雞新城疫紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

益 莎

（東營市東營區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 東營257091）

血凝抑制試驗(yàn)（Hemagglutination inhibition test，HI）是雞新城疫抗體實(shí)驗(yàn)室檢測中最常用的方法，可用于新城疫疫苗免疫后的效果評估及臨床疑似病例的輔助診斷，因其操作簡便、成本低，可進(jìn)行大量樣本的高通量快速檢測，在基層實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用。但影響血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果的因素眾多，如紅細(xì)胞新鮮程度、抗原種類、稀釋液的種類、血清質(zhì)量、環(huán)境溫度和作用時(shí)間等，需要注意各種操作細(xì)節(jié)，操作時(shí)注意力應(yīng)高度集中，避免漏加和重復(fù)加樣，方能得到最準(zhǔn)確的結(jié)果，否則可能得出錯(cuò)誤結(jié)果，給養(yǎng)殖戶造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。筆者結(jié)合自己多年工作經(jīng)驗(yàn)，對操作過程中需要注意的事項(xiàng)歸納總結(jié)如下。

1 稀釋液配制

稀釋液可采用0.85%的生理鹽水，也可用磷酸鹽緩沖液（PBS），通常PBS酸堿緩沖能力好，測出的結(jié)果更接近真實(shí)情況，更準(zhǔn)確。但PBS配制相對復(fù)雜，且保存時(shí)間短、不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)絮狀沉淀，檢測中常用的是pH值7.2 、濃度0.01 mol·L-1的PBS，配制方法為氯化鉀0.2 g、氯化鈉8.2 g、磷酸二氫鈉0.24 g、磷酸氫二鈉1.44 g，加去離子水1000mL，攪拌溶解充分混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.2，分裝后121℃高壓滅菌15min，室溫保存?zhèn)溆?。?yán)格控制PBS的pH值，否則可能會導(dǎo)致自凝或吸附于紅細(xì)胞上的病毒脫落，建議條件不好的基層試驗(yàn)室選用生理鹽水做稀釋液，配制簡單、方便，即使不會配也可以購買醫(yī)用商品化試劑，相對穩(wěn)定可靠，對試驗(yàn)結(jié)果幾乎無任何影響。

2 紅細(xì)胞懸液制備

制備紅細(xì)胞懸液是要選用SPF雞或健康非免疫雞，多選幾只雞，采集的血液混合，也可選用免疫過疫苗的淘汰雞，但洗滌紅細(xì)胞時(shí)一定要多洗幾遍?？鼓齽┛刹捎米约号渲频陌⑹弦骸Ｅ渲品椒ǎ涸?00mL去離子水中加入葡萄糖2.05 g、氯化鈉0.42 g、檸檬酸0.055 g、檸檬酸鈉0.8 g，攪拌溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值為6.1，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆茫?個(gè)月內(nèi)用完。使用時(shí)阿氏液與抽取血液的最終比例為1∶1。紅細(xì)胞洗滌時(shí)選用“V”型尖底15mL離心管，加約4倍稀釋液，吸管輕吹混勻后3000r·min-1離心5min，反復(fù)洗滌3次以上。吸取紅細(xì)胞時(shí)吸管插到底部，不要吸取表層，配制濃度一般為1%，濃度偏低時(shí)測得的血清血凝抑制效價(jià)偏低，濃度偏高時(shí)測得的血清血凝抑制效價(jià)偏高，離心轉(zhuǎn)速不要太高，吹吸紅細(xì)胞操作不要太劇烈，否則可能造成紅細(xì)胞破裂溶血，同一試驗(yàn)用同一批紅細(xì)胞。也可使用醫(yī)用抗凝采血管，采集雞血液時(shí)一定要充分混勻，防止血液局部凝集。配制的紅細(xì)胞懸液最好當(dāng)天使用，時(shí)間不要超過3d。

3 4 單位凝集抗原配制

4單位血凝抗原的配制濃度是影響試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要環(huán)節(jié)，濃度偏高時(shí)測出的結(jié)果偏低，濃度偏低時(shí)測得的結(jié)果偏高。4單位抗原最好現(xiàn)用現(xiàn)配，配制后室溫下4h內(nèi)用完，切記不要反復(fù)凍融，以免影響抗原效價(jià)。同次試驗(yàn)或同批次試驗(yàn)用相同的4單位抗原，效價(jià)高的濃縮抗原穩(wěn)定性和效果更好。每次使用前要吹吸搖勻，加樣后振蕩。疫苗免疫效果檢測時(shí)最好選用疫苗廠家提供的抗原配制4單位血凝抗原，不同毒株測出的抗體效價(jià)不同，最多可差2～3個(gè)效價(jià)。

4單位抗原配后的驗(yàn)證方法：將25μL4單位抗原等量倍比稀釋，使每孔含有4、2、1、0.5 個(gè)血凝單位，再加等量人紅細(xì)胞懸液，判定結(jié)果。4、2、1個(gè)血凝單位孔紅細(xì)胞出現(xiàn)完全凝集為合格。鑒于影響血凝抑制反應(yīng)的因素眾多，某些基層實(shí)驗(yàn)室的4單位抗原需多次調(diào)整，費(fèi)心費(fèi)力，個(gè)人認(rèn)為對試驗(yàn)結(jié)果沒有太大影響的情況下可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)提高4單位抗原濃度，以提高工作效率。

4 器材的選擇和使用

血凝板常選用一次性V型96孔板，90°或110°均可以，反應(yīng)板形狀規(guī)則，無漏洞褶皺，清潔、光滑。如采用可重復(fù)利用的舊反應(yīng)板時(shí)，一定要保證清洗干凈并烘干。加樣時(shí)應(yīng)加入到板底部，不可加的太慢，不要濺出。

所用移液器要定期檢定校準(zhǔn)，用后調(diào)回最大量程，配備適宜吸頭，保證安裝牢固，避免漏氣。吸取液體時(shí)輕輕的反復(fù)吹吸，防止氣泡的產(chǎn)生，用力均勻，防止移液量不準(zhǔn)。吸取時(shí)應(yīng)做到“慢吸快打”，防止移液器吸入液體，從而腐蝕柱塞致漏氣。加樣前應(yīng)先吸取溶液1次，濕潤吸頭，防止因吸頭內(nèi)壁殘留的“液膜”造成排液量小的誤差。加4單位抗原或紅細(xì)胞時(shí)，吸頭垂直加入液體，并保持管嘴與凝集板孔間的距離，防止樣品間交叉污染。先加低濃度抗原孔，再加高濃度孔，保證每個(gè)孔內(nèi)加入液體量準(zhǔn)確無誤。加樣完畢后，把移液器調(diào)回最大量程，并定期校驗(yàn)，避免結(jié)果不準(zhǔn)。

一定要選用一次性吸頭，切記重復(fù)利用。吸頭不要觸碰到無關(guān)的V型板孔，以免發(fā)生交叉污染。振蕩器工作時(shí)應(yīng)勻速平穩(wěn)、無異常抖動(dòng)，幅度不宜過大，時(shí)間不能太長，一般10s左右。用校準(zhǔn)的水銀溫度計(jì)定期校驗(yàn)恒溫箱，保證控溫準(zhǔn)確。

5 檢測樣品的準(zhǔn)備

抗體檢測樣品可以是血清和雞蛋，因采血對雞應(yīng)激過大，臨床送檢樣品以雞蛋居多，測定卵黃抗體。采樣要合理，采典型樣品，保證無菌操作，采樣量適量。通常按雞群3%的比例隨機(jī)抽樣，最低不要少于30份，否則檢測結(jié)果不具有代表性。血清檢測輔助疾病診斷時(shí)應(yīng)病死雞與正常雞兼顧，死亡雞可從心房中取血凝塊，分離血清檢測。為保障檢測結(jié)果，通常在雞進(jìn)食前采血，待檢血清需新鮮、無雜質(zhì)、不溶血、無腐敗，盛裝容器要清潔，正常雞血清狀態(tài)為清亮透明或微黃色。穿刺方法要正確，注入容器時(shí)，取下針頭緩慢注入，避免大量泡沫產(chǎn)生，導(dǎo)致溶血。送至實(shí)驗(yàn)室后要立即分離血清，暫時(shí)不能分離時(shí)，樣品要冷藏保存。溫度在23℃以上時(shí)，血清可在2h內(nèi)析出，如果采血時(shí)外界環(huán)境中溫度低于10℃，血樣采集后置保溫箱中，切記不讓樣品凍結(jié)，待血清析出后5000r·min-1離心5min。有時(shí)會出現(xiàn)膠凍樣血清，可用加樣槍頭將膠凍樣血清在離心管壁上擠壓幾下或戳破血再離心。血清忌反復(fù)凍融，3d內(nèi)使用，可4℃保存，長期凍存于-20℃。

對產(chǎn)蛋雞而言，通常測卵黃抗體效價(jià)代替測血清效價(jià)，以減少采血對雞的應(yīng)激。通常卵黃較血清低1～2個(gè)效價(jià)，因卵黃的形成需要9～10d的時(shí)間，卵黃抗體較血清中抗體的檢測結(jié)果有一定滯后性，雞抗體上升期，不可用卵黃代替血清進(jìn)行抗體監(jiān)測。卵黃萃取和直接稀釋所得檢測結(jié)果基本一致，可同時(shí)取異常蛋和正常蛋檢測卵黃抗體。

6 試驗(yàn)的溫度和結(jié)果觀察時(shí)間

溫度對試驗(yàn)結(jié)果有一定影響，溫度高出現(xiàn)結(jié)果的速度快，凝集解脫也快。溫度每提高5℃測得抗體效價(jià)平均上升0.35 lg。4℃時(shí)紅細(xì)胞發(fā)生自凝，37℃以上時(shí)產(chǎn)生凝集的紅細(xì)胞易洗脫。當(dāng)室溫為20～25℃，時(shí)間一般在30～40min。環(huán)境溫度過低時(shí)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中。反應(yīng)板遠(yuǎn)離風(fēng)扇、空調(diào)或風(fēng)機(jī)出風(fēng)口，以免液體揮發(fā)影響結(jié)果。紅細(xì)胞懸液加入后，待對照紅細(xì)胞懸液完全沉淀前后5min內(nèi)判定結(jié)果為宜，時(shí)間早則不能反映實(shí)際抗體水平，時(shí)間遲則紅細(xì)胞易發(fā)生溶血，導(dǎo)致試驗(yàn)無效，故凝集板應(yīng)靜置到規(guī)定時(shí)間后觀察結(jié)果，中途不能隨時(shí)取放。

7 小 結(jié)

新城疫抗體檢測的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法是應(yīng)用最廣的方法，尤其在基層獸醫(yī)檢測部門。雖然看似簡單，但要想真正做好，得到真實(shí)結(jié)果并不容易，有很多細(xì)節(jié)性的問題需要注意，需要經(jīng)驗(yàn)豐富人員長期實(shí)踐摸索，需要人員高度認(rèn)真負(fù)責(zé)?？贵w測定時(shí)要連續(xù)測對樣品結(jié)果，根據(jù)抗體變化情況綜合評估分析，方能得出能對臨床生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義的數(shù)據(jù)。試驗(yàn)過程中所用一切稀釋液、紅細(xì)胞懸液、4單位抗原要正確配制，尤其是4單位抗原和紅細(xì)胞懸液等，加樣時(shí)搖勻，避免樣品分布不均造成結(jié)果偏差，保證每一次試劑加入準(zhǔn)確無誤，操作手法一定要標(biāo)準(zhǔn)，減少各種誤差，爭取檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠?？傊?，整個(gè)試驗(yàn)過程一定要注意操作的各方面細(xì)節(jié)，才能得到最準(zhǔn)確的結(jié)果。