Nrf2及其信號通路在肝缺血再灌注損傷中作用的研究進展

李日，付冉，余偉明，溫軍業(yè)，趙世叢，李越昌，張萬星

1 華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，河北唐山063000；2 河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；3 河北省人民醫(yī)院；4 河北北方學(xué)院研究生學(xué)院

肝缺血再灌注損傷（IRI）是肝移植、肝切除、低血容量性休克和創(chuàng)傷過程中最常見的組織損傷類型，它的發(fā)生是一個復(fù)雜、多因素的過程，涉及了多種細胞損傷機制。其中，缺血期出現(xiàn)的組織缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、代謝反應(yīng)中斷等因素可損害線粒體活性，而線粒體功能障礙可誘導(dǎo)活性氧（ROS）大量產(chǎn)生，導(dǎo)致肝細胞損傷［1］，再灌注期則可使得炎癥介質(zhì)、凋亡介質(zhì)以及ROS 等介質(zhì)被激活，造成組織功能的惡化［2］。肝IRI 的防治策略主要包括缺血預(yù)處理、藥物預(yù)處理及缺血后處理等，但其效果并不突出。在參與減輕肝臟IRI 的轉(zhuǎn)錄因子中，核因子紅細胞2 相關(guān)因子2（Nrf2）是細胞內(nèi)抗氧化過程的重要調(diào)節(jié)因子［3］，Nrf2 的激活可誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列活性酶，使其具有明顯的抗炎、抗凋亡和抗氧化應(yīng)激等細胞保護作用。近年，越來越多的研究證實Nrf2 對肝臟IRI 有保護作用［4］，且有關(guān)其對肝臟IRI 的作用及機制方面的研究也取得了一些成績。現(xiàn)就肝IRI 中Nrf2相關(guān)的信號通路及其作用的研究進展作以下綜述，以期為肝IRI的治療提供新的治療靶點及策略。

1 Nrf2的結(jié)構(gòu)

Nrf2 起初克隆自人類白血病細胞株，并被鑒定為Cap-n-collar 堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，是具有神經(jīng)保護作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其含有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）結(jié)構(gòu)，除此之外，Nrf2 還有6 個高度保守的環(huán)氧丙氯相關(guān)蛋白同源結(jié)構(gòu)域（Neh），包括Neh1～Neh6。其中，Neh1 區(qū)的C端bZIP 結(jié)構(gòu)在Nrf2 與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的識別與結(jié)合中發(fā)揮著重要作用，并可啟動目標基因的轉(zhuǎn)錄；Neh2 區(qū)位于結(jié)構(gòu)的氨基端，其包含的DLG 和ETGE 兩個基元可作為Nrf2 與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（KEAP1）的結(jié)合位點，對Nrf2 的活性起到負性調(diào)節(jié)作用，與KEAP1 的結(jié)合使得Nrf2 被錨定于胞質(zhì)中而處于失活狀態(tài)；Neh3 區(qū)位于結(jié)構(gòu)的羧基端，可與輔助因子結(jié)合活化轉(zhuǎn)錄，Neh4 和Neh5 同樣可對Nrf2 的轉(zhuǎn)錄起到活化作用，當Nrf2 轉(zhuǎn)移入核后可以Nrf2-Maf 二聚體的形式與ARE 結(jié)合，在共激活因子cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的共同作用下啟動轉(zhuǎn)錄，Neh6 區(qū)對轉(zhuǎn)錄起負性調(diào)節(jié)作用，主要負責Nrf2的降解［5-6］。

2 Nrf2在肝IRI中的作用

2.1 抑制氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激時，由于機體受外界刺激，體內(nèi)ROS 大量產(chǎn)生，ROS 則可誘導(dǎo)肝細胞脂質(zhì)過氧化損傷、蛋白質(zhì)氧化、線粒體功能障礙和DNA 損傷，在缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷中起關(guān)鍵作用［2］。Nrf2 進入細胞核后可與ARE 結(jié)合進而調(diào)節(jié)II相代謝酶和抗氧化酶基因表達，如血紅素氧合酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、醌氧化還原酶-1（NQO1）及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）等來對抗氧化應(yīng)激。此外，肝細胞激活Nrf2 可導(dǎo)致NADPH 升高，從而防止肝臟氧化損傷。有研究表明，Nrf2通路激活劑（dh404）預(yù)處理可顯著增加谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）和谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基（GCLM）的表達，并可適度減少肝細胞損傷［7］。15-脫氧-Δ12，14-前列腺素J2（15d-PGJ2）是過氧化物酶體增殖物激活受體γ 的天然配體之一，15d-PGJ2 對肝IRI 小鼠的預(yù)處理可誘導(dǎo)Nrf2 的核易位并激活Nrf2，誘導(dǎo)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1、NQO1 和GCLC 的表達，以Nrf2 依賴的方式保護肝臟免受IRI 損傷［7］。除此之外，CHEN 等［8］發(fā)現(xiàn)，當富馬酸和姜黃素聯(lián)合應(yīng)用時可顯著誘導(dǎo)Nrf2 的表達，提高肝臟三羧酸循環(huán)水平，有效介導(dǎo)HO-1 等抗氧化酶的表達，從而抑制肝IRI模型的氧化應(yīng)激水平。

2.2 抑制炎癥 炎癥反應(yīng)在肝臟IRI 的發(fā)生中起著重要作用，中性粒細胞、CD4+T 淋巴細胞等炎性細胞的聚集和活化可導(dǎo)致肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞的損傷；腫瘤壞死因子α（TNF-α）等體液因子則可促進中性粒細胞的聚集和活化，造成肝細胞損傷［9］。近年越來越多的證據(jù)表明，Nrf2 可通過抑制炎癥反應(yīng)而減 輕 肝 臟IRI。MASUDA 等［7］選 用Nrf2 激 動 劑（dh404）對肝IRI 大鼠進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)激動劑處理組大鼠的肝臟中性粒細胞浸潤及髓過氧化物酶活性均顯著低于對照模型組，且肝臟的病理學(xué)損傷有明顯的改善，提示Nrf2 的激活可抑制肝IRI 中的炎癥反應(yīng)進而減輕肝臟損傷。TAO 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，薔薇果總黃酮可改善肝臟IRI，其可通過激活Nrf2信號通路而抑制炎癥因子白介素-1β、白介素-6和TNF-α的表達，提示Nrf2 可通過抑制炎癥反應(yīng)而減輕肝臟IRI。

2.3 抑制細胞凋亡 細胞凋亡是指細胞結(jié)構(gòu)和功能的不可逆喪失，隨著對細胞凋亡研究的進一步深入，我們發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在肝IRI 進程中發(fā)揮著重要作用。輔酶Q10 是一種強抗氧化劑，當輔酶Q10 作用于肝IRI 模型大鼠時，不僅可通過明顯活化Nrf2來降低Bax、PUMA 等促凋亡基因的表達，還可明顯上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，進而減少肝細胞的凋亡，改善由IRI 引起的肝臟組織病理學(xué)損傷［11］。黃芩甙是一種黃酮類化合物，具有較好的生物活性，WU 等［12］將黃芩苷暴露于缺氧/富氧（H/R）誘導(dǎo)的肝細胞來模擬黃芩苷對肝IRI 的影響，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過調(diào)節(jié)KEAP1-Nrf2-ARE 信號傳導(dǎo)通路保護肝細胞免受H/R 誘導(dǎo)的氧化損傷，黃芩苷可顯著上調(diào)Bcl-2 的表達并下調(diào)Bax 表達，減少H/R 刺激的肝細胞凋亡。

3 Nrf2相關(guān)通路在肝IRI中的作用

在肝IRI 中起作用的Nrf2 相關(guān)通路主要有KE?AP-Nrf2-ARE 通路、δ-阿片受體（DOR）-蛋白激酶C（PKC）-Nrf2 通路、沉默交配型信息調(diào)節(jié)2 同源基因1（Sirt1）-Nrf2 信號通路、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K-AKT）-Nrf2 通路、JAK 激酶（JAK）-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）-Nrf2 通路、Brahma 相關(guān)基因1（Brg1）-Nrf2通路等。

3.1 KEAP-Nrf2-ARE 通路 KEAP1 含有5 個 結(jié)構(gòu)域，其雙甘氨酸重復(fù)區(qū)是KEAP1 與Nrf2 的Neh2 的部位結(jié)合區(qū)。在正常條件下，Nrf2 位于與其抑制因子KEAP1相連的細胞質(zhì)中，KEAP1通過泛素化和蛋白酶體降解而抑制Nrf2 的轉(zhuǎn)錄活性［13］；應(yīng)激條件下Nrf2 可與KEAP1 解離，導(dǎo)致Nrf2 進入細胞核，并與ARE 結(jié)合啟動調(diào)節(jié)II 相代謝酶和抗氧化酶基因表達，如HO-1、SOD、GPx、NQO1 及γ-GCS 等［14］。越來越多的研究證實，KEAP-Nrf2-ARE 轉(zhuǎn)錄通路在體內(nèi)外對IRI 的保護中發(fā)揮重要作用。CHEN 等［15］用SD大鼠構(gòu)建了肝IRI 模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，肝IRI 組Nrf2、ARE、HO-1、NQO-1 等蛋白表達水平明顯增高，而與IRI 組相比，羅格列酮干預(yù)組Nrf2、ARE 等蛋白表達水平進一步升高，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的表達水平明顯降低，肝組織病理損傷明顯好轉(zhuǎn)，充分印證了Nrf2/ARE 通路在肝IRI 中的保護作用。與之類似，常見抗氧化劑蘿卜硫素、西格列汀、西洛他唑等藥物也可通過激活Nrf2-ARE 信號通路來改善氧化應(yīng)激、減弱肝IRI［16-18］。黃芩苷是一種黃酮類化合物，被報道為Nrf2 信號的增強子。有研究表明，黃芩苷處理可顯著降低KEAP1 的表達，增加Nrf2 的表達，誘導(dǎo)HO-1和NQO1 的mRNA 表 達，進 而減 輕 肝IRI［19］。LEE等［20］則通過構(gòu)建直接激活Nrf2-ARE 通路的轉(zhuǎn)基因模型證明了Nrf2-ARE通路過度激活對肝IRI的保護作用。

3.2 DOR-PKC-Nrf2 通路 PKC 是G 蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，其在細胞質(zhì)中可以激活三磷酸腺苷敏感的鉀離子通道，從而促進鉀離子經(jīng)線粒體途徑流出，抑制鈣離子流動，縮短動作電位持續(xù)時間以及減少ATP 的消耗，提供器官保護作用［2］。有證據(jù)表明，活化的PKC 可調(diào)節(jié)Nrf2 Ser40 位點的磷酸化，進而促進Nrf2 的轉(zhuǎn)位［21］。DOR 是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，在常氧狀態(tài)下，DOR 可通過激活PKC 依賴途徑進而上調(diào)與抗氧化作用相關(guān)的Nrf2 靶向基因的表達。在缺血條件下，激活DOR 可降低KEAP1 mRNA 的表達，從而增加Nrf2在細胞質(zhì)中的釋放，增強Nrf2 在細胞核中的功能［22］。有研究表明，［DAla2，D-Leu5］-腦啡肽可激活DOR-PKC-Nrf2 軸，促進Nrf2 核易位和下游Ⅱ期代謝酶和抗氧化基因的表達，顯著降低血清中ALT 和AST 及肝勻漿中丙二醛的水平，升高肝勻漿中谷胱甘肽、過氧化氫酶和SOD 水平，被認為是預(yù)防肝IRI 的一個潛在靶點［2］。CAO 等［22］則通過體外研究證實，DOR-PKC- Nrf2 通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對缺氧—復(fù)氧肝細胞損傷的保護作用。以上研究提示在肝缺血再灌注時，Nrf2 可能被通過DOR-PKC信號通路激活。

3.3 Sirt1-Nrf2 信號通路 Sirt1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的Ⅲ類核組蛋白去乙?；福?3］。Sirt1 是去乙?；讣易遄钪匾某蓡T之一，可參與基因表達、代謝和氧化應(yīng)激等多種生理功能的調(diào)節(jié)［24］。當Sirt1 觸發(fā)Nrf2 和KEPA1 的分離時，Nrf2 轉(zhuǎn)位進入細胞核，Sirt1-Nrf2 信號可以激活某些抗氧化酶，改善細胞氧化還原狀態(tài)。此外，Sirt1 在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Sirt1 基因可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB 的活動，增加抗氧化基因表達，抑制炎癥［25］。輔酶Q10 是線粒體電子傳遞鏈的組成部分，MAH 等［26］發(fā)現(xiàn)，輔酶Q10 可通過顯著激活Nrf2 蛋白恢復(fù)氧化與抗氧化平衡，同時可上調(diào)Sirt1 和FOXO-3 基因的表達，通過Sirt1-FOXO-3-Nrf2 信號通路顯著改善了IRI 損傷引起的肝臟功能障礙和氧化應(yīng)激，并且改善了IRI 引起的組織病理學(xué)損傷。有研究表明，金櫻子總黃酮（TFs）預(yù)處理可增加肝臟組織中Sirt1、總Nrf2、核Nrf2、HO-1、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）的水平，降低細胞質(zhì)Nrf2 的水平，表明TFs的抗IRI 作用可能是通過激活Sirt1-Nrf2-ARE 通路提高HO-1和GST蛋白水平，改善氧化應(yīng)激進而減少肝細胞損傷［23］。證明Sirt1 可以激活Nrf2-ARE 信號通路來減輕肝IRI。

3.4 PI3K-AKT-Nrf2 通路 PI3K-AKT 軸是一種細胞存活通路，在調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。PI3K-AKT 信號級聯(lián)通過抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生和凋亡，對IRI 具有很強的保護作用［27］。一旦PI3K 被激活，它可將磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸，進而磷酸化并激活A(yù)KT［28］。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對細胞內(nèi)外多種細胞刺激均有反應(yīng)，是生存信號的重要調(diào)控因子。激活的AKT 可促進下游分子的磷酸化，包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和Bcl-2，以抑制細胞凋亡［29］。除此之外，PI3K-AKT的級聯(lián)反應(yīng)對Nrf2 的激活具有正向影響。越來越多的證據(jù)表明，PI3K-AKT 信號通路對IRI 具有很強的保護作用。CARINI 等［30］發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理后的肝細胞可激活PI3K 并調(diào)節(jié)蛋白激酶C 依賴的信號通路，提示PI3K在肝細胞耐缺氧中起重要作用。碲酸可誘導(dǎo)PI3K和AKT 蛋白表達明顯上調(diào)，并可恢復(fù)IRI 的組織病理學(xué)變化，通過激活Nrf2 和PI3K/AKT 信號級聯(lián)，為肝IRI提供一種新的治療方向［14］。

3.5 JAK1-STAT-3-Nrf2 通路 JAK-STAT 信號通路是細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路之一，除了可以調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡外，還可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在肝IRI 中發(fā)揮重要作用［31］。STAT-3 的表達異常不僅在腦、心、腎等多種器官的IR 損傷中起重要作用［32］，XIONG 等［33-34］研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟IRI 過程中，STAT-3表達和功能也顯著增強，進而證實了STAT-3與肝臟IR 也密切相關(guān)。KAMEL 等［29］用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑培哚普利對肝IRI 大鼠進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)培哚普利可顯著降低JAK1/STAT-3 蛋白表達，可通過激活JAK1-STAT-3-Nrf2 信號通路，改善肝IRI 期間的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并明顯減少肝臟損傷。

3.6 Brg1-Nrf2 通路 Brahma 相關(guān)基因1（Brg1）是SWI/SNF 復(fù)合體的核心ATP 酶，是染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物的一個亞基，在哺乳動物細胞基因的激活和轉(zhuǎn)錄中起著核心作用，且在不同組織中干細胞的增殖、分化中發(fā)揮重要作用［35］。Brg1 可保護抗氧化防御基因啟動子免受氧化損傷。有研究證明，肝IRI 可顯著增加氧化損傷，降低Brg1 的表達［36］。GE 等［35］用Brg1 過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠對其進行肝IRI 處理，發(fā)現(xiàn)IRI 早期Brg1 的表達被抑制，但再灌注時有所恢復(fù)，Brg1 在再灌注時的恢復(fù)可以增強Nrf2 介導(dǎo)的HO-1 的表達，從而有效提高抗氧化能力，對抗肝細胞損傷；在轉(zhuǎn)基因小鼠中，Brg1 的過表達可顯著降低肝IRI 的氧化應(yīng)激，同時該學(xué)者通過構(gòu)建缺氧/復(fù)氧細胞模型，從體外研究來驗證Brg1 在肝IRI 中的作用；在Brg1 基因轉(zhuǎn)染的細胞中，Brg1 的過表達減弱了肝IRI 的氧化應(yīng)激水平，同時Nrf2 蛋白表達增強，HO-1 誘導(dǎo)及啟動子熒光素酶活性增強，而在Brg1 基因敲除細胞中，上述現(xiàn)象均不存在。一項關(guān)于Brg1 是否能減輕肝臟缺血再灌注所致肺損傷的研究表明，Brg1 的過表達可增加Nrf2 的表達和核轉(zhuǎn)位，并可激活抗氧化酶、降低炎癥因子的表達，從而減輕肝臟缺血再灌注誘導(dǎo)的肺氧化損傷［36］。

綜上所述，在肝缺血再灌注時，Nrf2 可通過抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡等作用來減輕肝臟IRI。Nrf2 相關(guān)信號通路主要有KEAP-Nrf2-ARE 通路、DOR-PKC-Nrf2 通 路、Sirt1-Nrf2 信 號 通 路、PI3KAKT -Nrf2 通路、JAK-STAT-Nrf2 通路、Brg1-Nrf2 通路等，以上通路并非獨立，往往幾種信號通路相互交聯(lián)，共同參與抑制肝IRI。越來越多的證據(jù)表明，Nrf2 對各種肝臟疾病具有保護作用，如膽汁淤滯性肝損傷、病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、藥物性肝損傷、肝IRI 和原發(fā)性肝臟惡性腫瘤等，越來越多的中醫(yī)藥也已被證實可通過Nrf2 改善肝IRI，然而，其激活Nrf2 的途徑減輕肝IRI 的具體機制尚待進一步研究。通過激活Nrf2 來減輕肝IRI 可能是一種新的治療缺血性肝病的策略，其激活的作用機制及其作用底物尚有待進一步研究，以Nrf2 為作用靶點開發(fā)的藥物對于治療肝IRI 具有臨床指導(dǎo)意義，有望為臨床治療肝IRI尋找新的方案提供機遇。