腸道菌群和膽結(jié)石的研究進展

張乾，左磊，張小冬，溫波，任建軍

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

0 引言

膽結(jié)石病是全球范圍的常見病、多發(fā)病。在歐洲和其他發(fā)達(dá)國家[1]，膽結(jié)石的發(fā)病率可高達(dá)20%，這也是醫(yī)療成本增加的主要因素。而在我國膽結(jié)石的發(fā)病率約為4.2% ～12.1%[2]。近幾年來隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展、人們生活方式的改變以及人口老齡化的發(fā)展，膽結(jié)石的患病率處于逐漸上升的趨勢。膽結(jié)石疾病是由遺傳、環(huán)境、局部、全身和代謝異常等復(fù)雜因素相互作用引起的[3]。由于膽結(jié)石形成因素多，所以其病理生理較為復(fù)雜，主要有以下幾點[4]：致石基因及遺傳因素的不同；膽汁膽固醇分泌不平衡；膽固醇成核異常/結(jié)晶；膽囊運動受損；膽囊腔內(nèi)高分泌和粘蛋白凝膠積聚；免疫介導(dǎo)的膽囊炎癥；腸道因素包括膽固醇吸收、腸道運動遲緩和腸道微生物群改變。隨著腸道測序技術(shù)的發(fā)展以及對腸道菌群功能的不斷發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究表明腸道菌群的動態(tài)平衡對人體的健康有著非常重要的意義。近年來相關(guān)研究表明，膽石癥患者腸道微生物群的失調(diào)可能與膽結(jié)石的形成密切相關(guān)[4]，但腸道菌群影響膽結(jié)石形成的機制仍不清楚。因此，本文就腸道菌群與膽結(jié)石的相關(guān)性及腸道菌群影響膽結(jié)石形成的可能機制進行闡述，為腸道菌群在未來膽結(jié)石的研究上提供一定的參考依據(jù)。

1 腸道菌群的組成及功能

腸道菌群被稱為“我們遺忘的器官”，其擁有多達(dá)1000個細(xì)菌物種，編碼約500萬個基因，執(zhí)行宿主生理和生存所需的17種功能[5]。大多數(shù)成人微生物群生活在腸道中，僅在人類的結(jié)腸中微生物的密度就超過了1011 cell/g，約1-2kg[6]。腸道菌群包括需氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌，以專性厭氧菌或兼性厭氧菌為主。其中擬桿菌門和厚壁菌門的數(shù)量占90%以上[7]，其余有變形菌門、疣微菌門、放線菌門、梭桿菌門、雙歧桿菌、藍(lán)藻細(xì)菌等[8]。人體健康與腸道菌群的組成和功能有著千絲萬縷的聯(lián)系，腸道菌群像是我們的一個器官，提供了干預(yù)性治療的新路徑。腸道菌群參與物質(zhì)和能量的代謝，促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟，形成黏膜屏障，并保護宿主免受病原體攻擊[9-13]。一般情況下，腸道菌群按一定比例組合，各菌群間互相制約、互相依存，在質(zhì)和量上形成一種動態(tài)平衡。但在某些情況下這種平衡被打破，即腸道菌群失調(diào)，可導(dǎo)致人類疾病的發(fā)生。腸道菌群的失衡與克羅恩病、腸炎、肥胖、糖尿病以及心血管疾病等代謝性疾病有關(guān)[14-18]。因此，腸道菌群對人體的健康有著非常重要的意義。

2 腸道菌群與膽結(jié)石的相關(guān)性

基于解剖學(xué)的角度來說，認(rèn)為膽囊通過膽囊管—膽總管—十二指腸，與胃腸道是一個整體，同屬于消化道，腸道細(xì)菌可逆行進入膽道，影響膽道細(xì)菌，進而影響膽結(jié)石的形成。早在20世紀(jì)60年代就有學(xué)者提出細(xì)菌在膽結(jié)石發(fā)病機制中的重要作用[19]。隨著腸道菌群測序技術(shù)的進步，越來越多的研究表明腸道菌群和膽結(jié)石存在著明顯的相關(guān)性。吳韜等人[20]利用新興的高通量的二代測序的方法(焦磷酸測序)，通過大規(guī)模的分析細(xì)菌的16S rRNA基因，第一次揭示了膽囊結(jié)石患者存在明顯的腸道菌群失調(diào)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常人和膽囊結(jié)石患者腸道菌群存在差異，膽結(jié)石患者的腸道細(xì)菌中變形菌門(Proteobacteria)較正常人顯著增高；三個腸道細(xì)菌糞桿菌屬(Faecalibacterium)，毛螺菌屬(Lachnospira)，羅氏菌屬(Roseburia)較正常人顯著減少。Wang等人[21]通過對C57BL/6小鼠飼喂成石飼料的研究表明，膽固醇成石小鼠腸道菌群豐富度和多樣性均降低，主要表現(xiàn)為厚壁菌(Firmicutes)的低表達(dá)，同時厚壁菌門(Firmicutes)/擬桿菌門(Bacteroidetes)的比例降低。另有研究發(fā)現(xiàn)與健康人群相比膽囊結(jié)石患者糞便中瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和顫螺旋菌屬(Oscillospira)種類增加，但細(xì)菌多樣性顯著降低[22]。馬俊[23]研究表明，無癥狀膽囊結(jié)石患者較健康人將比，乳酸菌、普拉梭菌、毛螺科菌、羅氏菌屬明顯降低，變形菌門的含量顯著升高。鄧太平等人[24]研究表明，膽結(jié)石組的腸桿菌、腸球菌、鏈球菌的菌落數(shù)明顯高于健康組，雙歧桿菌和乳酸桿菌的菌落數(shù)與健康組相比顯著下降。杜國濤等人[25]近期研究發(fā)現(xiàn)，膽結(jié)石患者與將康人相比。雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量顯著減少，而大腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌和酵母菌則相反。這些均提示腸道菌群的失衡可能對膽結(jié)石的形成具有重要的意義，但是腸道菌群影響膽囊結(jié)石形成的機制目前尚不明確。

3 腸道菌群參與膽結(jié)石形成的可能機制

3.1 腸道菌群可能通過影響膽汁酸代謝進而影響膽結(jié)石的形成

膽汁酸是膽固醇的主要代謝終產(chǎn)物，具有表面活性作用，在脂質(zhì)的吸收和利用過程中起重要作用。膽汁酸是由膽固醇通過至少14種肝臟酶的協(xié)同作用合成的[28]。膽汁酸有兩條合成途徑[27]：經(jīng)典途徑和替代途徑。經(jīng)典途徑是初級膽汁酸合成的主要途徑，占人類初級膽汁酸合成總量的90%，因該途徑的中間產(chǎn)物為中性類固醇，故也稱中性途徑。膽固醇7α羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)是經(jīng)典途徑中的限速酶，甾醇12α羥化酶(cholesterol 12α-hydroxylase，CYP8B1)、甾 醇27α羥 化 酶(cholesterol 27α-hydroxylase，CYP27A1)也參與催化這一途徑，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)將膽固醇轉(zhuǎn)換為鵝去氧膽酸(CDCA)和膽酸(CA)。替代途徑是合成初級膽汁酸的另一途徑，因該途徑產(chǎn)生酸性類固醇故也稱酸性途徑，該途徑由CYP27A1和氧固醇7α羥化酶(oxysterol 7α-hydroxylase，CYP7B1)催化，主要產(chǎn)生鵝去氧膽酸，占人類初級膽汁酸合成總量約10%。在肝細(xì)胞內(nèi)初級膽汁酸分別與甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合形成具有生理作用的結(jié)合膽汁酸，后通過肝細(xì)胞膽小管側(cè)膜上的膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP)泵入膽小管，進入膽囊，然后進入小腸。結(jié)合膽汁酸則在回腸頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白(apical sodium dependent bile acid transporter，ASBT)重吸收后，與回腸膽汁酸結(jié)合蛋白(ileal bile acid-binding protein，IBABP)結(jié)合，經(jīng)基底側(cè)膜有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體 (organic solute transporter，OST)α/β重吸收進入門靜脈血流。門靜脈中的膽汁酸最后被肝細(xì)胞通過鈉離子依賴性?；悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(Na+-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)介導(dǎo)結(jié)合膽汁酸轉(zhuǎn)運、有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽1(organicanion transporting polypeptide1，OATP1)介導(dǎo)游離膽汁酸轉(zhuǎn)運，兩者共同介導(dǎo)循環(huán)膽汁酸重新被攝入肝細(xì)胞，上述過程稱為膽汁酸的腸肝循環(huán)。膽汁酸總量的95%經(jīng)腸肝循環(huán)重新回到膽汁酸池，僅有5%左右經(jīng)腸道排出體外。膽汁酸動態(tài)平衡受到膽汁酸對CYP7A1活性和表達(dá)的負(fù)反饋作用以及通過法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)和成纖維細(xì)胞生長因子19(fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19)的信號傳導(dǎo)的調(diào)控。

腸道菌群在膽汁酸的修飾和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的作用。結(jié)合膽汁酸在腸道中通過膽鹽水解酶(bile salt hydrolase，BSH)生成游離膽汁酸。目前研究表明，腸道中存在著廣泛的可以產(chǎn)生BSH的細(xì)菌[28]。腸道中的游離膽汁酸在7α脫羥基菌的作用下生成具有疏水性的次級膽酸石膽酸(DCA)和脫氧膽酸(LCA)?，F(xiàn)研究表明，具有7α脫羥基活性的菌主要有僅Clostridium屬以及Lachnospiraceae和Peptostreptococcaceae[29]。Sayin等[30]研究表明，與無菌小鼠相比，正常小鼠的膽汁酸池發(fā)生了明顯的變化，小鼠回腸上皮細(xì)胞表面的FXR表達(dá)水平上調(diào)，F(xiàn)XR進一步誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長因子15(fibroblast growth factor 15，F(xiàn)GF15，人體中為FGF19)的表達(dá)，進而抑制CYP7A1、CYP27A1的活性，從而抑制膽汁酸的合成。與此同時Sayin 等人還發(fā)現(xiàn)牛磺-β鼠膽酸(taurobeta-muricholic Acid，T-βMCA)是FXR的天然受體拮抗劑，能夠減輕對CYP7A1的抑制作用，從而促進膽汁酸的合成。Out等人[31]試驗表明，腸道細(xì)菌能夠通過刺激腸道上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子GATA4的表達(dá)，抑制 ABST的表達(dá)，從而導(dǎo)致回腸末端膽汁酸的重吸收減少。相反膽汁酸也會影響腸道菌群的組成，小鼠口服1.25～5.00 mmol/kg 體重的膽汁酸，其腸道菌群中厚壁菌屬的比例由54%升高至94%～98%，而其中擬桿菌和放線菌的比例則顯著降低[32,33]。Ava等人[34]研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸受體FXR 基因缺陷型小鼠的腸道厚壁菌屬數(shù)量顯著上升，而擬桿菌屬數(shù)量顯著下降，這是由于FXR 受體缺陷時膽汁酸的分泌增加導(dǎo)致的，這提示膽汁酸可通過FXR 信號通路影響腸道菌群組成。Degirolamo 等[35]用乳酸菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌組成的混合益生菌飼喂小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該混合益生菌能夠顯著增加腸道中厚壁菌屬和放線菌屬的數(shù)量，降低擬桿菌屬和變形桿菌屬的數(shù)量，增加糞便中膽汁酸的排出量，降低腸道FGF15的表達(dá)水平，提高CYP7A1 和 CYP8B1的活性，從而增加肝臟膽汁酸的產(chǎn)量。早在1996年Berr等人[36]就研究表明，7a-脫羥基腸道細(xì)菌可增強膽結(jié)石患者DCA的輸入量和膽汁膽固醇飽和度。有趣的是近期Wang 等人[37]研究表明，膽結(jié)石患者與健康人群相比，初級膽汁酸和次級膽汁酸顯著增高，且7a-脫羥基腸道細(xì)菌顯著增加。這些研究強有力的證明腸道菌群和膽汁酸代謝存在著明顯的相關(guān)性，且膽汁酸的的代謝在膽結(jié)石的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，因此腸道菌群可能通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝進而影響膽結(jié)石的形成。

3.2 腸道菌群可能通過影響腸道屏障進而影響膽結(jié)石的形成

腸道既是人和動物對營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和代謝的主要場所，也是保障機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的先天性屏障，被譽為“機體的第二大腦”。腸道屏障是一種半透性結(jié)構(gòu)，允許吸收必須的營養(yǎng)素和免疫感應(yīng)，同時限制致病分子和細(xì)菌，維護機體腸道健康。在正常情況下，腸道粘膜屏障由機械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障和免疫屏障組成。腸道微生物的構(gòu)成的微生物屏障是腸道屏障的重要組成部分，通過微生物競爭黏附等機制抑制有害病原菌在體內(nèi)定值與增殖，保護機體免受外界病原體和毒素的入侵[38]。研究表明，腸道菌群失調(diào)可能破壞腸粘膜屏障，并可能增加對某些疾病的易感性[39]。腸粘膜屏障的破壞會使脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)更容易的通過腸道屏障進入肝臟。正常的情況下少量LPS通過腸道屏障進入肝臟，通過激活肝臟的免疫系統(tǒng)將其清除。然而，在腸道粘膜屏障功能破壞的情況下，腸肝循環(huán)平衡受損，腸道易位細(xì)菌及腸源性LPS增加，后者可通過模式識別受體如Toll樣受體4(tolllike receptor-4，TLR4)激活肝臟免疫細(xì)胞，最終誘導(dǎo)炎癥和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而幫助清除入侵的病原體[40,41]。王學(xué)軍[42]等人通過對膽結(jié)石組和對照組的膽汁酸分析，發(fā)現(xiàn)膽結(jié)石組中LPS的含量顯著高于對照組。與此相契合的是，白順滟等人[43]發(fā)現(xiàn)膽色素結(jié)石患者腸道粘膜通透性較健健康組相比存在明顯的降低。因此我們猜測腸道菌群失衡會導(dǎo)致腸道粘膜的通透性，影響LPS的易位，并激活肝臟的免疫，其分泌的炎性細(xì)胞因子通過旁分泌方式，改變了肝細(xì)胞的正常代謝，并有可能通過信號傳遞系統(tǒng)，改變細(xì)胞內(nèi)某些酶的活性和表達(dá)，從而在膽石的形成中發(fā)揮重要的作用。

3.3 腸道菌群可能通過影響免疫進而影響膽結(jié)石的形成

腸道菌群在宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟中起著至關(guān)重要的作用。這一點在無菌小鼠身上得到了最清晰的證明，這些小鼠從出生起就被培養(yǎng)成完全沒有任何微生物的動物。與常規(guī)飼養(yǎng)的小鼠相比，這些動物表現(xiàn)出嚴(yán)重不發(fā)達(dá)的腸道免疫系統(tǒng)[44]。腸道菌群可調(diào)控宿主免疫，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、TH17、TH1等免疫細(xì)胞[45]。腸道菌群除自身參與調(diào)節(jié)免疫外其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)也參與免疫的調(diào)節(jié)。SCFA是碳鏈1-6的有機羧酸，是腸道菌群發(fā)酵碳水化合物的主要終產(chǎn)物，其主要包括乙酸、丙酸和丁酸[46]。腸道菌群產(chǎn)生的SCFA在保護腸道粘膜屏障[47]和免疫中發(fā)揮重要的作用。研究表明，SCFA通過減少巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突細(xì)胞的募集和遷移，并抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化，以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥[48]。有趣的是越來越多的研究表明，膽結(jié)石和免疫存在著明顯的相關(guān)性。免疫系統(tǒng)在膽固醇結(jié)石發(fā)病機制中的作用的證據(jù)來自Maurer等人[49]的研究，其發(fā)現(xiàn)喪失T或B細(xì)胞功能的Rag缺陷小鼠與野生型小鼠相比其成石率顯著降低，將脾細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞向Rag缺陷小鼠移植，發(fā)現(xiàn)其結(jié)石形成率明顯增高，而B細(xì)胞的移植卻沒有結(jié)石形成率的明顯變化，該研究證明T細(xì)胞免疫在促進膽固醇膽結(jié)石形成方面發(fā)揮了深遠(yuǎn)的作用；此外，還證明了T細(xì)胞和固體膽固醇晶體在膽囊中誘導(dǎo)了強力的Th1介導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)。李平等人[50]研究發(fā)現(xiàn)，急性和未發(fā)作的膽結(jié)石患者均存在T淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào)，急性發(fā)作時，CD3+、CD8+T細(xì)胞升高，使免疫應(yīng)答增強。有趣的是，近期Mu?oz等人[51]研究表明，膽結(jié)石中含有中性粒細(xì)胞的胞外DNA及其產(chǎn)生的彈性蛋白酶，中性粒細(xì)胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(neutrophil extracellular traps，NETs)對膽結(jié)石的形成是必須的，人源和鼠源的膽結(jié)石中均存在NETs，并且膽結(jié)石的形成和生長需要先天免疫系統(tǒng)的活化。這些研究表明腸道菌群可能通過調(diào)節(jié)免疫進而影響膽結(jié)石的形成。

4 結(jié)語

綜上所述，腸道菌群的改變與膽結(jié)石的形成密切相關(guān)，腸道菌群可能通過影響膽汁酸代謝、腸粘膜屏障和調(diào)節(jié)免疫等機制，參與膽結(jié)石的發(fā)生和發(fā)展，但這些可能的機制需要我們進一步研究闡明。由于膽結(jié)石作為一類代謝性疾病，因此，腸道菌群最可能通過改變?nèi)梭w代謝或其自身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進而影響膽結(jié)石的形成，這需要我們對膽結(jié)石患者的代謝產(chǎn)物進行檢測并與腸道菌群進行關(guān)聯(lián)。希望從腸道菌群靶向治療的角度為膽結(jié)石提供新的防治策略。