缺乏運(yùn)動(dòng)降低成年人胰島素敏感性的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析*

劉會(huì)平 劉湘茹 李 智

【提 要】 目的 通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)分析久坐影響成年人胰島素敏感性的關(guān)鍵基因及其相關(guān)功能和機(jī)制。方法 針對下載于NCBI的人類基因表達(dá)匯編(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集GSE9103，利用WGCNA進(jìn)行模塊化分析，并通過相關(guān)性分析和網(wǎng)絡(luò)可視化確定模塊內(nèi)關(guān)鍵hub基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，再對關(guān)鍵hub基因進(jìn)行基因本體GO分析和基因集富集GSEA分析。結(jié)果 通過構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，最終得到5個(gè)基因模塊，其中yellow模塊與久坐呈正相關(guān)，而NDUFA9為其樞紐基因；tan模塊與久坐呈負(fù)相關(guān)，而MYBPC2為其樞紐基因。進(jìn)一步對GO和GSEA分析發(fā)現(xiàn)，yellow模塊基因包括NDUFA9主要發(fā)揮線粒體形成、有氧呼吸、脂肪酸降解等生物學(xué)功能并參與物質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)、阿爾茨海默氏癥、帕金森病相關(guān)通路；而tan模塊基因包括MYBPC2則與骨骼肌收縮、糖原代謝、心臟發(fā)育相關(guān)。結(jié)論 本研究通過構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩選出與久坐生活方式顯著相關(guān)的2個(gè)關(guān)鍵基因模塊和2個(gè)樞紐基因；這2個(gè)模塊基因分別通過線粒體功能、物質(zhì)代謝和骨骼肌收縮、糖原代謝而影響成年人對胰島素的敏感性。

胰島素敏感性降低是導(dǎo)致肥胖、代謝綜合癥、糖尿病、高脂血癥等多種慢性疾病的重要臨床問題，隨著年齡的增長，其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。線粒體功能障礙表現(xiàn)為線粒體還原酶活性、蛋白質(zhì)合成和表達(dá)以及DNA(mtDNA)豐度的下降，多見于上述人群[1]。已有報(bào)道顯示，在老年、2型糖尿病患者和肥胖者以及2型糖尿病患者的后代等群體內(nèi)，胰島素敏感性與肌肉線粒體功能密切相關(guān)。肌肉線粒體功能障礙是產(chǎn)生胰島素敏感性下降甚至胰島素抵抗的重要影響因素[2]。也有研究表明，久坐的生活方式引起顯著的胰島素抵抗，定期運(yùn)動(dòng)可提高胰島素敏感性，均與年齡無關(guān)，但有研究發(fā)現(xiàn)老年人較年輕人具有顯著的線粒體功能障礙[3]。因此，有必要進(jìn)一步針對久坐的生活方式引起胰島素敏感性下降的具體機(jī)制進(jìn)行深入研究。

本研究利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)，從大量基因中篩選與久坐的生活方式密切相關(guān)的樞紐基因，結(jié)合對基因模塊的基因本體分析和基因集富集分析，進(jìn)行功能注釋，探討久坐的生活方式較定期運(yùn)動(dòng)更可能引起胰島素抵抗的相關(guān)分子機(jī)制與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

資料與方法

1.數(shù)據(jù)集和研究對象

本研究分析的數(shù)據(jù)集GSE9103下載于NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。該研究納入的40名健康人中，老年人(59～76歲)20人，年輕人(18～30歲)20人。久坐組研究對象(10名老年人、10名年輕人)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間每周少于2次，每天少于30分鐘；而運(yùn)動(dòng)組研究對象(10名老年人、10名年輕人)在過去至少4年的時(shí)間內(nèi)每周運(yùn)動(dòng)6天且每天騎車或跑步至少1小時(shí)。研究對象均需填寫業(yè)余時(shí)間活動(dòng)調(diào)查表，并經(jīng)過病史、體檢、分級跑步機(jī)測試、血化驗(yàn)(如血脂、激素水平、血糖檢測)的篩選。有代謝性疾病或心血管疾病病史、血糖>99mg/dl、體重指數(shù)>28kg/m2、應(yīng)用影響研究測量結(jié)果的藥物、貧血、妊娠、藥物/物質(zhì)成癮濫用者被排除。基因組數(shù)據(jù)的獲得方法如下：研究對象經(jīng)過一次分級跑步機(jī)測試，此后7天內(nèi)嚴(yán)格控制飲食與運(yùn)動(dòng)，并在測試后第630小時(shí)利用局麻下經(jīng)皮細(xì)針穿刺取腓腸肌活組織(約350～400mg)進(jìn)行基因組分析。詳細(xì)信息參見已發(fā)表論文[3]。

2.基因數(shù)據(jù)的獲得

提取研究對象腓腸肌活組織中的總RNA并應(yīng)用Human Genome U133 Plus 2.0 進(jìn)行基因表達(dá)微陣列分析，獲得該數(shù)據(jù)集series matrix數(shù)據(jù)，以方差最大的探針為基本單位進(jìn)行后續(xù)分析。

3.基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵樞紐基因的篩選

利用R軟件的WGCNA工具包，構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)并篩選出與表型高度相關(guān)的基因模塊。再通過計(jì)算模塊中每個(gè)基因與該模塊(module membership，MM)的相關(guān)系數(shù)，篩選出核心基因(GS 絕對值>0.2，MM絕對值>0.8)，納入string數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)構(gòu)建基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，再利用Cytoscape和cytoHubba MCC法進(jìn)行可視化分析與前10位關(guān)鍵作用基因的鑒定篩選。

4.基因GO與GSEA分析

Metascape 平臺(tái)基因注釋分析數(shù)據(jù)庫可對輸入基因進(jìn)行基因本體(GO)分析。分別提交tan和yellow模塊包含的基因，輸入物種和分析物種均選擇為“H.sapiens”，設(shè)置P<0.01，進(jìn)行 GO 分析，保存結(jié)果，并按照每個(gè)條目涉及的靶點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行排序，篩選排名靠前的生物過程和通路，采用 GraphPad Prism 7.0 軟件對結(jié)果可視化。

應(yīng)用Gene Set Enrichment analysis 3.0版軟件，以hubgenes的表達(dá)值為表型，先后以MSigDB在線基因集數(shù)據(jù)庫的KEGG/ GO gene sets作為參考基因集，對基因表達(dá)譜進(jìn)行基因集富集分析(GSEA)。隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)置為1000次。以P<0.05，且FDRq<0.25為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5.統(tǒng)計(jì)分析

WGCNA[4]基于兩個(gè)假設(shè)：表達(dá)模式近似的基因可能接受共調(diào)控或處于同一通路；表達(dá)網(wǎng)絡(luò)符合無尺度分布。由此根據(jù)表達(dá)相似性，將基因劃分為不同模塊并找出樞紐基因。進(jìn)行WGCNA之前，首先進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，構(gòu)建N×M矩陣(N=樣本數(shù)，M=基因數(shù))。通過層次聚類方法，去除離群樣本。基于pickSoftThreshold函數(shù)篩選軟閾值構(gòu)建鄰接矩陣和拓?fù)渚仃?，以使基因分布符合無尺度網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)相異度對基因進(jìn)行聚類，使用動(dòng)態(tài)剪切法將聚類樹剪切為不同模塊，以每個(gè)模塊的第一主成分基因?yàn)樘卣飨蛄炕?。根?jù)表型與特征向量基因的相關(guān)性挖掘相關(guān)性P值最小且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的模塊。通過計(jì)算模塊所包含基因的內(nèi)部連接度篩選出樞紐基因。

結(jié) 果

1.基因模塊與核心基因鑒定

共5000個(gè)基因用于WGCNA。以鄰接矩陣權(quán)重參數(shù)(軟閾值)β=16、每個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)模塊最少的基因數(shù)目為30作為標(biāo)準(zhǔn)，最終獲得black、blue、greenyellow、tan和yellow 5個(gè)模塊，以|MM|>0.9和|GS|>0.2為參數(shù)篩選出其核心基因分別為GORASP2、LINC00491、S100A4、MYBPC2和NDUFA9。再根據(jù)各個(gè)模塊的特征向量，分別計(jì)算模塊與 2 個(gè)表型(久坐和定期運(yùn)動(dòng))的相關(guān)性。如圖1所示，yellow模塊(400個(gè)基因)與久坐呈正相關(guān)(COR=0.53)，而tan模塊(30個(gè)基因)與久坐呈負(fù)相關(guān)(COR=-0.62)。

圖1 與定期運(yùn)動(dòng)相比，久坐者共篩選出5000基因與久坐顯著相關(guān)的基因模塊與核心基因

2.yellow模塊樞紐基因網(wǎng)絡(luò)分析

將yellow模塊的樞紐基因上傳string數(shù)據(jù)庫，利用cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，并利用cytohubba插件的MCC方法篩選出前10位基因，包括ATP、MRPL、NDUF家族等在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)皆重要的關(guān)鍵作用基因(圖2)。

圖2 分析明確久坐相關(guān)的基因與yellow模塊基因顯著相關(guān)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化篩選yellow模塊的前10位關(guān)鍵基因

3.yellow模塊樞紐基因的功能分析

如圖3和表1所示，yellow模塊基因行GO分析顯示其具有線粒體形成、有氧呼吸、脂肪酸代謝等生物學(xué)功能如mitochondrial envelope/matrix/respiratory chain complex III，aerobic respiration，fatty acid degradation/beta-oxidation using acyl-CoA dehydrogen等。進(jìn)一步KEGG分析則富集了KEGG_OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION、KEGG_CITRATE_CYCLE_TCA_CYCLE、KEGG_PORPHYRIN_AND_CHLOROPHYLL_METABOLISM、KEGG_ALZHEIMER_DISEASE、KEGG_PARKINSONS _ DISEASE等與糖脂代謝、三羧酸循環(huán)、阿爾茨海默氏癥、帕金森病密切相關(guān)的信號通路。

圖3 Metascape平臺(tái)對yellow模塊基因進(jìn)行GO分析明確其生物學(xué)功能

表1 久坐者骨骼肌中顯著上調(diào)且與NDUFA9共表達(dá)的yellow模塊基因的GSEA分析

4.tan模塊樞紐基因網(wǎng)絡(luò)分析

tan模塊中，與MYBPC2密切相關(guān)的蛋白包括多種能夠調(diào)節(jié)骨骼肌功能、減少細(xì)胞凋亡、抑制炎癥、調(diào)節(jié)血脂代謝和抑制血管新生等的蛋白質(zhì)，如：GLRX、PHKA1、NIBAN1、CYP27A1、TNNI2、CD38、TNNT3、ATP2A1、PPP1R3D、CASQ1、MTHFD2、ANKRD23、TNFRSF1A等(圖4)。

5.tan模塊樞紐基因的功能分析

tan模塊基因行GO分析富集了調(diào)節(jié)骨骼肌收縮、糖原/蛋白代謝、凋亡、氧化還原酶活性及心臟發(fā)育等生物學(xué)功能(圖5)。KEGG分析按本研究標(biāo)準(zhǔn)未能成功富集信號通路。

圖4 分析明確久坐相關(guān)的基因與tan模塊基因顯著相關(guān)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化篩選tan模塊的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因

圖5 Metascape平臺(tái)對tan模塊基因進(jìn)行GO分析明確其生物學(xué)功能

討 論

據(jù)報(bào)道，yellow模塊的代表基因如ATP、NDUF和MRPL家族蛋白分別具有調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈功能和線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)功能，是影響線粒體形成和功能的重要因素。其中，ATP5F1B、ATP5MC3和ATP5ME編碼的蛋白為線粒體合成酶的重要亞基，對線粒體合成ATP具有重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，上述ATP家族蛋白表達(dá)升高與肥胖、高血壓[5]、血脂代謝異常[6]、胰島素抵抗[7]、2型糖尿病、腎積水、惡性腫瘤侵襲特性和轉(zhuǎn)移耐藥等臨床問題密切相關(guān)[8]。NDUFA9 和NDUFS2編碼的蛋白質(zhì)分別是NADH脫氫酶復(fù)合體的疏水蛋白部分和核心亞基，NADH脫氫酶復(fù)合體是位于線粒體內(nèi)膜的電子傳輸鏈中的第一個(gè)酶復(fù)合物。因此，NDUF家族蛋白對調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈功能具有重要作用。NDUF家族蛋白可引起新生兒Leigh綜合征、惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能、視神經(jīng)病變、早發(fā)精神分裂癥等臨床問題[9-10]。MRPL15和MRPL41編碼的蛋白質(zhì)是線粒體核糖體蛋白，有助于線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。二者的臨床報(bào)道很少，目前發(fā)現(xiàn)其表達(dá)增加與ER陽性的乳腺癌相關(guān)[11]，而相對較多的基礎(chǔ)研究主要發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞周期抑制和凋亡相關(guān)[12]。本研究利用骨骼肌標(biāo)本的基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與定期運(yùn)動(dòng)相比，久坐的生活方式導(dǎo)致上述基因增加，并發(fā)現(xiàn)其通過發(fā)揮促進(jìn)線粒體的形成、呼吸鏈、脂肪酸降解、細(xì)胞色素C釋放、輔酶A水解等功能調(diào)節(jié)糖脂代謝、三羧酸循環(huán)、阿爾茨海默氏癥、帕金森病相關(guān)通路。因此，上述基因及其調(diào)節(jié)的相關(guān)通路，可能是久坐患者發(fā)生胰島素抵抗的重要機(jī)制，其對胰島素抵抗以及相關(guān)疾病的影響值得深入研究。

另一方面，久坐者的MYBPC2基因顯著低表達(dá)。該基因編碼的是快速型蛋白肌球蛋白結(jié)合蛋白C，與肥厚性心肌病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)的MYBPC2網(wǎng)絡(luò)互作蛋白中，GLRX編碼蛋白催化谷胱甘肽還原反應(yīng)，在抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[14]。PHKA1編碼磷酸化酶激酶，異?？梢鹛窃A積病[15]。CYP27A1編碼細(xì)胞色素P450超家族蛋白，催化涉及藥物代謝和膽固醇，類固醇和其他脂質(zhì)合成的許多反應(yīng)，對于調(diào)節(jié)膽固醇的體內(nèi)平衡非常重要[16]。TNNI2編碼快縮肌蛋白，參與組成肌鈣蛋白復(fù)合體，調(diào)節(jié)骨骼肌與血管平滑肌功能，還具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[17]。TNNT3、ATP2A1、ANKRD23及CASQ1均參與骨骼肌收縮與功能的調(diào)節(jié)[18-20]。PPP1R3D編碼絲蘇氨酸蛋白磷酸化酶，而TNFRSF1A編碼腫瘤壞死因子超家族蛋白，二者均具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，參與多種細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)如細(xì)胞生存、凋亡和炎癥等[21]。本研究發(fā)現(xiàn)tan模塊中MYBPC2及其網(wǎng)絡(luò)互作蛋白在久坐者體內(nèi)較規(guī)律運(yùn)動(dòng)者顯著減低，可能為久坐者的骨骼肌收縮、糖原代謝等活動(dòng)減低的適應(yīng)性反應(yīng)，但同時(shí)可能是引起胰島素抵抗的重要機(jī)制。

本研究通過對基因數(shù)據(jù)集GSE9103進(jìn)行基因組學(xué)WGCNA分析，針對定期運(yùn)動(dòng)者與久坐者的基因表達(dá)譜，構(gòu)建了與久坐密切相關(guān)的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并對核心樞紐基因及其功能機(jī)制進(jìn)行了多重分析，從基因水平上揭示了缺乏運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制，對于探討胰島素抵抗以及相關(guān)疾病的調(diào)控機(jī)制和靶點(diǎn)具有重要意義。