.7%。

SH2003和SH2004的ORF3c基因與大多數(shù)血清Ⅰ型非截短ORF3c基因一樣，由714 nt組成，編碼237 aa，而SH1951存在著連續(xù)6個(gè)堿基的插入，編碼239 aa。它們之間核苷酸同源性為95.5%—99.0%，氨基酸同源性為93.7%—98.7%。SH1951、SH2003和SH2004分別與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性為95.4%、95.2%和95.4%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性為86.2%、87.4%和87.5%。

根據(jù)獲得的3c基因序列和GenBank 中FCoV3c基因的參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，其中SH1951、SH2003和SH2004處于同一遺傳進(jìn)化分支，并與血清Ⅰ型國內(nèi)外毒株均處于同一大的遺傳進(jìn)化分支。與血清Ⅱ型FIPV 79-1146、DF-2和DF-2 R3i處于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 ORF7的序列分析

SH1951、SH2003和SH2004 3個(gè)樣品擴(kuò)增得到的FCoV 的ORF7a基因的總長度為306 nt，均編碼101 aa，與血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株編碼的氨基酸長度一致。它們之間核苷酸同源性為94.4%—100%，氨基酸同源性為98.0%—100.0%。SH1951、SH2003和SH2004分別與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性為92.5%、95.8%和95.8%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性為93.8%、94.8%和94.8%。SH1951、SH2003和SH2004的ORF7a的第9、12位和47位分別為苯丙氨酸(F)、纈氨酸(V)和絲氨酸(S)，見圖2。

SH1951、SH2003和SH2004 3個(gè)樣品擴(kuò)增得到的FCoV 的ORF7b基因編碼一個(gè)由206 aa組成的蛋白質(zhì)，與血清Ⅰ型(Black除外)和Ⅱ型毒株編碼的氨基酸長度一致。與參考序列相比，它們有多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生氨基酸的變化，但它們?cè)诘?70位的氨基酸均為H。它們之間核苷酸同源性為89.7%—98.9%，氨基酸同源性為86.0%—96.6%。SH1951、SH2003和SH2004分別與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性為91.5%、91.6%和91.1%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性為89.2%、90.3%和89.9%。

根據(jù)獲得的7b基因序列和GenBank 中FCoV7b基因的參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，其中SH1951與UG-FH8親緣關(guān)系最近，與大部分血清Ⅰ型毒株和血清Ⅱ型FIPV 79-1146、DF-2和DF-2 R3i毒株均處于同一大的遺傳進(jìn)化分支。而SH2003和SH2004處于另一大的遺傳進(jìn)化分支，并與HLJ/HRB/2016/1的親緣關(guān)系最近。

2.5 S2的序列分析

本實(shí)驗(yàn)所得SH1951、SH2003和SH2004 3個(gè)樣品擴(kuò)增得到的S2基因的序列之間核苷酸同源性為90.1%—99.5%，氨基酸同源性為94.2%—99.3%。它們與參考株的相應(yīng)核苷酸相似性為65.1%—90.9%，氨基酸相似性為61.5%—96.2%。SH1951、SH2003和SH2004 的S1/S2裂解位點(diǎn)處有連續(xù)的R-R-S/A-R-R-S序列模體(圖4A)，符合FECV裂解位點(diǎn)的氨基酸序列特征[8]。與國外UU-FH8等毒株和國內(nèi)黑龍江的4個(gè)毒株相比，在第1 045位(M)、1 047位(S)和1 108位(D)均沒有發(fā)生氨基酸的完全替換(圖4B)。

根據(jù)獲得的S2基因序列和GenBank 中FCoVS基因的參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，其中SH1951、SH2003和SH2004處于同一遺傳進(jìn)化分支，并與HLJ/DQ/2016/01和UG-FH8親緣關(guān)系最近，與其他血清Ⅰ型毒株均處于同一大的遺傳進(jìn)化分支。與血清Ⅱ型FIPV 79-1146、DF-2和DF-2 R3i處于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

本研究對(duì)動(dòng)物園中的貓科野生動(dòng)物及野貓進(jìn)行了冠狀病毒的熒光RT-PCR 檢測，結(jié)果顯示SARS-CoV-2 全為陰性，表明貓科野生動(dòng)物自身未攜帶或未感染SARS-CoV-2。據(jù)最新報(bào)道，香港一患者家中的寵物犬感染新型冠狀病毒[9]，這提示我們應(yīng)做好野生動(dòng)物的保護(hù)工作，警惕人或其他動(dòng)物(流浪犬、野貓等)傳染給動(dòng)物園中的野生動(dòng)物。

研究結(jié)果顯示檢測到3份FCoV，其中2份來自于豹貓，1份來自于動(dòng)物園中捕獲的野貓，這些動(dòng)物均為健康動(dòng)物，無腹水等FIPV的特征癥狀，據(jù)此推測檢測到的FCoV可能為生物型FECV。研究表明，所有FECV中的ORF3c基因均是完整的，完整的ORF3c基因被認(rèn)為是FECV 在腸道中有效復(fù)制所必需的，但對(duì)FIPV 的復(fù)制則是非必需的[10]。本研究中的SH1951樣品為野貓的肛拭子，雖然ORF3c基因存在著連續(xù)6個(gè)堿基的插入，但不存在截短突變，從基因上推測SH1951可能為FECV生物型。而SH2003和SH2004 均為豹貓的糞便樣品，且2個(gè)病毒的ORF3c基因均為完整的3c基因，從基因上推測SH2003和SH2004為FECV生物型。據(jù)報(bào)道，在118個(gè)I 型FIPV中，95.8%的FIPV顯示S基因中有M1058L或S1060A[以C1Je(DQ848678)為參考毒株]，即M1045L或S1047A[以Black(EU186072)為參考毒株]的突變，而183個(gè)FECV樣本中沒有發(fā)生突變。這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，可用于鑒別診斷FIPV和FECV兩個(gè)生物型[11]。3株病毒在第1 045位、1 047位的氨基酸均沒有替換，這更進(jìn)一步證明這3株病毒均為FECV生物型。

研究認(rèn)為，3c和S基因的突變與FIP的發(fā)生有關(guān)[7]。而本研究中的3株病毒3c和S基因均未發(fā)生突變；且S1/S2位點(diǎn)的模體序列R-R-S/A-R-R-S均符合FECV裂解位點(diǎn)的氨基酸序列特征，比FIPV在該區(qū)域表現(xiàn)出高度的保守，與報(bào)道的一致[8]。表明這3株病毒均為致病性低的FECV。

從基因測序結(jié)果上看，SH2003和SH2004在核苷酸和氨基酸的同源性均非常高，而與SH1951的同源性均較高，表明豹貓攜帶的FECV與野貓攜帶的FECV為不同的流行毒株。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，基于ORF3c和S2基因的進(jìn)化樹可以分成2個(gè)主要分支，即以Black為代表的血清型Ⅰ型毒株進(jìn)化分支和以FIPV 79-1146為代表的血清Ⅱ型毒株進(jìn)化分支。本研究中的3株病毒與血清型Ⅰ型毒株的親緣關(guān)系最近。而基于ORF7b基因的進(jìn)化樹也分成2個(gè)主要分支，SH1951與SH2003和SH2004處于不同的遺傳進(jìn)化分支，表明它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由于豹貓為半封閉式圈養(yǎng)，易和野貓接觸，加上野貓生活環(huán)境復(fù)雜，自身攜帶的病毒種類較多，提醒我們需要加強(qiáng)對(duì)野貓的管理與監(jiān)測，防止野貓攜帶的FECV或其他病毒傳染給豹貓，這對(duì)保護(hù)野生動(dòng)物具有重要意義。