缺氧誘導因子-1改善急性脊髓損傷后神經功能恢復研究進展

張安瑞，楊彥玲，劉敏麗

(延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000)

0 引言

近年來，脊髓損傷因嚴重危害人類健康而受到越來越多的關注。盡管其發(fā)病率較常見疾病低[1]，但由于其無有效的根治方法及并發(fā)癥、后遺癥嚴重，致殘率和致死率高，成為臨床實踐中一大難題[2]。因此，為該類患者尋找有效的治療方法迫在眉睫。目前，臨床醫(yī)師主要通過手術方式解除脊髓在受損后繼續(xù)受到壓迫及給與相應藥物以緩解癥狀治療該病，但中樞神經系統(tǒng)神經元在受損后不能再生，且脊髓損傷發(fā)病機制復雜，多種致病因子參與其中，使臨床治療收效甚微[3]。目前，隨著神經干細胞技術趨于成熟，該技術也成為了治療中樞神經系統(tǒng)損傷的熱點[4]。盡管如此，我們對于脊髓損傷的發(fā)病機制仍不完全清楚。脊髓損傷分二類，即原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷?，F(xiàn)有研究表明，繼發(fā)性脊髓損傷是多種因素共同作用的結果，如水腫、缺血缺氧、炎癥反應、自噬和細胞凋亡等。其中，缺氧誘導產生的HIF-1是影響脊髓損傷患者預后及病情發(fā)展的重要因素[5]。在脊髓損傷中，HIF-1通過激活一系列下游因子改變受損細胞的代謝、對外界不良因素的耐受狀態(tài)等發(fā)揮保護作用，以促進脊髓損傷后的功能恢復及預后[6]。目前，也有學者發(fā)現(xiàn)HIF-1可以激活5-羥色胺促進軸突再生[7]。本文將對HIF-1在脊髓損傷中的調節(jié)功能進行綜述。

1 脊髓損傷的分類

1.1 原發(fā)性損傷

原發(fā)性損傷的形成是脊柱在機械性外力、撞擊或墜落作用下發(fā)生斷裂或移位，脊椎碎片使位置較固定的脊髓受到直接創(chuàng)傷或擠壓，導致脊髓局部或多發(fā)性結構損傷[8]，引起脊髓功能障礙。目前的臨床治療手段還不能對該過程的損傷進行有效干預。

1.2 繼發(fā)性損傷

繼發(fā)性損傷是原發(fā)性損傷后發(fā)生的由多種因素介導的神經細胞進行性病理改變。主要影響因素如下：

1.2.1 水腫

水腫包括血管源性、細胞毒性和二者兼有的混合性三種。血管源性水腫是由于血管內皮細胞受損、血脊髓屏障遭到破壞，致使液體從血管內流到血管外進入組織間隙引起水腫，進而壓迫脊髓加重脊髓損傷[9]。當水在各種誘因下大量積聚于神經元細胞和星形膠質細胞內，是細胞毒性水腫產生的主要原因，細胞水腫會破壞細胞的微環(huán)境[10]，并且可以進一步加重血脊髓屏障的破壞。有研究表明，脊髓損傷后，星形膠質細胞的水通道蛋白4可以介導水分進入細胞參與細胞毒性水腫過程[11]。血管源性水腫和細胞毒性水腫相互影響、相互作用，最終形成水腫惡性循環(huán)，對機體造成嚴重危害。水腫與脊髓損傷的預后明顯相關。有研究表明[12]，脊髓水腫越重，患者預后越差。因此，對于水腫的有效干預成為我們治療脊髓損傷亟待解決的關鍵。

1.2.2 缺血、出血、缺氧脊髓受損后，缺血及出血在疾病的進展中發(fā)揮了重要作用。缺血、出血使受損部位的脊髓灰質及白質發(fā)生明顯低灌注，嚴重影響細胞能量代謝障礙[13]，同時缺血會促進血栓形成，血栓形成在微小血管內多見，此時供血大動脈血栓形成可能并不顯著[14]，血栓形成后嚴重影響了受損部位及血管遠端部位的血流灌注，繼而引發(fā)了水腫、炎癥等不良反應。Anthony, B等發(fā)現(xiàn)[15]，脊髓損傷后，核磁共振檢查顯示受損部位脊髓出血幾乎總是與水腫同時出現(xiàn)。血管損害也使得脊髓更容易受到炎癥細胞、細胞因子、血管活性肽等因素的侵襲[16]，進一步加重了脊髓損傷。缺血、出血也會引起相應部位發(fā)生缺氧改變，導致缺氧相關病理事件發(fā)生，對脊髓功能恢復產生不利影響。

1.2.3 炎癥炎癥在繼發(fā)性損傷中發(fā)揮了至關重要的作用。在繼發(fā)性損傷中，小膠質細胞、內皮細胞和室管膜細胞內的多數促炎性細胞毒性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin，IL-1β)和白細胞介素-6(Interleukin，IL-6)等釋放增多，是創(chuàng)傷后炎癥反應的關鍵介質[17]。這些炎癥介質的釋放量與脊髓損傷的嚴重程度有關。其中，對于TNF-α的研究發(fā)現(xiàn)，其在損傷急性期內對機體有害，但在慢性期內卻對機體有利[14]，說明TNF-α的表達具有時序性，這也在治療炎癥方面提供了有力證據。TNF-α主要通過其受體超家族發(fā)揮促炎癥作用，其受體包括腫瘤壞死因子受體1和受體2[18, 19]，現(xiàn)在普遍認為TNF的促炎癥效應主要是通過腫瘤壞死因子受體1實現(xiàn)的，而腫瘤壞死因子受體2起輔助增強炎癥的作用[20]。TNF-α在脊髓損傷中不僅發(fā)揮促炎作用，而且與神經損傷后引起相應部位的疼痛密切相關[21]，此時，TNF-α受體主要通過激活電壓門控鈉通道使得疼痛發(fā)生[22]。除了經典的炎癥反應因子外，有研究者發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白E4是控制炎癥介質釋放的重要蛋白[23]，其含量升高后，炎癥介質TNF-α和白細胞介素-6也明顯升高，促進炎癥反應的發(fā)生[24]。盡管有促炎因子大量釋放，但有些因子對炎癥反應具有明顯的抑制作用，如白細胞介素-10[25]。白細胞介素-10主要由M2型巨噬細胞分泌，它通過下調促炎因子、提供營養(yǎng)支持、促進功能恢復等抑制炎癥反應，但不能忽視的是，白細胞介素-10不能通過血脊髓屏障且在損傷部位容易被清除，這種特性使得其抑炎作用受到了明顯的限制[26]。促炎因子與抑炎因子共同參與機體內的炎癥級聯(lián)反應，影響脊髓損傷患者的預后。

1.2.4 自噬也在脊髓損傷中發(fā)揮了重要的作用[27]。脊髓損傷后，自噬過程被激活，通過將受損和衰老細胞的細胞質成分在自噬體中隔離和消化，以清除細胞碎片，起到穩(wěn)定微環(huán)境的作用[28,29]。與自噬相關的重要標記物有2個，即LC3和Beclin1。因為LC3可以調節(jié)自噬體的發(fā)育，所以廣泛用作自噬體標記物。Beclin1通過與B淋巴細胞瘤-2基因相互作用的蛋白結合在促進自噬中起著重要作用。自噬主要通過mTOR信號通路或增強Beclin-1的表達來抑制脊髓機械性損傷神經元的凋亡[30]，這說明雖然自噬可以吞噬降解破壞后的細胞，但它同時保護神經元不被降解，并抑制自噬晚期神經退行性變[31,32]。所以，在應激情況下，自噬對于促進細胞存活至關重要[33]。自噬通過抑制缺氧時細胞凋亡，促進細胞增殖和分化，從而促進內皮祖細胞的存活，內皮祖細胞的正常增殖和分化對缺血部位血管生成至關重要。另外自噬可與機體的免疫相關信號通路相互作用調節(jié)炎癥反應介質的分泌以控制機體內的炎癥反應[34,35]，并且部分調節(jié)炎癥反應的介質如I-κBα直接通過自噬溶酶體途徑進行降解[36]，這說明自噬和炎癥反應間具有密切聯(lián)系，但自噬影響炎癥的具體機制目前尚不清楚。盡管自噬的主要作用是保護細胞，但自噬過度會對細胞產生不利影響[37,38]。

除了以上幾大因素外，繼發(fā)性損傷中還有電解質紊亂、自由基形成、細胞凋亡等重要因素參與其中[39,40]，這些因子相互作用，共同導致脊髓嚴重的病變。脊髓損傷發(fā)生后，如果不給予積極治療，高血壓、糖尿病、肥胖和骨質疏松[41]等并發(fā)癥發(fā)生率增高，患者生活質量明顯下降。

2 缺氧及其影響

缺氧不僅是血管疾病的結果，而且可以反作用于血管促成多種血管病理狀態(tài)的形成，包括動脈粥樣硬化、主動脈瘤、肺動脈狹窄和慢性靜脈疾病[42]等。有研究發(fā)現(xiàn)缺氧在脊髓損傷部位是存在的，并且呈不均勻分布，這可能是由脊髓損傷后血管破裂導致受損部位缺血、缺氧發(fā)生[43]。近幾年，有結果表明，吸入低濃度的氧氣成為一種治療脊髓損傷安全和行之有效的方式，它可以調節(jié)殘存神經元神經可塑性促進脊髓損傷后運動功能恢復，但是，如果對氧氣濃度和吸入低氧的時間把控不佳的話，將會導致機體多系統(tǒng)嚴重的病理損害[44,45]。

2.1 HIF-1

低氧調節(jié)脊髓損傷后神經可塑性過程中產生的最重要的因子是HIF-1，其表達量在缺氧后明顯升高。HIF-1是一種重要的轉錄因子，在眾多的轉錄因子超家族中對維持細胞氧穩(wěn)態(tài)具有重要作用。HIF-1是由受氧濃度變化調節(jié)表達的1α和在機體內穩(wěn)定表達的1β組成的二聚體[46]，前者是發(fā)揮功能的主要部分，后者起結構支持作用。HIFα有三種亞單位，即HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α。HIF-1α在所有有核細胞中均有表達，HIF-2α的表達局限于特定的細胞類型，包括血管內皮細胞、腎間質細胞、肝細胞、心肌細胞和星形膠質細胞[47]。已經有研究表明，在受損的運動神經元中，HIF-1α的表達明顯增多，而HIF-2α的表達量仍在正常未受損的范圍內[48]，這也與它們的組織及細胞表達差異相吻合。盡管二者的表達有組織/細胞特異性，但可以肯定的是二者均是受氧濃度調節(jié)的轉錄因子。對于HIF-3α的認識還不十分清楚，目前已知的是HIF-3α的基因表達產物主要作為HIF-1α和HIF-2α活性的負調節(jié)因子和靶基因的轉錄激活劑，可以減弱機體適應缺氧的能力[49,50]。

2.2 HIF-1α在不同氧濃度下的改變

HIF-1α的穩(wěn)定性和轉錄活性均會受到氧依賴性羥基的負性調節(jié)。在常氧條件下，HIF-1α亞基被活化的脯氨酸羥化酶羥基化[51]。HIF-1α脯氨酸殘基的羥基化對于HIF-1α與腫瘤抑制因子(VonHipple-lindauDisease，vHL)的結合至關重要，因為vHL與elongin C相互作用后會促進泛素化酶復合體的形成，進而促進HIF-1α的泛素化改變和蛋白酶體降解[52]。pVHL是E3泛素連接酶的底物識別亞單位，當有氧存在時，可以引導HIF-1α亞單位進行蛋白酶體降解[53]。

而在缺氧條件下，HIF-1α的脯氨酸殘基不被羥基化，不與pVHL結合，而與HIF-1β結合[52]，形成二聚體后轉移向細胞核內與機體內適應缺氧有關基因的缺氧反應元件結合，使血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial cell growth factor，VEGF)和血小板源性生長因子、葡萄糖轉運蛋白等表達增多進而促進血管生成和無氧代謝[54]。pVHL與HIF-1α的相互作用是氧依賴的，因為HIF-1α必須由氧敏感的脯氨酰羥化酶家族成員在兩個保守的脯氨酰殘基上進行脯氨酰羥基化，才能與pVHL結合[55]。有證據表明，當脯氨酸羥化酶的表達被抑制時，HIF-1α的表達量會明顯增多[56]。二甲基草甘氨酸是脯氨酸羥化酶的有效抑制劑，當給予脊髓損傷患者一定劑量的二甲基草甘氨酸后，其通過抑制脯氨酸羥化酶表達，激活HIF-1α表達，產生一系列下游因子以抵抗氧化應激、調節(jié)細胞自噬、抗凋亡等改善脊髓損傷[57]。

HIF-1α除了受到脯氨酰羥基化作用外，還通過一種重要的缺氧誘導因子抑制性因子而使天冬酰胺殘基羥基化[58]。在缺氧條件下，天冬酰胺基羥基化通過阻斷反式激活結構域與輔活化因子p300 的相互作用，從而負向調節(jié)HIF-1α的反式激活活性，此時，脯氨酸羥化酶的氧依賴性羥基化活性被抑制[59]。這使HIF-1α免于降解破壞，在細胞核中與HIF-1β聚合形成二聚體，并與其靶基因的缺氧反應元件結合，激活其下游因子發(fā)揮作用[60]。

2.3 HIF-1的靶基因產物

2.3.1 VEGF血管內皮細胞生長因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor, VEGF)是一種與血管生成密切相關的蛋白質，它與VEGFR結合發(fā)揮作用，其受體主要包括VEGFR1和VEGFR2VEGFR3三種[61,62]。VEGFR-1和VEGFR-2主要在血管內皮細胞中表達。VEGFR-3在血管內皮和淋巴管內皮細胞上表達。VEGF可以促進損傷部位血管生成和神經再生以改善局部損傷缺血微環(huán)境而作為治療脊髓損傷的重要基因，Yun,Y.等發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，VEGF表達量比對照組明顯增多[63]，這成為該基因治療脊髓損傷的基礎。并且VEGF可以保護運動神經元免于自由基、缺氧/低血糖、谷氨酸興奮性毒性[64,65]及細胞凋亡等因素帶來的不利影響。VEGF在起保護作用時部分是通過激活自噬和抑制炎癥反應實現(xiàn)的[66]，有研究發(fā)現(xiàn)，給脊髓損傷實驗組小鼠給予外源性VEGF后，與自噬相關的指標—Beclin1 and LC3B—明顯升高，而與炎癥反應相關的因子，如IL-1β、 TNF-α and IL-10[67]則明顯下降。所以，在缺氧時HIF-1α通過激活VEGF促進損傷部位血管生成及減少軸突相關蛋白降解且促進軸突再生[68]以發(fā)揮其保護作用。

2.3.2 GLUT葡萄糖是機體能量供應的主要來源物質，中樞神經系統(tǒng)對能量缺乏的耐受力最差，因為其不能進行無氧糖酵解，其能量供應主要來自葡萄糖有氧氧化，所以在缺氧的情況下，機體內葡萄糖進行糖酵解，進入三羧酸循環(huán)的葡萄糖減少，導致體內各種代謝尤其是中樞神經系統(tǒng)代謝紊亂，繼而發(fā)生明顯的功能紊亂，所以糾正缺氧時的糖代謝也是治療脊髓損傷患者的重要步驟。能量缺乏會導致神經元凋亡比率增加，這可能與抗凋亡的元素在能量缺乏時功能障礙有關[69]。所以，對于能量代謝的研究就顯得尤為重要。葡萄糖轉運體在能量產生方面發(fā)揮至關重要的作用，在哺乳動物中，目前發(fā)現(xiàn)的葡萄糖轉運體亞基共有14種，其中，GLUT1和GLUT3是中樞神經系統(tǒng)能量代謝中最重要的2種[70]，前者的功能主要使葡萄糖通過血腦屏障的內皮細胞進入腦組織[71]，而后者主要使葡萄糖通過神經元細胞膜[72]，二者相輔相成，共同維持神經系統(tǒng)內能量代謝的穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)，當葡萄糖轉運體的功能被抑制時，神經系統(tǒng)則表現(xiàn)出明顯的功能紊亂和神經元異常死亡[73]，當機體受到創(chuàng)傷時，GLUT1和GLUT3表達明顯增多，這說明機體內存在調節(jié)GLUT的因子。在缺氧情況下，HIF-1增多，繼之GLUT3表達量明顯升高，說明GLUT1和GLUT3可能是HIF-1的下游因子[69]。目前可以肯定的是HIF-1可以通過PI3K/Akt/mTOR途徑誘導GLUT表達增多[74]，以滿足中樞神經系統(tǒng)需要的能量供應及維持神經元結構和功能的相對完整，這對于改善脊髓損傷患者的能量代謝至關重要。

2.3.3 EPO促紅細胞生成素(Erythropoietin, EPO)是紅細胞生成所必需的，它在胚胎期和胎兒期主要在肝臟生成，成年后主要在腎臟產生[75]。EPO主要受到局部組織氧合狀況的調節(jié)，當組織氧合差時，HIF刺激EPO生成增多，釋放入血，血液循環(huán)中的EPO隨后與骨髓紅系祖細胞上的EPO受體結合，促進紅細胞生成增多，組織氧合得到改善；反之，則使紅細胞生成減少，整個調節(jié)過程是經典的負反饋回路調節(jié)[76]。但如果EPO調節(jié)的紅細胞穩(wěn)態(tài)不能維持在生理水平，則可能會導致相應疾病的發(fā)生，如貧血或紅細胞增多癥，也會給機體帶來不利影響[77]。EPO的調節(jié)幾乎完全依賴HIF在mRNA水平上的調節(jié)，與HIF的含量密切相關[78]。EPOEPOR信號轉導不僅具有促進紅細胞生成的作用，而且與細胞保護作用相關[79];1)抗凋亡：其抗凋亡是通過抑制神經元中活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3實現(xiàn)的[80]，有活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3是一種半胱氨酸蛋白酶,它在參與凋亡的級聯(lián)反應中起重要作用[81]；2)抗氧化：EPO還可以通過激活活性氧中和酶(包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等)來增強抗氧化能力[82]；3)抗炎癥反應：其抗炎癥反應主要通過降低環(huán)氧合酶2和誘導型一氧化氮合酶生成起作用，另外其抑制小膠質細胞活化及抑制自噬激活也具有部分抗炎癥反應作用[83,84]。

VEGF、GLUT和EPO在受到HIF-1的激活后分別在促進血管生成改善血運、改善糖代謝和促進氧合三個方面起到了保護脊髓的作用，同時可以對抗繼發(fā)性脊髓損傷的相應過程如炎癥反應、氧化應激及凋亡等發(fā)揮正性調節(jié)作用。因此，在脊髓損傷后使用HIF-1激動劑可能是對抗損傷、改善預后的一種重要途徑。

3 小結

目前，HIF-1因為其有效的誘導下游基因表達的特點已成為治療脊髓損傷的重要靶點，且日益成熟的神經干細胞移植技術也為治療脊髓損傷帶來了曙光，將HIF-1基因轉染的神經干細胞植入患者體內儼然成為未來治療該病的重要方向。脊髓損傷尤其是繼發(fā)性損傷的發(fā)病機制復雜，各種因素交互作用，互不分割，在脊髓損傷發(fā)生后成為共同決定其疾病狀態(tài)的關鍵因素，所以對于其發(fā)病機制，還需要進一步深入的研究，以期為神經干細胞移植提供利于生長的微環(huán)境，繼而提高干細胞移植成功率，減少并發(fā)癥的發(fā)生及改善患者預后及生活質量。

4 研究展望

近年來，低氧誘導產生的HIF-1在促進脊髓損傷后神經功能恢復中的作用逐漸得到廣泛關注和認同，HIF-1對于脊髓損傷后神經功能恢復具有重要價值。但相關研究暫時還不能完全解釋其神經保護作用的機制，且脊髓損傷機制復雜。所以，還需要大量實驗研究從相關通路切入，為脊髓損傷的臨床治療帶來有力的證據支持。