藥品霉菌和酵母菌總數(shù)能力驗(yàn)證結(jié)果分析

王芬

摘要：目的：分析藥品霉菌和酵母菌總數(shù)的能力驗(yàn)證的結(jié)果。方法：依據(jù)能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書，及《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，并采用雙人獨(dú)立操作，多廠家培養(yǎng)基。結(jié)果：樣品|Z|值均<1，均取得滿意結(jié)果。結(jié)論：分析藥品霉菌和酵母菌總數(shù)能力驗(yàn)證結(jié)果，吸取經(jīng)驗(yàn)，不斷提高本實(shí)驗(yàn)室藥品霉菌和酵母菌的檢測(cè)能力。

關(guān)鍵詞：藥品霉菌和酵母菌總數(shù);能力驗(yàn)證

【中圖分類號(hào)】 R453? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2021）17--02

生活中霉菌無(wú)處不在，它會(huì)使食品藥品保質(zhì)期變短、引起食品藥品霉壞變質(zhì)。食用霉菌超標(biāo)的食品藥品，如果產(chǎn)生一定量的霉菌毒素，可能引起急性中毒、慢性中毒。酵母雖然本身并非有害菌，但酵母超標(biāo)會(huì)引起食物藥物變質(zhì)，促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，引發(fā)各種腸道疾病，食用酵母超標(biāo)的食物藥物可能引起腹瀉，危害身體健康。

霉菌和酵母菌總數(shù)是《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查的項(xiàng)目，是評(píng)價(jià)藥品安全性的重要指標(biāo)【1】，參加此項(xiàng)目的能力驗(yàn)證，從能力驗(yàn)證的結(jié)果評(píng)價(jià)中得出有關(guān)自身能力的結(jié)論，通過(guò)能力驗(yàn)證得到鍛煉，積累經(jīng)驗(yàn)，更好地開展日常檢驗(yàn)檢測(cè)工作。

1材料和方法

1.1樣品來(lái)源

樣品由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供，樣品編號(hào)為20-R062，20-M648。

1.2培養(yǎng)及試劑

沙氏葡萄糖瓊脂SDA對(duì)照培養(yǎng)基購(gòu)自中檢院，沙氏葡萄糖瓊脂SDA（含氯霉素）購(gòu)自北京三藥，沙氏葡萄糖瓊脂SDA購(gòu)自廣東環(huán)凱和北京三藥。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品處理：按作業(yè)指導(dǎo)書要求對(duì)樣品進(jìn)行水化溶解處理，稀釋10-1到10-2兩個(gè)稀釋度，? 依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法，進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)，23.0℃，培養(yǎng)5天。

1.3.2具體步驟：每個(gè)項(xiàng)目由2名實(shí)驗(yàn)員獨(dú)立完成（樣品水化除外）：人員1和人員2，選擇三個(gè)廠家培養(yǎng)基，環(huán)凱，三藥，中檢院，還增加三藥的含氯霉素的SDA。

2結(jié)果與分析

2.1不同廠家的SDA，檢驗(yàn)人員1和檢驗(yàn)人員2的檢驗(yàn)結(jié)果偏差不大，|Z|都小于1，與理論值比較接近。

2.2用日常藥品微生物限度檢驗(yàn)的思維，考慮樣品微生物限度的限值，未考慮到能力驗(yàn)證樣品是人工污染樣品，樣品菌量不一定在微生物限值內(nèi)，有可能更高，本次實(shí)驗(yàn)只做10-1到10-2，存在取不到最適稀釋級(jí)的風(fēng)險(xiǎn)。

2.3霉菌和酵母菌的檢測(cè)過(guò)程要注意防止交叉污染的發(fā)生。霉菌和酵母菌數(shù)量偏低或偏高，涉及檢測(cè)過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，如稀釋度的選擇、稀釋過(guò)程刻度吸管的更換、傾注平板時(shí)培養(yǎng)基溫度、加入樣品并倒入培養(yǎng)基的時(shí)間是否控制在15min，培養(yǎng)基的質(zhì)量控制等，需要實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)加強(qiáng)質(zhì)量控制。

2.4注意每天都觀察培養(yǎng)結(jié)果。霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)中霉菌48小時(shí)，已經(jīng)可以看見，72小時(shí)，已經(jīng)長(zhǎng)滿，如有細(xì)菌干擾，蔓延，就不好計(jì)數(shù)，所以霉菌和酵母菌應(yīng)該24-48小時(shí)開始計(jì)數(shù)。并繼續(xù)觀察到5天。培養(yǎng)期間的觀察時(shí)不能觸碰平皿，避免孢子脫落生長(zhǎng)，影響計(jì)數(shù)結(jié)果。

霉菌在平板上生長(zhǎng)的菌落較大，較難辨別每個(gè)單個(gè)菌落，因此在計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)更為仔細(xì)認(rèn)真辨別。 如果霉菌酵母菌都長(zhǎng)，酵母菌在皿底觀察，更容易計(jì)數(shù)。

2.5實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵步驟可以拍攝照片，可在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不滿意結(jié)果時(shí)，較好的根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行溯源分析【2】。像此次能力驗(yàn)證，未考慮酵母菌，直接把霉菌形態(tài)外的菌落認(rèn)定為細(xì)菌，單計(jì)數(shù)霉菌菌落數(shù)，如果及時(shí)拍照，可重新計(jì)數(shù)，待后續(xù)鑒定細(xì)菌和酵母菌后，確定最終結(jié)果，避免錯(cuò)報(bào)。

2.6能力驗(yàn)證樣品是人工污染樣品，是定向計(jì)數(shù)，霉菌和酵母菌總數(shù)就不考慮把細(xì)菌算進(jìn)去。B20200004（20-M648）樣品，看菌落形態(tài)，只判斷有細(xì)菌，霉菌，未對(duì)細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)鑒定，未考慮到酵母菌的可能，直接按霉菌的形態(tài)判斷為霉菌，以霉菌來(lái)計(jì)數(shù)，按霉菌結(jié)果報(bào)送，存在可能漏掉酵母菌的風(fēng)險(xiǎn)。

能力驗(yàn)證樣品發(fā)樣前，應(yīng)該用質(zhì)控菌做相關(guān)實(shí)驗(yàn)，熟悉常見細(xì)菌，霉菌，酵母菌在TSA、SDA等培養(yǎng)基上的形態(tài)。學(xué)會(huì)鑒定區(qū)分酵母菌和細(xì)菌。酵母菌容易與細(xì)菌混淆，要做相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，鑒定是酵母菌還是細(xì)菌，避免漏掉酵母菌。

2.7本次實(shí)驗(yàn)是檢驗(yàn)開始后，才考慮用含氯霉素的沙氏葡萄糖瓊脂，含氯霉素的沙氏葡萄糖瓊脂的結(jié)果是水化樣品48h后的，存在樣品含菌量減少的風(fēng)險(xiǎn)。所以實(shí)驗(yàn)前應(yīng)該提前考慮好，實(shí)驗(yàn)可能存在的干擾因素，參考食品檢驗(yàn)方法，選擇多種選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比如含氯霉素SDA，玫瑰紅鈉、孟加拉紅、PDA，或者霉菌和酵母菌測(cè)試紙片進(jìn)行輔助判斷。

3.細(xì)菌、霉菌和酵母菌的區(qū)別

SDA培養(yǎng)基中葡萄糖占62%，高糖高滲的環(huán)境對(duì)細(xì)菌有一定的抑制能力，但并不能完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。2015年版藥典微生物計(jì)數(shù)法明確了SDA培養(yǎng)基中細(xì)菌能夠生長(zhǎng)這一客觀事實(shí)。【3】當(dāng)細(xì)菌造成霉菌和酵母菌總數(shù)結(jié)果不符合規(guī)定時(shí)，明確可采用含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定?！?】

孟加拉紅培養(yǎng)基常用于食品的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù) ，其組分與沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基比較，除了緩沖劑、微量元素、凝固劑和供微生物生長(zhǎng)必須的碳源、氮源及能源，其中每 1 L 還含有 0.1 g 氯霉素和 0.033 g 孟加拉紅。氯霉素為廣譜抗生素，可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng);孟加拉紅為選擇性抑菌劑，其不但可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，還能減緩霉菌因生長(zhǎng)過(guò)快導(dǎo)致的菌落蔓延。而沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基沒(méi)有選擇性，細(xì)菌同樣可以生長(zhǎng)，如果大量細(xì)菌、霉菌和酵母菌同時(shí)在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，則無(wú)法排除細(xì)菌干擾，導(dǎo)致霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。【5】

但是由于一些難以預(yù)計(jì)的因素，例如培養(yǎng)基的質(zhì)量等。在孟加拉紅培基上也可能生長(zhǎng)出細(xì)菌菌落來(lái)，有時(shí)候未凸出瓊脂表面的霉菌菌落也不太好判斷。以下為一些區(qū)分孟加拉紅培基上細(xì)菌、霉菌、酵母菌的方法：

3.1觀察菌落特征

通常情況下三種菌落在孟加拉紅培基上的特征比較：

3.2低倍鏡觀察菌落邊緣形態(tài)：

若是肉眼觀察菌落形態(tài)還無(wú)法判斷的話可以用普通光學(xué)顯微鏡觀察菌落的邊緣較薄較透光的部分。觀察是否具有可以辨別的特征性結(jié)構(gòu)。

3.3染色法

挑取菌落用亞甲基藍(lán)或革蘭氏染色，酵母菌或霉菌在低倍鏡下即可見到孢子或菌絲，而細(xì)菌不可見。

4.結(jié)論：藥品霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定，除了考慮定量檢測(cè)的關(guān)鍵因素，如稀釋度的選擇、稀釋過(guò)程刻度吸管的更換、傾注平板時(shí)培養(yǎng)基溫度、加入樣品并倒入培養(yǎng)基的時(shí)間控制在15min，培養(yǎng)基的質(zhì)量控制等，還要注意區(qū)分細(xì)菌和酵母菌，鑒定酵母菌，整體提高霉菌和酵母菌的檢測(cè)能力。

參考文獻(xiàn)：

[1]呂婷婷，吳嬌嬌 板藍(lán)根顆粒霉菌和酵母菌總數(shù)不確定度評(píng)定? 中國(guó)藥物評(píng)價(jià) 2019年第 36卷第 4期 278-280

[2]徐靜姿 浙江省檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室阪崎桿菌和金黃色葡萄球菌檢測(cè)能力驗(yàn)證情況分析 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志 2015年6月第25卷第12期 2052-2053

[3]國(guó)家藥典委員會(huì) 中國(guó)藥典分析檢測(cè)技術(shù)指南? 2017年7月第1版編著569

[4]國(guó)家藥典委員會(huì) 中華人民共和國(guó)藥典 2015 年版.四部[S].2015：144

[5]石琳，杜蓉，李學(xué)興 藥品霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)替代培養(yǎng)基驗(yàn)證 藥物分析雜志2019，39（5）? 859-863