基于高通量測序技術(shù)的竹?魚微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)與評價

孔嘯蘭，李 敏，陳作志，張 俊，許友偉，江艷娥

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，廣州 510300）

竹?魚（Trachurus japonicus），隸屬于鱸形目（Perciformes），鲹科（Carangidae），竹?魚屬，因其體呈紡錘形，側(cè)線上均具高而強的棱鱗，形如用竹板編制的組合隆起?，由此得名，主要分布于我國渤海、黃海、東海、南海，以及日本海域、朝鮮半島海域、西北太平洋溫暖水域，是我國近海海域燈光圍網(wǎng)和拖網(wǎng)的主要捕撈對象，南海近海是竹?魚的主要漁場之一，年捕撈量約為2.5×104t，占全國總量的68%［1-4］。研究表明，東海及福建海域竹?魚資源早已衰退，至今難以恢復(fù)［4-7］；南海海域竹?魚雖然產(chǎn)量仍較為穩(wěn)定，但是也已經(jīng)被充分利用［4，8］。為了進一步科學(xué)管理和合理利用南海區(qū)竹?魚資源，急需開展竹?魚資源評估及種群遺傳特性的研究。目前，國內(nèi)關(guān)于竹?魚遺傳方面的研究主要有SONG等［9］、ZHAO等［10］、張艷麗等［11］、牛素芬等［12］采用線粒體和擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記對日本海域、北部灣和福建海域竹?魚遺傳特性的研究，涉及南海海域較少，且未見有關(guān)于竹?魚微衛(wèi)星標(biāo)記的研究。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性高、變異性強、數(shù)據(jù)易統(tǒng)計等突出優(yōu)點［13］，被廣泛應(yīng)用于海洋生物遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析［14-15］。但是，由于微衛(wèi)星標(biāo)記通用性較差，常常具有極強的種屬特異性。因此，應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記開展種群遺傳分析常常需要針對特定物種開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。CHANG 等［16］早期采用構(gòu)建（CA）n文庫的方法開發(fā)出10個竹?魚微衛(wèi)星標(biāo)記。文庫構(gòu)建方法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記工作量大，效率低，難以滿足現(xiàn)今遺傳評估、圖譜構(gòu)建等需要大批和多樣化的微衛(wèi)星標(biāo)記。

因此，本研究通過基于酶切位點的簡化基因組測序技術(shù)（restriction-site associated DNA sequence，RAD-seq）開發(fā)竹?魚2、3核苷酸微衛(wèi)星分子標(biāo)記并對測試群體進行多樣性分析，旨在為竹?魚種群遺傳評估提供技術(shù)基礎(chǔ)，以促進其種群資源的評估和管理。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

竹?魚樣品采集于湛江東部海域（111°30′E、20°18′N），共32尾。剪取背部肌肉樣品加入無水乙醇保存。每個樣品剪取少量肌肉組織，使用 “海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒”（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，之后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 高通量測序與引物合成

使用Hiseq2000高通量測序儀（Illumina，USA）對竹?魚基因組DNA進行RAD-seq高通量測序（測序服務(wù)由廣州基迪奧生物科技有限公司提供），經(jīng)生物信息學(xué)搜索出微衛(wèi)星位點［17］。使用Premier5.0軟件在重復(fù)單元側(cè)翼序列上選擇性設(shè)計出89條引物，主要參數(shù)為：GC含量為40% ～60%，引物長度為18～25 bp，退火溫度為45～60℃，預(yù)期擴增長度150～350 bp。送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成引物。

1.3 引物篩選與分型檢測

選取3個樣本混合成的基因組DNA為模板，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，對引物進行首輪篩選。PCR反應(yīng)體系為15μL，其中包括10×PCR Buffer 1.5 μL，2.5 mmol·L-1MgCl21.2μL，2 mmol·L-1dNTPs 2μL，正反向引物（10μmol·L-1）各0.8 μL，Taq酶（5 U· μL-1）0.15μL，DNA模版1 μL，加雙蒸水至15μL。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。瓊脂糖電泳檢測是否能擴增出穩(wěn)定且均一目的片段。之后分別選取8尾個體的基因組DNA作為模板，對瓊脂糖電泳有穩(wěn)定且均一目的條帶的引物PCR擴增后聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色檢測擴增產(chǎn)物多態(tài)性。

多態(tài)且條帶清晰的引物使用三引物法［18］，利用M13熒光接頭引物進行PCR擴增，并送華大基因公司進行毛細(xì)管電泳分型檢測。PCR反應(yīng)體系為15μL，其中包括10×PCR Buffer 1.5μL，2.5 mmol· L-1MgCl21.2μL，2 mmol· L-1dNTPs 2μL，M13正向引物（10μmol·L-1）0.2 μL，M13反向引物（10μmol·L-1）0.6μL，M13通用熒光引物（10μmol·L-1）0.5μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.15μL，DNA模版1μL，加雙蒸水至15μL。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，8個循環(huán)；72℃延伸30 min。

1.4 群體遺傳學(xué)評價

使用32尾竹?魚個體的基因組DNA為模板，對通過篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)特征進行評價。PCR反應(yīng)體系和條件、等位基因分型方法如上。使用軟件Genepop4.0［19］對每個標(biāo)記的種群遺傳學(xué)特征值進行計算，包括等位基因數(shù)（Na）、表觀雜合度（Ho）和期望雜合度（He），進行“哈迪-溫伯格平衡” 檢驗和連鎖不平衡檢測，并對P值進行Bonferroni校正。使用Cervus3.0.7［20］軟件計算多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果與微衛(wèi)星位點分析

RAD-seq高通量測序共獲得竹?魚基因組原始數(shù)據(jù)1.26 G，GC含量為45.79%，Q20為95.33%，說明測序結(jié)果質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。搜索后共獲得微衛(wèi)星序列19 920條，2～6核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點21 912個，其中2核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點最多，有12 478個，占總數(shù)的56.95%，具體見表1。說明2核苷酸重復(fù)為主要的微衛(wèi)星重復(fù)類型，其次為3核苷酸重復(fù)。

2.2 PCR引物設(shè)計和篩選

選取89條2、3核苷酸重復(fù)序列設(shè)計引物，其中2核苷酸重復(fù)為66條，3核苷酸重復(fù)為23條。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選后，共有27對引物通過篩選（表2），27對引物擴增的序列中21個位點為2核苷酸重復(fù)，重復(fù)次數(shù)為10～13次；6個位點為3核苷酸重復(fù)，重復(fù)次數(shù)為7～9次。

表1 竹?魚基因組中不同類型SSR統(tǒng)計Tab.1 Different types of SSR statistics in T.japonicus genome

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)評價

使用采集于湛江東部海域的竹?魚群體對篩選合格的微衛(wèi)星標(biāo)記進行種群遺傳學(xué)評價。如表3，所有27個標(biāo)記在測試群體中共檢測到265個等位基因，等位基因數(shù)分布范圍為3～19，表觀雜合度分布范圍為0.344～0.938，平均為0.654；期望雜合度分布范圍為0.336～0.880，平均為0.729。多態(tài)信息含量（PIC）分布范圍為0.318～0.882，平均為0.707，表明開發(fā)的微衛(wèi)星位點具有較高的雜合度。除2個標(biāo)記外，其他標(biāo)記等位基因頻率均符合“哈迪-溫伯格”平衡（HWE）。連鎖不平衡檢測表明各位點間無連鎖不平衡現(xiàn)象。

3 討論

3.1 高通量測序發(fā)掘微衛(wèi)星序列的技術(shù)優(yōu)勢

傳統(tǒng)微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)方法耗時長、花費高、技術(shù)難度大。以磁珠富集法為例，標(biāo)記開發(fā)過程中基因組DNA濃度、接頭連接效率、富集過程中的雜交溫度以及洗脫條件的控制等因素都會影響微衛(wèi)星篩選的效率［21-22］，且最終獲得的有效微衛(wèi)星序列僅幾百條［23-24］。相比較而言，高通量測序技術(shù)開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記，省略了建庫、克隆、篩選等，只需提取基因組DNA測序，利用生物信息學(xué)手段可直接獲取微衛(wèi)星序列，通常是傳統(tǒng)方法獲得微衛(wèi)星序列數(shù)目的幾百倍［25-27］，具有高效、便捷、準(zhǔn)確的特點，能夠滿足于短時間內(nèi)大批量微衛(wèi)星位點的開發(fā)需求，比如連鎖圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）定位等［28-29］。同時，傳統(tǒng)的微衛(wèi)星開發(fā)方法獲得的微衛(wèi)星重復(fù)類型基本為2核苷酸重復(fù)，而高通量測序技術(shù)的發(fā)展，更加方便了研究者獲得3、4甚至更多核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星引物［26］?？梢?，高通量測序技術(shù)較傳統(tǒng)微衛(wèi)星開發(fā)的方法更為快速、高效。

本次RAD-seq高通量測序共獲得竹?魚基因組原始數(shù)據(jù)1.26 G，GC含量45.79%，測序質(zhì)量Q20為95.33%；共獲得微衛(wèi)星序列19 920條。說明測序質(zhì)量穩(wěn)定高效，并獲得了數(shù)量龐大、類型豐富的微衛(wèi)星序列，可用于后續(xù)竹?魚微衛(wèi)星標(biāo)記大規(guī)模開發(fā)和相關(guān)遺傳學(xué)研究。

3.2 不同核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點比較

本次高通量測序結(jié)果表明在竹?魚微衛(wèi)星位點中2核苷酸重復(fù)為主要重復(fù)類型，其中AC/TG類重復(fù)數(shù)量最為豐富，占41.6%，GC/CG類重復(fù)較為少見。此結(jié)果與其他水產(chǎn)動物微衛(wèi)星位點研究結(jié)果相一致［30-32］。例如，熊良偉等［31］對中華鳑鲏（Rhodeus sinensis）微衛(wèi)星的分析中，2核苷酸占總微衛(wèi)星位點的53.59%，2核苷酸重復(fù)中AC/TG類占60.63%；GC/CG類僅占0.32%。在裸體異鰾鰍鮀（Xenophysogobio nudicorpa）中［30］，2核苷酸重復(fù)占總微衛(wèi)星位點比例高達83.15%，AC/GT類重復(fù)占49.36%，GC/CG類重復(fù)僅有4個。

盡管研究表明開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記以2核苷酸重復(fù)為主，仍有學(xué)者對3、4核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星標(biāo)記感興趣。對人類基因組的研究中發(fā)現(xiàn)，3核苷酸重復(fù)序列與遺傳疾病的發(fā)生有關(guān)，并且具有較高的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性［33］。在對水產(chǎn)動物3、4核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選中，部分學(xué)者的研究結(jié)果存在差異。例如，房祖業(yè)等［26］對大刺鰍（Mastacembelus armatus）2、3、4核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選發(fā)現(xiàn)，2核苷酸重復(fù)較3、4核苷酸重復(fù)具有更高的篩選效率和多態(tài)性；而魯翠云等［34］、譚照君等［35］和李文升等［36］的研究認(rèn)為3、4核苷酸具有更高的多態(tài)性和分型效果。本文考慮高通量測序結(jié)果中2、3核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點數(shù)已占82%，因此，僅選取2、3核苷酸重復(fù)位點進行篩選，結(jié)果顯示，2、3核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點的多態(tài)性差異并不明顯。

表2 27對竹?魚微衛(wèi)星引物信息Tab.2 Information of 27 pairs of primers in T.japonicus

表3 竹?魚微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)特征Tab.3 Characteristics of microsatellite loci in T.japonicus

3.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)特征

ELLEGREN［37］提出真核生物微衛(wèi)星位點重復(fù)大部分在30次以下，2核苷酸重復(fù)以15～19次為主。基于WEBER［38］的研究結(jié)果，重復(fù)次數(shù)高的微衛(wèi)星在種群中表現(xiàn)出的多態(tài)性較高。龔小玲等［39］對澳洲鰻鱺（Anguilla australis）進行標(biāo)記開發(fā)時發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)過高會影響PCR效果，選擇居中的重復(fù)次數(shù)為宜。因此，本研究選擇重復(fù)次數(shù)較為適中的位點，分別為2核苷酸重復(fù)10～15次、3核苷酸重復(fù)7～9次。

群體雜合度的高低反映了群體在多個基因座上的遺傳變異及群體遺傳多樣性豐富度［36］。本研究中竹?魚群體的平均表觀雜合度為0.654，平均期望雜合度為0.729，說明該群體的遺傳多樣性較高。平均表觀雜合度和期望雜合度存在差異，說明存在雜合子缺失或者純合子過剩的情況。多態(tài)信息含量（PIC）也是衡量群體遺傳多樣性的重要指數(shù)，研究者BOTSTEIN等［40］認(rèn)為當(dāng)基因標(biāo)記PIC＞0.5時，為高度多態(tài)位點；當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態(tài)位點；當(dāng)PIC＜0.25時，為低度多態(tài)性位點，通常不作為遺傳多樣性分析。本文中竹?魚位點有5個為中度多態(tài)位點，其他均為高度多態(tài)位點。表明開發(fā)所得的竹?魚微衛(wèi)星標(biāo)記在該群體中具有較好的遺傳穩(wěn)定性和豐富的遺傳多樣性。

在所有27個位點中有2個位點偏離了 “哈迪-溫伯格”平衡（HWE），近親雜交、無效等位基因、種群退化和自然選擇等因素皆可能導(dǎo)致微衛(wèi)星位點偏離HWE［25］。另外，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，樣本量小于25時，對平均等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)及表觀雜合度具有較明顯的影響［41］。本研究中，有效樣本量≥28，表明位點的多樣性參數(shù)結(jié)果較為可靠。