高效液相色譜法同時測定薔薇科木本植物油中的苯甲醇和苯甲醛

朱 琳 張 蕊 郝希成 王松山 王松雪 郭寶元 薛雅琳 張 東 劉鑫輝 郭咪咪

(國家糧食和物資儲備局科學研究院1，北京 100037)(呂梁學院2，呂梁 033000)

杏仁油和長柄扁桃油均是具有杏仁風味的薔薇科木本植物油，其固有的杏仁風味是評價杏仁油和長柄扁桃油品質(zhì)的重要指標之一，也是消費者選擇嘗試新油種的重要依據(jù)，根據(jù)文獻報道，這種濃郁的杏仁味主要是由苯甲醇和苯甲醛等多種風味物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果[1-4]。

目前，針對植物油進行風味評價的方法主要有頂空微萃取氣相色譜-質(zhì)譜法、電子鼻和氣相色譜法-質(zhì)譜-嗅聞聯(lián)用等定性或半定量方法[1-7]，幾乎沒有風味物質(zhì)苯甲醇和苯甲醛定量方法的報道。在現(xiàn)有文獻報道[8-21]中針對苯甲醇定量方法主要有高效液相色譜法和氣相色譜法，涉及的前處理樣品主要是食品添加劑純品、化妝品及藥用輔料、藥品等；針對苯甲醛定量測定方法主要有分光光度法、電位滴定法、高效液相色譜法、氣相色譜法等，涉及前處理樣品主要集中在電合成產(chǎn)物、食品添加劑等純品類；注射液等藥品類；蜂蜜、飲料等食品類；燃料煙氣、食品接觸材料、復(fù)雜芳烴體系等環(huán)境化工品類，在文獻中尚未有以植物油作為前處理樣品進行苯甲醇和苯甲醛定量分析的方法。因此，本研究建立了一種前處理簡便，適用于植物油中苯甲醛和苯甲醇定量分析的高效液相色譜法。該方法可用于杏仁油和長柄扁桃油等薔薇科木本植物油風味的評測，有利于生產(chǎn)企業(yè)在風味品質(zhì)控制時運用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市場采購長柄扁桃油、杏仁油各2個:長柄扁桃油1號、2號，杏仁油1號、2號。

甲醇：色譜純；磷酸：優(yōu)級純；苯甲醇標準品(≥98%)；苯甲醛標準品(≥98%)。

1100型高效液相色譜儀：配可變波長紫外檢測器。

1.2 方法

1.2.1 標準儲備的溶液配制

苯甲醇儲備溶液(1 mg/mL)：稱取25.0 mg(精確至0.000 1 g)苯甲醇準品(4.4)于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.1)溶解并定容，保存于-20 ℃；

苯甲醛儲備溶液(1 mg/mL)：稱取25.0 mg(精確至0.000 1 g)苯甲醛準品(4.5)于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.1)溶解并定容，保存于-20 ℃。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取植物油樣品0.200 0～1.000 0 g于10 mL尖底離心管中，加入3 mL甲醇，渦旋30 s后，4 000 r/min離心10 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中，再在樣品中加入2 mL甲醇，渦旋30 s后，4 000 r/min離心10 min，將上清液并入之前的提取液中，再加入2 mL甲醇重復(fù)提取兩次。將上述4次甲醇提取液合并于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，混勻后，將該提取液用微孔濾頭過濾至棕色進樣瓶中，待上機分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相∶甲醇∶0.02%磷酸水溶液=30∶70，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，可變波長紫外檢測器：0～17 min 210 nm檢測苯甲醇，17～30 min 250 nm檢測苯甲醛。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯甲醇和苯甲醛最佳檢測波長的確認

在195～350 nm下對苯甲醇和苯甲醛標準溶液進行光譜掃描，掃描圖譜詳見圖1。苯甲醇有一個吸收峰，最大吸收波長為206 nm，苯甲醛有兩個吸收峰，吸收波長分別為201.3 nm和249.7 nm。

圖1 苯甲醇和苯甲醛光譜掃描圖

由于甲醇等流動相試劑在小于210 nm會有吸收，因此，將苯甲醇的最佳檢測波長設(shè)定為210 nm，苯甲醛的最佳檢測波長設(shè)定為250 nm。

2.2 苯甲醇和苯甲醛高效液相色譜流動相條件的優(yōu)化

本方法初始流動相和比例選擇了甲醇∶水(20∶80)液相條件，在該液相條件下，苯甲醇色譜峰對稱性較高，但是，苯甲醛色譜峰會發(fā)生前傾(對稱因子為1.577)，詳見圖2，因此，需要對檢測苯甲醇和苯甲醛的流動相進行優(yōu)化。

注：峰1為苯甲醇，峰2為苯甲醛。

色譜峰前傾主要有兩種情況[23]，一種是上機液與流動相不一致，另一種是樣品超載。可以通過調(diào)節(jié)流動相的pH改善峰型排除這兩個原因，一般可用磷酸或醋酸調(diào)節(jié)pH。經(jīng)對比，苯甲醛上機液與流動相一致或不一致，改變其進樣量與進樣濃度，苯甲醛的峰型均無改善，仍前傾。因此，需要調(diào)流動相的pH來改善峰型。苯甲醇的檢測波長為210 nm，醋酸在210 nm附近有較強吸收，會影響方法的檢出限，而磷酸在紫外區(qū)沒有吸收，因此，本方法選用磷酸對流動相的pH進行調(diào)節(jié)。以甲醇與不同濃度磷酸水溶液(20∶80)為流動相，考察不同pH值對苯甲醇和苯甲醛色譜峰型對稱性的影響，其對稱因子詳見表1。

表1 不同濃度磷酸水溶液流動相的出峰情況

根據(jù)文獻[23]，理想色譜峰的對稱因子為0.95～1.1(絕對對稱峰的對稱因子為1.0)，一般生產(chǎn)廠家對新柱的對稱因子要求為0.95～1.3，被測樣品對稱因子一般要小于1.5。從表1可以看出，甲醇與0.02%～0.05%磷酸水中的對稱因子符合該要求，但是根據(jù)市售的色譜柱進行查詢，一般的色譜柱所能承受的pH范圍一般在2.0～8.0。因此，為了使建立的方法具有普適性，本方法選擇甲醇與0.02%磷酸水作為分析苯甲醇和苯甲醛的流動相，出峰時間在40 min以內(nèi)。

由于苯甲醇和苯甲醛的出峰間隔大于10 min，因此，可以調(diào)高有機相甲醇的比例，縮短檢測時間，提高檢測效率，甲醇與0.02%磷酸水流動相比例優(yōu)化見表2。

表2 甲醇與0.02%磷酸水流動相比例優(yōu)化

從表2可以看出，甲醇∶0.02%磷酸水為30∶70時，不僅出峰快，而且色譜峰的性噪比更高，靈敏度更好，因此，該比例的流動相更適宜分析苯甲醇和苯甲醛。

按上述色譜條件分析的實際植物油樣品，苯甲醇和苯甲醛均可以達到基線分離且峰型對稱，見圖3。

注：峰1為苯甲醇，峰2為苯甲醛。

2.3 研究建立苯甲醇和苯甲醛的前處理條件

2.3.1 提取方式和提取溶劑的選擇

目前，在植物油中苯甲醇和苯甲醛的檢測方法幾乎沒有文獻報道，而藥用輔料及藥品、蜂蜜、飲料等樣品中苯甲醇或苯甲醛的前處理方式并不適合植物油樣品[8-21]。考慮苯甲醇、苯甲醛屬于食品添加劑范疇[23-25]，因此，本研究參照了文獻[26，27]中針對油脂含量高樣品和植物油樣品的前處理方式，采用離心萃取的方式進行前處理。

根據(jù)目標物苯甲醇和苯甲醛溶解性、樣品基質(zhì)及提取劑的極性選取合適的萃取溶劑。苯甲醇和苯甲醛微溶于水，易溶于醇、醚、氯仿等有機溶劑，但醚和氯仿可與植物油互溶，因此，針對植物油樣品中苯甲醇和苯甲醇的萃取溶劑首選醇類溶劑。醇類溶劑不與植物油互溶，同時，可從植物油中將苯甲醇和苯甲醛萃取出來。常用醇類溶劑主要有甲醇和乙醇，相比于乙醇，甲醇比乙醇的極性強，比乙醇親脂性弱，溶解脂類干擾物質(zhì)比乙醇少，因此，在萃取時，本實驗選用甲醇作為萃取溶劑。

2.3.2 苯甲醇和苯甲醛提取次數(shù)的優(yōu)化考察

按1.2.2方法考察植物油中苯甲醇和苯甲醛甲醇提取效率，詳見圖4。僅苯甲醛用2 mL提取第1次的結(jié)果略低一些，而苯甲醇和苯甲醛用2 mL提取第2次至第5次的結(jié)果幾乎呈一條直線，苯甲醇提取第2次至第5次的結(jié)果RSD為0.24%，苯甲醛提取第2次至第5次的結(jié)果RSD為0.75%，因此，用2 mL提取至第2次，苯甲醇和苯甲醛已接近提取完全，但是為了保證提取率，本方法選取用2 mL提取3次。

圖4 植物油樣品中苯甲醇、苯甲醛用2 mL甲醇提取次數(shù)的優(yōu)化

2.3.3 苯甲醇和苯甲醛不同提取方式的考察

按1.2.2方法考察植物油中苯甲醇和苯甲醛甲醇提取方式，對比渦旋30 s與超聲10 min對提取率的影響，二者結(jié)果無明顯差異。為了節(jié)省提取時間，本方法選用渦旋30 s。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍

在210 nm下，苯甲醇的高效液相色譜法線性范圍為0.1～100 μg/mL，標準曲線Y=44.098X+1.557，R2=0.999 6。

在250 nm下，苯甲醛的高效液相色譜法線性范圍為0.1～100 μg/mL，標準曲線Y=69.651X+2.362，R2=0.999 9。

2.4.2 檢出限和定量限

以S/N≥3確定方法的檢出限，S/N≥10確定方法的定量限，在210 nm下苯甲醇的檢出限為0.41 mg/kg，定量限為1.23 mg/kg，在250 nm下苯甲醛檢出限為0.33 mg/kg，定量限為0.98 mg/kg。

2.4.3 準確性和重復(fù)性

選取薔薇科木本植物油樣品長柄扁桃油分別添加三個水平的苯甲醇和苯甲醛，驗證苯甲醇和苯甲醛的測定準確性。該植物油本底經(jīng)5次重復(fù)測量，苯甲醇測量結(jié)果分別為60.9、61.4、61.9、60.9 mg/kg和61.6 mg/kg，平均結(jié)果為61.4 mg/kg，RSD為0.72%，苯甲醛測量結(jié)果分別為192.0、193.6、194.7、192.3 mg/kg和194.7 mg/kg，平均結(jié)果為193.5 mg/kg，RSD為0.66%，苯甲醇和苯甲醛分別按本底的50%、100%、200%的進行添加，經(jīng)3次重復(fù)測量的平均回收率和相對標準偏差結(jié)果見表3～表4。

表3 薔薇科木本植物油添加三個水平的苯甲醇加標回收率和相對標準偏差結(jié)果(n=3)

表4 薔薇科木本植物油添加三個水平的苯甲醛加標回收率和相對標準偏差結(jié)果(n=3)

從表3和表4可以看出，苯甲醇加標平均回收率為91.8%～93.7%，相對標準偏差為0.6%～2.0%，苯甲醛加標平均回率為96.5%～97.7%，相對標準偏差為0.2%～2.9%。

2.4.4 標準品及提取樣品的穩(wěn)定性監(jiān)測

苯甲醇標準儲備液(1 mg/mL)和苯甲醛標準儲備液(1 mg/mL)分別儲備于4 ℃，-20 ℃冰箱，每次取出恢復(fù)到室溫后，稀釋至20 ug/mL進行10 d的穩(wěn)定性監(jiān)測，苯甲醇和苯甲醛監(jiān)測峰面積見圖5。經(jīng)計算，苯甲醇標準儲備液(1 mg/mL)在4 ℃儲存10 d，峰面積的RSD為1.7%，在-20 ℃儲存10 d，峰面積的RSD為3.5%；苯甲醛標準儲備液(1 mg/mL)在4 ℃儲存10 d，峰面積的RSD為14.0%，在-20 ℃儲存10 d，峰面積的RSD為1.9%。從標準溶液穩(wěn)定性測試結(jié)果來看，4 ℃和-20 ℃儲存的苯甲醇標準儲備液的RSD均在5%以內(nèi)，因此，苯甲醇標準溶液在4 ℃和-20 ℃儲存均可，而苯甲醛標準溶液儲存在4 ℃不太穩(wěn)定，在-20 ℃較為穩(wěn)定，綜合考慮，以放置-20 ℃中存儲為宜。

圖5 苯甲醇和苯甲醛標準品穩(wěn)定性監(jiān)測

樣品提取溶液在0、2、4、8、12、24、48 h分別測定，其苯甲醇和苯甲醛峰面積見圖6。經(jīng)計算，苯甲醇峰面積的RSD為0.4%，苯甲醛峰面積的RSD為1.1%，表明樣品提取液在室溫條件下48 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

圖6 樣品提取液中苯甲醇和苯甲醛穩(wěn)定性監(jiān)測

2.5 實際樣品測定

采集市售的2個長柄扁桃油和2個杏仁油樣品，利用上述液相方法對苯甲醇和苯甲醛進行測定分析，測定結(jié)果見圖7。所采集的市售長柄扁桃油樣品中苯甲醇含量略高于市售杏仁油樣品，而市售的杏仁油樣品中苯甲醛含量明顯高于市售長柄扁桃油樣品。

對市售的2個長柄扁桃油和2個杏仁油樣品按照文獻[28]對植物油進行人工方法的氣味檢驗，結(jié)果表明，相較于長柄扁桃油，杏仁油的杏仁風味更為濃郁。由此說明，樣品中苯甲醛的含量對薔薇科木本油脂風味濃郁程度的影響比苯甲醇影響大，其與風味濃郁程度正相關(guān)，對木本油脂整體的杏仁風味貢獻大，這與孫晶波等[1]的報道GC/MS氣質(zhì)分析的毛櫻桃(長柄扁桃的俗稱)核殼及核仁揮發(fā)油結(jié)果是一致的。另外，長柄扁桃油1號樣品與長柄扁桃2號樣品之間，杏仁油1號樣品與杏仁油2號樣品之間哪個風味更為濃郁是難以通過文獻[28]中的氣味檢驗進行人工辨別的，因此，同一種油種的風味評測需要通過儀器進行定量檢測，以判定哪一種生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的薔薇科木本植物油風味更為濃郁。

3 結(jié)論

本研究建立一種同時測定薔薇科木本植物油中苯甲醇和苯甲醛的高效液相色譜方法，該方法苯甲醇加標平均回收率為91.8%～93.7%，相對標準偏差為0.6%～2.0%，苯甲醛加標平均回率為96.5%～97.7%，相對標準偏差為0.2%～2.9%。苯甲醇的檢出限為0.41 mg/kg，定量限為1.23 mg/kg，苯甲醛的高效液相色譜檢出限為0.33 mg/kg，定量限為0.98 mg/kg，該方法不僅回收率高，重復(fù)性好，靈敏度高而且操作簡便，方便生產(chǎn)企業(yè)進行風味品質(zhì)控制時運用，無需企業(yè)購置氣相色譜-質(zhì)譜等昂貴設(shè)備進行風味評測，大大節(jié)約監(jiān)測成本。該方法不僅可指導(dǎo)企業(yè)優(yōu)化工藝，適度保留薔薇科木本油脂中苯甲醇和苯甲醛等風味物質(zhì)，滿足消費者對木本油脂杏仁口味的需求，同時也為下一步科學評價薔薇科木本油脂產(chǎn)品風味提供了技術(shù)支撐。