基于線粒體COI基因序列的智利竹?魚遺傳多樣性分析

刁 樂，宋 煒，魏鴻擎，梁述章，蔣科技，黃洪亮，馬春艷，張鳳英，陳雪忠，馬凌波

（1．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

智利竹?魚（Trachurus murphyi）屬脊索動物門， 硬 骨 魚 綱 （Osteichthyes）， 鱸 形 目（Perciformes），鲹科（Carangidae），竹?魚屬，為暖水性中上層魚類，是典型的大洋性中上層聚群魚類［1］。智利竹?魚廣泛分布于秘魯和智利沿海水域以及智利專屬經(jīng)濟(jì)區(qū)以外的公海海域［2］。其生長快、生產(chǎn)力高且捕撈產(chǎn)量多，是世界上主要的海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一［3］。研究者曾利用聲吶模型［4］和捕食營養(yǎng)學(xué)［5］等研究智利竹?魚的資源量和分布范圍，20世紀(jì)90年代智利竹?魚的資源量可高達(dá)440萬t［6］，但隨著高強(qiáng)度商業(yè)捕撈的發(fā)展，智利竹?魚種群結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，南太平洋區(qū)域漁業(yè)管理組織強(qiáng)調(diào)，相關(guān)機(jī)構(gòu)迫切需要對竹?魚種群結(jié)構(gòu)和資源保護(hù)展開更多的追蹤研究［7］，以保證竹?魚良好的種質(zhì)資源。

迄今為止，對智利竹?魚的研究多集中在資源調(diào)查［8］、時(shí)空分布變化［9］、攝食營養(yǎng)［10］和生長發(fā)育［11］等方面，對其遺傳多樣性和遺傳分化方面的研究較少。張敏等［12］以細(xì)胞色素b（Cytb）基因作為分子標(biāo)記，對智利沿岸（33°S、72°W）、太平洋區(qū)域（33°S～35°S、93°W ～95°W）等的智利竹?魚群體做了遺傳關(guān)系初步研究。張偉等［13］利用RAPD技術(shù)對東南太平洋海域（34°S～37°S、90°W ～110°W）智利竹?魚種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。CáRDENAS等［14］運(yùn)用微衛(wèi)星技術(shù)對新西蘭區(qū)域（37°S、178°E）、智利沿岸（20°S～39°S、70°W ～75°W）和太平洋區(qū)域（32°S、91°W）等的智利竹?魚進(jìn)行了遺傳關(guān)系分析研究。這些研究的采樣區(qū)域多集中在智利沿岸和太平洋區(qū)域，缺少對智利外海（78°W ～81°W、40°S～44°S）區(qū)域智利竹?魚群體的研究。此外，目前利用細(xì)胞色素氧化酶亞基I（COI）作為分子標(biāo)記對智利竹?魚的遺傳多樣性進(jìn)行分析的研究較少，這使得本研究具有重要意義。

魚類線粒體基因?yàn)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，結(jié)構(gòu)簡單且遵循母系遺傳，無組織特異性和遺傳重組，因此常被用作分子標(biāo)記，并廣泛應(yīng)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化的研究中［15-17］。COI作為線粒體13個(gè)蛋白編碼基因的一員，在分子標(biāo)記上是研究最為清楚的線粒體基因之一，也有學(xué)者認(rèn)為相比其他線粒體基因，COI是更為理想和常用的分子標(biāo)記［18］。本研究選用COI為分子標(biāo)記，檢測COI基因的序列變異，分析不同群體智利竹?魚的遺傳結(jié)構(gòu)，以期為智利竹?魚資源遺傳多樣性和漁業(yè)管理提供科學(xué)評價(jià)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1． 1 樣本采集和基因組DNA提取

本研究樣本2014年4—6月采集于智利外海（78°40′W ～81°45′W、40°18′S～44°25′S）水域內(nèi)，具體分為A、B、C、D、E、F等6個(gè)不同采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)均采集36個(gè)樣本，其采樣站點(diǎn)和地理分布見圖1。采集樣本后取其肌肉組織，利用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取樣本總DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組的完整性，并用分光光度法測定DNA的濃度和純度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1． 2 智利竹?魚mtDNA COI序列擴(kuò)增及測定

對智利竹?魚mtDNA COI序列采用通用引物［19］（由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成），CFF：（TCRACYAAYCAYAAAGAYATYGGCA C）和CFR：（ACTTCWGGGTGRCCRAAGAATCA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，其中包括10×PCR buffer（Mg2+）5．0μL，2．5 mmol·L-1dNTP 4．0 μL，10 μmol· L-1上 下 游 引 物 各2．0μL，5 U· μL-1Taq DNA 聚合酶0．5μL，50 ng·μL-1DNA模板2μL，最后加雙蒸水至總體積為50μL。樣品在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物用1．2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)成像系統(tǒng)拍照記錄，選擇目的條帶清晰的PCR產(chǎn)物送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序后拼接，測序引物同為PCR擴(kuò)增引物。

圖1 采樣站點(diǎn)地理分布圖Fig.1 Geographical distribution of sampling sites

1． 3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Clustal X對測序所得的216個(gè)樣本的COI序列進(jìn)行拼接及人工校正，將雙向拼接的全序列在NCBI中進(jìn)行BLASTn同源性分析。利用DnaSP 5．1軟件分析樣本單倍型數(shù)目、單倍型多樣性、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和核苷酸多樣性。使用MEGA 5．1軟件構(gòu)建單倍型鄰接關(guān)系樹，關(guān)系樹的可靠性采用1 000次重抽樣進(jìn)行評估。

使用MEGA 5．1軟件計(jì)算其變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)數(shù)和堿基含量；分組計(jì)算群體內(nèi)遺傳距離及兩兩群體間遺傳距離，根據(jù)Kimura-2-Parameter（K-2-P）模型構(gòu)建智利竹?魚群體間的UPGMA樹。采用簡化的中介網(wǎng)絡(luò)法（medianjoining）［20-21］構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖來探討單倍型的譜系結(jié)構(gòu)。

利用Arlequin 3．1軟件中的AMOVA計(jì)算兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)、群體內(nèi)及群體間的遺傳變異分布、遺傳變異指數(shù)Fst值，利用1 000次重抽樣分析來檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。關(guān)于群體歷史動態(tài)研究，利用Arlequin 3．1軟件完成Tajima’ s D檢驗(yàn)和Fu’s Fs檢驗(yàn)，來檢測中性假說是否成立，Tajima’s D［22］和Fu’s Fs［23］中性檢驗(yàn)如果是負(fù)值并且顯著偏離中性，則可能是由于群體擴(kuò)張引起的。利用DnaSP 5進(jìn)行核苷酸錯配分布（mismatch distribution）分析，檢驗(yàn)是否存在群體擴(kuò)張。

2 結(jié)果與分析

2． 1 序列特征分析

智利竹?魚所有個(gè)體的線粒體COI序列均可被穩(wěn)定擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，均顯示為一明亮清晰的條帶，大小為650 bp左右，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后測序。將測序所得到的序列通過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與GenBank數(shù)據(jù)庫中的智利竹?魚COI序列（GenBank登錄JQ354519．1）NC_002813．1相似度為99%，經(jīng)比對和校正，最后用于群體數(shù)據(jù)分析的COI序列長為624 bp。COI基因序列中，變異位點(diǎn)13個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的2．08%；其中簡約性信息位點(diǎn)4個(gè)，單變異位點(diǎn)9個(gè)；平均堿基含量（%）分別為A（23．4）、T（31．1）、G（18．0）、C（27．5），A+T的含量（54．5）略高于G+C的含量（45．5）。

2． 2 單倍型在群體中的分布及遺傳關(guān)系

在216尾智利竹?魚樣本中共檢測到14個(gè)單倍型，各樣本的單倍型分布見圖2。9個(gè)單倍型為單個(gè)群體所獨(dú)有，而群體間共享單倍型為5個(gè)，占單倍型總數(shù)的35．7%，其中Hap1和Hap3為6個(gè)群體所共享。Hap1擁有最高的共享率，共135個(gè)個(gè)體擁有此單倍型，占總數(shù)的62．5%。其次為Hap3，其被49個(gè)個(gè)體共享，共享率為22．7%。Hap10被5個(gè)群體的7個(gè)個(gè)體共享，Hap2被4個(gè)群體的11個(gè)個(gè)體共享。在獨(dú)享單倍型中，群體A擁有最多的獨(dú)享單倍型，共計(jì)4個(gè)，分別為Hap4、Hap5、Hap6和Hap8，且為1個(gè)個(gè)體所擁有。運(yùn)用所有單倍型構(gòu)建的鄰接關(guān)系樹顯示（圖3），其節(jié)點(diǎn)分支支持率普遍偏低，沒有呈現(xiàn)明顯的地理譜系結(jié)構(gòu)。

圖2 智利竹?魚線粒體COI基因序列變異位點(diǎn)Fig.2 Trachurus murphyi mitochondrial COI gene sequence variation sites注：A：腺嘌呤，G：鳥嘌呤，C：胞嘧啶，T：胸腺嘧啶Note：A：adenine，G：guanine，C：cytosine，T：thymine

2． 3 群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

智利竹?魚6個(gè)群體的遺傳多樣性分析見表1。從整體水平來看，216個(gè)樣本的平均單倍型多樣性為0．550±0．033，平均核苷酸多樣性為0．001 10，單倍型多樣性和核苷酸多樣性水平均比較低。從單倍型多樣性來看，群體A和E的單倍型多樣性較高，群體B、C、D和F的單倍型多樣性較低，其中群體F僅為0．375±0．090。在核苷酸多樣性中，6個(gè)群體的核苷酸多樣性均比較低，群體F最低為0．000 63。綜合單倍型多樣性和核苷酸多樣性可見，6個(gè)群體普遍擁有較低的遺傳多樣性，其中群體A遺傳多樣性最高，而群體F的遺傳多樣性最低。

分析智利外海6個(gè)智利竹?魚群體的遺傳距離，群體內(nèi)的平均遺傳距離為0．000 63～0．001 70，其中群體F群體內(nèi)遺傳距離最小（0．000 63）；群體間的平均遺傳距離為0．000 77～0．001 42，群體B和群體F群體間遺傳距離最小（0．000 77）（表2）。由以上結(jié)果可見，群體內(nèi)和群體間的遺傳距離均較小。用Arlequin3．11軟件分析兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)Fst，結(jié)果顯示，兩兩群體間的遺傳分化系數(shù)在-0．019 50～0．041 75，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均不顯著（P＞0．05），這表明群體間存在高度的遺傳同質(zhì)性。另外，從基于K-2-P群體間遺傳距離構(gòu)建的UPGMA樹看，6個(gè)群體兩兩先后聚為一支，沒有明顯的遺傳隔離（圖4）。

AMOVA分子方差分析結(jié)果見表3，將所有群體作為一個(gè)組群分析，群體間的遺傳變異為0．3%，群體內(nèi)遺傳 變異為99．7%，F(xiàn)st值為0．002 62，變異主要來源于群體內(nèi)，且群體間無分化。這些分析表明6個(gè)群體之間不存在顯著的遺傳分化。

圖3 智利竹?魚14種單倍型在6個(gè)群體中的分布及其分子系統(tǒng)樹Fig.3 Distribution and molecular phylogenetic tree of 14 kinds of haplotypes in 6 Trachurus murphyi populations

表1 不同群體智利竹?魚的遺傳多樣性參數(shù)Tab.1 Genetic diversity of different populations of Trachurus murphyi

2． 4 群體歷史動態(tài)分析

依據(jù)Tajima’s D檢驗(yàn)和Fu’s Fs檢驗(yàn)方法對6個(gè)智利竹?魚群體線粒體COI基因DNA多樣性信息進(jìn)行中性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見表4。Tajima’s D檢驗(yàn)結(jié)果和Fu’s Fs檢驗(yàn)結(jié)果均為負(fù)值，Tajima’s D值呈顯著差異，F(xiàn)u’s Fs檢驗(yàn)結(jié)果呈極顯著差異，推測智利竹?魚在智利外海范圍內(nèi)經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件。

表2 智利竹?魚群體間遺傳距離（對角線上）和遺傳分化系數(shù)（F st）（對角線下）Tab.2 Pairwise genetic distances（above diagonal），fixation index（F st）（below diagonal）between every two populations of Trachurus murphyi

圖4 基于K-2-P群體間遺傳距離構(gòu)建的智利竹?魚6個(gè)群體的UPGMA樹Fig.4 UPGMA tree of 6 Trachurus murphyi populations constructed by K-2-P genetic distance

表3 智利竹?魚群體遺傳差異的AMOVA分析Tab.3 Analysis of molecular variance（AMOVA）among populations of Trachurus murphyi

表4 智利竹?魚線粒體COI的中性檢驗(yàn)和錯配分布Tab.4 Neutrality tests and mismatch distribution of mitochondrial COI gene of Trachurus murphyi

3 討論

3． 1 智利竹?魚群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的核心基礎(chǔ)，其多樣性的高低水平對物種的環(huán)境適應(yīng)力、進(jìn)化潛能和生存能力至關(guān)重要，遺傳多樣性的豐富程度越大表明其對環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，同樣進(jìn)化潛能和生存能力也相對較強(qiáng)。相反，遺傳多樣性的下降會導(dǎo)致物種對環(huán)境的適應(yīng)力降低［24-25］。

在對智利竹?魚為數(shù)不多的遺傳多樣性研究中，研究者們采用的線粒體基因、微衛(wèi)星等方法分析得出，智利竹?魚普遍具有較低的遺傳多樣性，并推斷智利竹?魚在南太平洋具有廣闊的分布帶，可視為一個(gè)遺傳群體［12-14］。本研究共獲得14個(gè)單倍型，群體間共享單倍型為5個(gè)。Hap1擁有最高的共享率，共135個(gè)個(gè)體擁有此單倍型，占總數(shù)的62．5%。種群共享及個(gè)體共享單倍型占比大，說明智利外海竹?魚間基因交流頻繁。 根 據(jù) LAN 和 SHI［26］及 GRANT 和BOWEN［27］對群體遺傳多樣性的研究表明，當(dāng)單倍型多樣性小于0．5、核苷酸多樣性小于0．005時(shí)，其群體的遺傳多樣性為較低水平。智利外海竹?魚在整個(gè)分布范圍內(nèi)皆擁有較低的單倍型多樣性（0．375～0．716）和核苷酸多樣性（0．000 63～0．001 69），表明其近期出現(xiàn)過或正經(jīng)歷種群瓶頸效應(yīng)，或種群由單一、少數(shù)系群所發(fā)生的奠基者效應(yīng)，導(dǎo)致其遺傳多樣性偏低，這一結(jié)果也驗(yàn)證了可把該竹?魚分布帶視為一個(gè)群體的推斷。GARDENASA等［14］將在南太平洋區(qū)域的竹?魚視為一個(gè)種群，張敏等［12］認(rèn)為智利經(jīng)濟(jì)區(qū)內(nèi)、外3個(gè)群體不存在顯著遺傳分化，本研究將該智利竹?魚分布帶視為一個(gè)群體的推斷可與上述研究相互印證和補(bǔ)充。

一般單倍型多樣性與群體大小和環(huán)境相關(guān)聯(lián)，較大的群體和較大差異的環(huán)境會導(dǎo)致群體單倍型多樣性偏高［28］。本研究中群體A出現(xiàn)較高單倍型多樣性，這可能是由智利竹?魚不同季節(jié)的空間分布所致，智利竹?魚在冬春季節(jié)受西風(fēng)漂流帶來的冷水勢力影響，整體向北移動［29］，環(huán)境因子的變化可能造成遺傳多樣性的變化。同時(shí)，智利竹?魚是高度洄游物種，SERRA［30］認(rèn)為智利竹?魚的洄游軌跡是一個(gè)環(huán)形的遷移。樣本的隨機(jī)采集和樣本數(shù)量的限制，也可能會造成結(jié)果偏差，因此，需要研究者們對智利竹?魚群體不斷的追蹤調(diào)查，以檢測其多樣性的實(shí)時(shí)變化。

3． 2 智利竹?魚的群體遺傳結(jié)構(gòu)

單倍型構(gòu)建的鄰接關(guān)系樹表明（圖3），單倍型的分支與不同采樣站點(diǎn)的群體之間沒有明顯關(guān)聯(lián)，AMOVA分析結(jié)果顯示，群體間的遺傳變異（0．26%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于群體內(nèi)遺傳變異（99．74%），6個(gè)智利竹?魚群體沒有呈現(xiàn)出顯著的系統(tǒng)地理格局。從遺傳距離來看，群體內(nèi)遺傳距離和群體間遺傳距離都比較小，遺傳分化系數(shù)Fst所有數(shù)值均小于0．05，且大部分為負(fù)值。根據(jù)Fst劃分的遺傳分化水平，當(dāng)Fst＜0．05時(shí)，說明群體間無分化；當(dāng)0．05＜Fst＜0．15時(shí)，說明群體間呈低度分化；當(dāng)Fst＞0．15時(shí)，說明群體間呈高度分化［31］。分析結(jié)果表明，本研究中6個(gè)智利竹?魚群體遺傳分化主要來源于群體內(nèi)，且群體間無明顯分化，這與張偉等［13］的研究結(jié)果一致，即東南太平洋智利竹?魚群體間不存在顯著遺傳分化。

智利外海竹?魚具有季節(jié)性洄游的特點(diǎn)，有較強(qiáng)的擴(kuò)散能力，因此智利竹?魚的分布范圍較廣，同時(shí)其在較大的水域內(nèi)可隨機(jī)交配，這導(dǎo)致其產(chǎn)卵區(qū)域和仔魚分布也十分廣泛，本研究所采樣本站點(diǎn)屬東南太平洋水域，各群體間無明顯分化，可將其視為一個(gè)較大的智利竹?魚群體。何宗會［32］研究表明由于捕撈船隊(duì)的大量捕撈和環(huán)境因素的變化，造成南太平洋智利竹?魚漁業(yè)資源量呈逐漸下降的趨勢。同時(shí)受經(jīng)濟(jì)區(qū)內(nèi)智利竹?魚養(yǎng)殖群體等因素影響，可能導(dǎo)致自然選擇多樣性被破壞，使得整個(gè)智利竹?魚群體的遺傳多樣性水平較低。為了長遠(yuǎn)的維持智利竹?魚種質(zhì)資源和遺傳豐富度，應(yīng)科學(xué)規(guī)范管理、適度適量捕撈，響應(yīng)南太平洋區(qū)域漁業(yè)管理組織的積極號召，以保證智利竹?魚群體的生態(tài)平衡。