多發(fā)性骨髓瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療:耐藥機(jī)制與相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物的探索

胡 柯 陶 怡 施菊妹

腫瘤異質(zhì)性是指惡性腫瘤及其細(xì)胞因個體差異或在個體分布部位的不同，致使其表達(dá)的基因型或生物表型存在差異，導(dǎo)致其對不同化學(xué)治療(簡稱化療)藥物的敏感性出現(xiàn)差異。近年來，學(xué)者逐漸意識到腫瘤異質(zhì)性對多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)疾病進(jìn)展和耐藥具有影響；特別是細(xì)胞遺傳學(xué)定義的高風(fēng)險患者，其基因組異質(zhì)性可存在明顯的動態(tài)變化。這些動態(tài)變化表現(xiàn)為在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中和不同治療選擇的作用下，不同亞克隆來源的腫瘤細(xì)胞的生長優(yōu)勢發(fā)生改變，即所謂動態(tài)異質(zhì)性。具有新生長優(yōu)勢的腫瘤細(xì)胞克隆亞群極有可能對原有治療方案產(chǎn)生耐藥，而動態(tài)異質(zhì)性與治療方案、治療時間、個體高危因素均相關(guān)，但其相關(guān)程度和形成機(jī)制，仍需更大規(guī)模的隨機(jī)對照研究以進(jìn)一步探索、明確。如果說動態(tài)異質(zhì)性是治愈復(fù)發(fā)或難治多發(fā)性骨髓瘤(relapsed/refractory multiple myeloma, RRMM)的難點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)，那么尋找可靠的耐藥相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物，開發(fā)對應(yīng)的識別分析技術(shù)，則成為未來攻克RRMM的重點(diǎn)。以此為基礎(chǔ)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)可以足夠靈活的模式，應(yīng)對復(fù)雜多變的MM動態(tài)異質(zhì)性，在整個疾病過程中及時調(diào)整治療方案，延長患者生存時間。

1 普遍耐藥機(jī)制與相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物

1.1 骨髓微環(huán)境 骨髓微環(huán)境包含細(xì)胞成分、細(xì)胞外基質(zhì)，以及可溶性成分，這些成分形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在MM的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。微環(huán)境介導(dǎo)的耐藥性(environment mediated-drug resistance, EM-DR)是MM細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)與微環(huán)境相互作用的結(jié)果。MM細(xì)胞促進(jìn)可溶性因子(如IL-6)的分泌和攝取。IL-6可通過直接激活Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)等級聯(lián)信號通路，或由血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)間接促進(jìn)血管生成，影響MM細(xì)胞的存活，并介導(dǎo)MM的耐藥[1]。這些促進(jìn)旁分泌信號異常轉(zhuǎn)導(dǎo)的可溶性因子存在不同的表達(dá)模式，而其下游分子或可成為EM-DR相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。例如，可通過靶向胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor-1 receptor, IGF1R)或阻斷其下游的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase, AKT)信號通路來對抗由胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1 , IGF1)/IGF1R軸上調(diào)介導(dǎo)的MM耐藥。目前，已有AKT抑制劑投入臨床前研究或臨床Ⅰ或Ⅱ期試驗，其安全性和有效性也已得到初步驗證[2-3]。

幾乎所有類型的細(xì)胞都釋放外泌體，其通過轉(zhuǎn)移信使核糖核酸(mRNA)、微核糖核酸(microRNA)和蛋白質(zhì)來介導(dǎo)局部細(xì)胞間的通信。MM細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞間的雙向交流即可通過外泌體進(jìn)行。研究[4]發(fā)現(xiàn)，在硼替佐米、美法侖的作用下，可見細(xì)胞外泌體的分泌顯著增多。同時，由于細(xì)胞外游離microRNA可受到外泌體的保護(hù)，從而具有極高的穩(wěn)定性，且擁有較高的血清豐度，這意味著異常的microRNA表達(dá)譜可為MM分級、預(yù)后及其耐藥分析提供依據(jù)。Jung等[5]對MM患者的循環(huán)microRNA表達(dá)進(jìn)行量化發(fā)現(xiàn)，某些microRNA的表達(dá)水平，尤其是microRNA-29c-3p水平，與來那度胺聯(lián)合低劑量地塞米松治療RRMM的療效呈負(fù)相關(guān)；Manier等[6]則發(fā)現(xiàn)，檢測循環(huán)microRNA let-7b和microRNA-18a的表達(dá)水平對判斷MM預(yù)后具有重要意義。

此外，在藥物作用后，外泌體還會出現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，如其表達(dá)的乙酰肝素酶就有藥物劑量相關(guān)性的上調(diào)。乙酰肝素酶可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。而當(dāng)外泌體暴露于腫瘤細(xì)胞或巨噬細(xì)胞時，可將其自身攜帶的肝素酶轉(zhuǎn)移至這些細(xì)胞，通過激活信號通路 [如細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)、AKT]促進(jìn)耐藥，最終導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。

1.2 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)活性異常 MM的多重耐藥與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)異常表達(dá)亦有關(guān)，其中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)(ATP binding cassette transporter, ABC)超家族的作用受到研究者的重視。其G亞家族成員ABCG2與MM的耐藥相關(guān)；有研究[7]發(fā)現(xiàn)，接受托泊替康治療后復(fù)發(fā)的患者ABCG2 mRNA表達(dá)水平增高，這可能與該基因啟動子的甲基化相關(guān)；而其B亞家族成員ABCB1過度表達(dá)則是MM細(xì)胞對第二代蛋白酶體抑制劑——卡非佐米耐藥的最顯著的特征。此外，目前用于治療MM的許多藥物(如阿霉素、依托泊苷)是已知的C亞家族成員ABCC2底物，ABCC2可將這些藥物排出腫瘤細(xì)胞外，導(dǎo)致耐藥[8]。研究[9]還指出，通過檢測多能性干細(xì)胞染料(如CDy1)的著色強(qiáng)度可測定ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的流出活性，這可能是一種預(yù)測MM患者對卡非佐米反應(yīng)的有效方法。當(dāng)檢出MM患者存在外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的異常，其治療方案則將改為使用外排抑制劑。目前，已有在MM中表現(xiàn)出良好臨床前療效的外排抑制劑，如奈非那韋和洛匹那韋。

1.3 藥物代謝(簡稱藥代)動力學(xué)變異 藥物抵抗往往被認(rèn)為與藥效學(xué)或者靶細(xì)胞有關(guān)，而藥代動力學(xué)異常則是一種未被充分重視的耐藥機(jī)制。眾所周知，藥代和系統(tǒng)清除是有效的系統(tǒng)防御，一旦外源性化合物經(jīng)機(jī)體攝入，與藥物傳感相關(guān)的核受體超家族成員結(jié)合，這些受體就會轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并調(diào)控編碼Ⅰ相和Ⅱ相藥代酶的基因表達(dá)，影響其代謝過程[10]。而藥代動力學(xué)異質(zhì)性可以通過調(diào)節(jié)化療藥物的代謝過程使之無法維持有效濃度，從而影響療效。近期，藥物基因組學(xué)研究取得巨大進(jìn)展，即通過研究基因多態(tài)性對藥代的影響，從而預(yù)測患者對藥物的敏感性和可能發(fā)生的不良反應(yīng)[11-12]。研究也揭示了若干有意義的藥物基因組學(xué)變異：在預(yù)后良好的MM患者細(xì)胞中，編碼外源性化合物受體[維甲酸受體(RXRα)、肝臟X受體(LXR)、組成型雄甾烷受體(CAR)、法尼醇受體(FXR)等]的基因表達(dá)增加，并相應(yīng)地表達(dá)藥代酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，而預(yù)后不良的患者則恰恰相反[11]。由此，靶向上述受體的激動劑或可為逆轉(zhuǎn)MM耐藥開辟新的道路。

2 蛋白酶體抑制劑(PI)的耐藥機(jī)制與相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物

2.1 蛋白酶體β5亞基(PSMB5)基因突變 目前所批準(zhǔn)使用的PI都靶向PSMB5基因[10]。以硼替佐米為例，其可逆性地抑制PSMB5基因的糜蛋白酶樣活性，導(dǎo)致泛素化蛋白無法降解而積聚，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Barrio等[13]首次發(fā)現(xiàn)，相比于初診原發(fā)MM患者，復(fù)發(fā)患者的PSMB5基因突變頻率更高，并且這些突變的PSMB5基因使得硼替佐米耐藥患者對其他PI也表現(xiàn)出交叉耐藥。研究結(jié)果表明，敲除PSMB5基因能提高M(jìn)M耐藥細(xì)胞對硼替佐米的敏感性，而PSMB5基因中G332A、A20T位點(diǎn)突變皆位于藥物結(jié)合域周圍，故影響藥物結(jié)合可能是PSMB5基因突變導(dǎo)致耐藥的根本原因。

2.2 熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)表達(dá)上調(diào) HSP作為負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶，在蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有多個研究發(fā)現(xiàn)，HSP在PI耐藥細(xì)胞中高表達(dá)[包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP 78)[14]、HSP90、HSP27、HSP70[15]]，而探索并開發(fā)HSP抑制劑，以促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡是目前研究的熱點(diǎn)。除了分子伴侶作用，HSP還涉及多條信號通路，包括JAK/STAT與PI3K等，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。由此，HSP可作為重要的治療靶點(diǎn)，HSP抑制劑則成為治療MM的新希望。目前，已有多種HSP90靶向抑制劑進(jìn)入臨床試驗階段，如坦螺旋霉素(tanespimycin)、KW-2478等，他們與硼替佐米的協(xié)同作用令人矚目[16]。

2.3 去分化 在轉(zhuǎn)錄水平，B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化受到階段特異性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄因子X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1, Xbp1)可通過沉默B細(xì)胞的基因來調(diào)控漿細(xì)胞分化，這是激活抗體分泌細(xì)胞的必要步驟。由于MM具有蛋白質(zhì)過載和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平增強(qiáng)的特性，Xbp1常在未經(jīng)處理的MM細(xì)胞中大量表達(dá)，然而在RRMM中表達(dá)較少。研究[17]發(fā)現(xiàn)，敲減Xbp1后，MM細(xì)胞在硼替佐米作用下仍可存活。PI通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力致使細(xì)胞凋亡，而Xbp1的缺失導(dǎo)致漿細(xì)胞成熟障礙，免疫球蛋白分泌不足，減輕了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，從而賦予MM細(xì)胞PI抗性。阻斷Xbp1剪接可增強(qiáng)MM細(xì)胞對于PI和HSP90抑制劑的敏感性。體內(nèi)外研究[18-19]已證實，Xbp1抑制劑具有抗MM作用的臨床應(yīng)用前景。

3 烷化劑的耐藥機(jī)制與相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物

烷化劑是一種周期性非特異性細(xì)胞毒性藥物。目前被批準(zhǔn)用于治療MM的烷化劑包括美法侖和環(huán)磷酰胺，都是DNA鏈間交聯(lián)誘導(dǎo)劑。當(dāng)DNA鏈間發(fā)生錯誤的共價交聯(lián)，DNA復(fù)制會被阻斷，從而達(dá)到殺傷細(xì)胞的效果。在近期研究中，高分辨率質(zhì)譜法被應(yīng)用于準(zhǔn)確評價藥物誘導(dǎo)的鏈間交聯(lián)程度，并且其具有可檢測尿液等無創(chuàng)樣品的優(yōu)勢，被認(rèn)為是未來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中一種強(qiáng)有力的工具[20]。

根據(jù)烷化劑的作用途徑，其在MM中的特異性耐藥機(jī)制主要體現(xiàn)在DNA損傷與修復(fù)通路的調(diào)節(jié)上，包括參與范科尼貧血(Fanconi anemia, FA)的蛋白質(zhì)、核苷酸的切除修復(fù)、錯配修復(fù)、同源重組等[21]。范科尼蛋白質(zhì)與DNA損傷應(yīng)急蛋白質(zhì)[共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張和Rad3-相關(guān)性激酶(ATR)、 乳腺癌基因1號(BRCA1)、重組蛋白 A51(RAD51)等]有關(guān)，參與DNA修復(fù)。研究[22]發(fā)現(xiàn)，抗美法侖的MM細(xì)胞通過上調(diào)FA/BRCA通路的基因表達(dá)，去除鏈間交聯(lián)，而PARP(poly ADP-ribose polymerase)抑制劑則能通過抑制FA/BRCA通路逆轉(zhuǎn)MM細(xì)胞對美法侖耐藥。另一方面，堿基切除修復(fù)(base excision repair, BER)參與抵抗DNA交聯(lián)的作用也得到重視。在美法侖耐藥的MM細(xì)胞中，可見3種BER糖基化酶[Nei樣DNA糖基化酶1(NEIL1)、尿嘧啶DNA糖基化酶2(UNG2)、N-甲基嘌呤DNA糖基化酶(MPG)]表達(dá)下調(diào)[23]。

4 糖皮質(zhì)激素的耐藥機(jī)制與相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物

大多數(shù)糖皮質(zhì)激素的作用是由糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)介導(dǎo)的，其屬于核轉(zhuǎn)錄因子，參與多條信號通路，影響靶細(xì)胞中基因表達(dá)[24]。研究[25]發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素耐藥細(xì)胞系表達(dá)的GR亞型均低于糖皮質(zhì)激素敏感細(xì)胞，這或許與GR編碼基因NR3C1的第2內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄延伸阻滯有關(guān)。然而Kfir-Erenfeld等[26]卻指出，只有少數(shù)受糖皮質(zhì)激素影響的基因與細(xì)胞凋亡相關(guān)，而僅有這些基因產(chǎn)物的表達(dá)并不足以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此，糖皮質(zhì)激素的非基因組效應(yīng)引起了學(xué)者的重視。研究[27]發(fā)現(xiàn)，GR可轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，降低膜電位并釋放細(xì)胞色素C和第2種線粒體來源的激活劑(smac/diablo)，從而激活內(nèi)在線粒體凋亡途徑。同時，糖原合酶激酶3(GSK3)和促凋亡的Bcl-2蛋白質(zhì)(BIM)在GR啟動的內(nèi)在凋亡途徑中也起著至關(guān)重要的作用。上述作用途徑的每一個分子異常都可能導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素耐藥，同時也是潛在的干預(yù)對象，以增加腫瘤細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素的敏感性。如GSK3在糖皮質(zhì)激素敏感細(xì)胞中的活性顯著高于耐藥細(xì)胞，而應(yīng)用PI3K/AKT的特異性抑制劑——麥草胺，有助于保持GSK3的活性，提高細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素敏感性。而如何選擇并使用這些潛在的生物學(xué)標(biāo)志物來預(yù)測GR反應(yīng)性仍是目前研究的難點(diǎn)。

5 免疫調(diào)節(jié)劑(IMiDs)的耐藥機(jī)制與相關(guān)生物學(xué) 標(biāo)志物

近年的研究[28]發(fā)現(xiàn)，在第2代IMiDs——來那度胺的作用下，多種MM細(xì)胞系中CRBN(cereblon)蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)，提示CRBN是來那度胺抗MM作用的靶點(diǎn)。此外，復(fù)發(fā)患者中CRBN的基因突變率遠(yuǎn)高于初診患者，并且與IMiDs作用時間呈正相關(guān)，而這些突變位點(diǎn)均在IMiDs結(jié)合域內(nèi)。在隨后的體外研究中發(fā)現(xiàn)，CRBN高表達(dá)的MM細(xì)胞可重獲來那度胺敏感性，而引入CRBN突變基因的細(xì)胞則對其耐藥，從而證實了CRBN的基因突變能導(dǎo)致來那度胺耐藥[29]。目前，新一代CRBN E3連接酶調(diào)節(jié)劑Ⅰ (berdomide)已進(jìn)入Ⅰ或Ⅱ期臨床試驗，其聯(lián)合地塞米松治療RRMM的效果顯著[30]。

而在分析技術(shù)方面，近期針對CRBN在內(nèi)的常見突變基因的研究應(yīng)用了具有針對性的二代測序技術(shù)，生成了一個包括47個基因的MM突變面板，僅需少量DNA，就能在短時間內(nèi)準(zhǔn)確檢測MM患者的基因組，以指導(dǎo)個體化治療[31]。另外，非質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)定量技術(shù)也被用于MM的研究中，例如，毛細(xì)管納米免疫分析，可以自動定量樣品中低濃度的蛋白質(zhì)。一項研究[32]運(yùn)用此方法評估了MM相關(guān)的12種蛋白質(zhì)對患者生存的影響，結(jié)果顯示，CRBN蛋白質(zhì)水平能預(yù)測IMiDs治療后患者的生存狀況，而mRNA水平則與預(yù)后無關(guān)。這些潛在生物學(xué)標(biāo)志物的探索，以及新興的腫瘤分析技術(shù)都為將來精準(zhǔn)治療MM奠定了基礎(chǔ)。

6 總結(jié)與展望

目前，大量化合物、免疫療法在臨床前研究中涌現(xiàn)，極大拓展了治療MM的思路。但我們?nèi)孕枵J(rèn)識到MM的異質(zhì)性是動態(tài)的，這給腫瘤細(xì)胞提供了逃脫多種化療藥物的機(jī)會。而將精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的理念融入臨床中，通過新興的腫瘤分析技術(shù)檢測MM患者相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物水平，以評估個體對各治療方案的反應(yīng)性。這為從新角度認(rèn)識MM，為個體制訂具有針對性、以數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的治療策略創(chuàng)造了技術(shù)條件，或許可以從根本上改變目前MM的治療模式。而上述的一些定量技術(shù)仍待進(jìn)一步發(fā)展，一方面可與具有潛在臨床價值的生物學(xué)標(biāo)志物相結(jié)合，另一方面不斷優(yōu)化以提高其可行性和經(jīng)濟(jì)性；從而早日實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療在MM臨床診治中的普及。