肝細(xì)胞核核因子4α 在肝細(xì)胞分化及肝再生中的研究進(jìn)展

常鑫鉞，王震俠，趙建國

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)是一種高度保守的孤核受體超家族成員，作為一種配體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)在肝臟和胃腸道器官(胰腺、胃和腸)[1]。HNF4α 最先于大鼠成熟肝臟中發(fā)現(xiàn)，一度被認(rèn)為是肝細(xì)胞特異性因子，之后被發(fā)現(xiàn)與人MODY1 型糖尿病發(fā)病密切相關(guān)[2]。目前研究表明，根據(jù)轉(zhuǎn)錄啟動子P1、P2 的不同，HNF4α 的亞型共分為兩大類，其中P1 介導(dǎo)的于肝臟表達(dá)，p2 介導(dǎo)的于胰腺表達(dá)[3]。HNF4α 廣泛參與肝細(xì)胞的正常生物學(xué)功能及代謝調(diào)節(jié)，如膽汁酸合成，脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，糖異生，尿素生成，細(xì)胞粘附，增殖和凋亡，藥物代謝[4]，同時也是調(diào)控干細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化的關(guān)鍵[5]。

1 HNF4a 的結(jié)構(gòu)

HNF4α 是一種高度保守的核受體超家族成員，富集與肝臟。于肝臟、腎臟，肝臟，胰腺β 細(xì)胞及胃腸消化道細(xì)胞中均有表達(dá)，與MODY1 型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)。HNF4α 保守的表達(dá)模式可以在沒有外源性配體的情況下激活基因轉(zhuǎn)錄，在器官發(fā)育、器官生成和維持器官功能方面發(fā)揮著重要作用[6]。人HNF4α 基因定位于20 號染色體長臂(20q13，12)，包含11 個內(nèi)含子和12 外顯子。根據(jù)其轉(zhuǎn)錄啟動子P1、P2的調(diào)控，共分為12 種亞型，其中P1 驅(qū)動的HNF4α(1-6) 亞型，而P2 驅(qū)動的HNF4α(7-12)亞型[7]。HNF4α 由結(jié)構(gòu)上來說是一種鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，共包含6 個結(jié)構(gòu)域(5 個功能域，1 個鉸鏈區(qū))的模塊蛋白。其中A、B 區(qū)域為反式激活結(jié)構(gòu)域，包含n-末端反激活域(AD-1)，與啟動子序列密切相關(guān)；C 區(qū)是一個高度保守的DNA 鋅指結(jié)合域(DBD)，D 區(qū)為柔性鉸鏈，E區(qū)包含第二個反激活域的多功能配體結(jié)合域(AD-2)，F(xiàn) 區(qū)為抑制區(qū)[8]，為HNF4α 特有，兩個反激活域?qū)NF4α 驅(qū)動的基因轉(zhuǎn)錄有重要影響[9]。

2 HNF4α 的主要功能

HNF4α 的人類全基因組定位分析表明，HNF4α 在肝細(xì)胞的物質(zhì)代謝及分化再生等多條途徑中處于中心環(huán)節(jié)。HNF4α 與人肝細(xì)胞中12%的基因相結(jié)合，高于其他肝細(xì)胞核因子，其中RNA 聚合酶II 所占的活性轉(zhuǎn)錄基因中有42%與HNF4α 相結(jié)合[10]。HNF4α 自身通過甲基化、乙?；?、磷酸化等的調(diào)節(jié)方式改變自身生物學(xué)活性，通過同源二聚體形式與順式作用原件結(jié)合，激活目標(biāo)基因，介導(dǎo)不同的生理反應(yīng)[11]；通過控制肝細(xì)胞內(nèi)其他轉(zhuǎn)錄因子以及功能必需基因，調(diào)控肝細(xì)胞的正常發(fā)育[12]。研究表明，HNF4α 在調(diào)控肝細(xì)胞分化[13]，穩(wěn)定肝細(xì)胞表型[14]，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖[15]，過程中起重要作用。同時還參與調(diào)節(jié)代謝廢物和藥物的解毒[16]，血清蛋白、載脂蛋白的合成[17]等多條物質(zhì)代謝途徑。由此可見HNF4α 對于肝臟正常形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)生與維持及肝細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝至關(guān)重要。HNF4α 的缺乏或表達(dá)量異常會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。胚胎期小鼠缺失HNF4α(由HNF4 編碼)因無法形成正常內(nèi)胚層而早期死亡[18]，Parviz 等通過Hnf4loxP/loxPAlfp.cre 嵌合體的研究也表明，HNF4α 缺失導(dǎo)致小鼠肝臟體積增大，肝實質(zhì)內(nèi)肝血竇發(fā)育異常，Gys2、Pck1、G6pc 糖原合成關(guān)鍵因子缺失，相鄰肝細(xì)胞缺乏正常細(xì)胞間連接，肝細(xì)胞缺乏正常生理功能[19]，最終導(dǎo)致死亡。由此可見，HNF4α 在肝細(xì)胞中參與多種生物學(xué)功能，缺失HNF4α 會對肝細(xì)胞及生物體產(chǎn)生致死性影響。

3 HNF4α 與肝細(xì)胞分化

肝細(xì)胞來源于內(nèi)胚層，由肝祖細(xì)胞分化而成肝細(xì)胞，在肝組織中占絕大多數(shù)[20]。肝祖細(xì)胞是肝臟的成體干細(xì)胞，有分化為肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞的雙向潛能。在肝祖細(xì)胞形態(tài)和功能上向肝細(xì)胞分化并形成胞內(nèi)嗜堿性深染區(qū)時，首先可以檢測到HNF4α 的表達(dá)[21]，直至肝細(xì)胞發(fā)育成熟后維持相對穩(wěn)定。HNF4α 可誘導(dǎo)多種細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化，產(chǎn)生類肝細(xì)胞和人工肝組織，在肝祖細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等的研究中均有報道。

3.1 HNF4α 促進(jìn)肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化

肝祖細(xì)胞是肝臟的成體干細(xì)胞，有分化為肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞的雙向潛能。Ancey 等人在體外對肝祖細(xì)胞(HPCs)的研究表明，HNF4α 在肝祖細(xì)胞由5hmc 激活，經(jīng)FOXA2/TET1/P1途徑，使HNF4α 遠(yuǎn)端啟動子去甲基化表達(dá)HNF4αP1 亞型，指導(dǎo)肝祖細(xì)胞的向肝細(xì)胞定向分化[22]。而HNF4α 缺乏會阻礙肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞的正常分化及發(fā)育，對生物體產(chǎn)生致死性影響。Li 等對HNF4α 陰性(HNF4α-/-)小鼠的研究表明，HNF4α-/-胚胎由于內(nèi)臟內(nèi)胚層功能的缺陷于原腸胚期死亡；雖然通過與野生型四倍體胚胎互補可避免早期死亡，分化形成肝祖細(xì)胞。但缺乏HNF4α 會使肝祖細(xì)胞分化異常，新生肝細(xì)胞中apoA1、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TFN)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)和促紅細(xì)胞生成素(Epo)的表達(dá)明顯降低[23]，肝細(xì)胞的形態(tài)和功能分化、肝糖原的積累和肝上皮的生成均出現(xiàn)明顯異常[19]。筆者認(rèn)為，HNF4α 通過影響肝細(xì)胞的必要代謝途徑，影響肝細(xì)胞表達(dá)正常生理功能蛋白，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞分化受阻，阻礙肝細(xì)胞分化成熟。

3.2 HNF4α 促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向肝譜系分化

胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC)具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性，是一類亞全能干細(xì)胞。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境中，該細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)、中、外三個胚層幾乎所有的細(xì)胞類型。DeLaForest 等通過對ESC 的研究表明，HNF4α 表達(dá)的開始與ESC 向肝細(xì)胞譜系分化的確立密切相關(guān)。通過動態(tài)檢測第0 天(胚胎干細(xì)胞)、第5 天(最終內(nèi)胚層細(xì)胞)和第10 天(肝祖細(xì)胞)的HNF4α的表達(dá)水平，在第0 天至第5 天，HNF4α 與其mRNA 均未檢測到表達(dá)；在第10 天，即出現(xiàn)肝祖細(xì)胞分化時，HNF4α 與其mRNA 又可檢測到表達(dá)，而HNF4α 的表達(dá)缺失會導(dǎo)致ESC肝譜系分化停滯[24]。Liu 等通過對外源性導(dǎo)入Foxa2/ Hnf4a的鼠ESC 與正常鼠ESC 肝譜系分化對比發(fā)現(xiàn)，兩組ESC 均可向肝譜系分化生成肝樣細(xì)胞，但實驗組向肝譜系的分化程度顯著增加[25]。犬骨髓干細(xì)胞(cBMSCs)的研究表明，轉(zhuǎn)染了Foxa1 和Hnf4a 的犬骨髓干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞[20]。。以上研究均表明，HNF4α 在調(diào)控ESC 向肝譜系分化過程中具有重要作用，HNF4α 是調(diào)控ESC 向肝譜系分化的始動因子，其過表達(dá)可以顯著增強ESC 向肝譜系的分化。

3.3 HNF4α 促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的向肝譜系分化

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一類具有多向分化潛能的細(xì)胞，它們具有體外自我更新和長期分化為人體內(nèi)所有細(xì)胞類型的能力，可通過內(nèi)胚層細(xì)胞向類肝細(xì)胞分化[26]，是一種研究肝細(xì)胞分化的重要研究對象。HNF4α 表達(dá)的開始與iPSCs 的肝譜系的生成明確相關(guān)，在胚胎期8.5 天及在肝臟中肝芽到成年過程中HNF4α 呈高表達(dá)，而敲低HNF4α 則會抑制人iPSCs 向最終內(nèi)胚層分化，降低最終內(nèi)胚層(GSC，SOX17 和Lefty1)的基因表達(dá)水平，阻礙其進(jìn)一步向肝譜系分化，這些結(jié)果提示HNF4α 是肝祖細(xì)胞和肝細(xì)胞分化的必要條件[27]。DeLaForest 等通過體外培養(yǎng)iPSCs 研究表明，HNF4α 與iPSCs 向內(nèi)胚層分化、肝祖細(xì)胞形成及肝基因表達(dá)的始動環(huán)節(jié)均密切相關(guān)，HNF4α 的缺失最終會阻礙內(nèi)胚層細(xì)胞向肝祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[28]。

以上研究均表明，HNF4a 在指導(dǎo)多種干細(xì)胞及肝祖細(xì)胞向肝譜系方向分化中具有重要作用。HNF4α 通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，控制其向肝譜系表達(dá)，進(jìn)而分化成為肝細(xì)胞；而HNF4α 的缺失會使分化停滯甚至產(chǎn)生致死性影響。

4 HNF4α 與肝再生的關(guān)系

肝臟是具有再生潛力的器官，生理情況下，肝細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，無明顯再生。在肝切除及病理性損傷的情況下，肝臟產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，經(jīng)白細(xì)胞介素(IL)-6/Jak 激酶(Jak)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄-3(STAT3)激活因子以及磷酸肌醇肽3-激酶(PI3-K)/磷酸肌醇肽依賴蛋白激酶1(PDK1)/Akt 等通路協(xié)同調(diào)控[29]，激活肝細(xì)胞、肝祖細(xì)胞及其它來源的干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，增殖分化產(chǎn)生肝細(xì)胞，完成肝臟的修復(fù)再生[30]。Huck 等的研究發(fā)現(xiàn)，在肝部分切除術(shù)后早期，肝再生開始時HNF4α 表達(dá)明顯下降，而在肝再生終止階段，HNF4α 表達(dá)恢復(fù)正常[31]，而在敲除HNF4α 的情況下，肝細(xì)胞處于高增殖狀態(tài)，新生細(xì)胞出現(xiàn)去分化、促癌表型[32]。以上均表明HNF4α在肝再生過程中參與調(diào)控了肝細(xì)胞增殖和分化，在肝再生中具有重要作用。

4.1 HNF4α 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖

HNF4α 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，這是由于觀察到原本正常表達(dá)HNF4α 在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。腎細(xì)胞癌(RCC)中HNF4a 的mRNA 及蛋白表達(dá)較正常腎組織均下調(diào)；對腎細(xì)胞株HEK293 轉(zhuǎn)導(dǎo)HNF4α 基因，通過上調(diào)HNF4α 的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖[33]。去分化肝癌細(xì)胞中HNF4α 的表達(dá)水平較低或不存在[34]；而在去分化肝癌細(xì)胞株中上調(diào)HNF4α表達(dá)，可以有效抑制肝癌細(xì)胞株快速增殖[35]，上調(diào)HNF4a 的表達(dá)會導(dǎo)致肝癌細(xì)胞向更類似于肝細(xì)胞表型的方向重新分化[36]。以上研究表明，HNF4α 參與調(diào)控細(xì)胞增殖，HNF4α 在細(xì)胞中可能作為抑癌基因抑制細(xì)胞過度增殖。

4.2 HNF4α 參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖

前述已知HNF4α 參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。在肝再生的研究表明，HNF4α 在肝再生的起始與終止階段均有重要作用，尤其是肝細(xì)胞。在小鼠急性肝切除6h 即檢測到肝細(xì)胞中HNF4α 的表達(dá)明顯下降，12h 達(dá)最低，直至7 天后肝再生終止階段HNF4α 表達(dá)恢復(fù)正常[37]；而在HNF4α 敲除小鼠行相同處理，小鼠肝細(xì)胞可檢測到PCNA、Ki67 等的持續(xù)高表達(dá)，肝細(xì)胞增殖活躍[38]。HNF4α 的缺失不僅上調(diào)增殖抗原的表達(dá)，還促使肝細(xì)胞更快進(jìn)入細(xì)胞周期。HNF4α 的表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)CyclinD1 的高表達(dá)[39]，而CyclinD1 抑制HNF4α 與特定基因的結(jié)合[40]，影響肝細(xì)胞其他代謝途徑的進(jìn)行，使肝細(xì)胞快速進(jìn)入復(fù)制周期，完成肝細(xì)胞的增殖。

4.3 HNF4α 調(diào)節(jié)肝再生的可能機制

HNF4α 作為控制肝細(xì)胞代謝的核心因子，控制肝細(xì)胞的多種基礎(chǔ)代謝。以往的研究認(rèn)為HNF4α 對肝再生的影響，由于肝臟中存在大量HNF4α 靶點而影響了肝臟中多種信號通路[41]，進(jìn)而影響肝再生的進(jìn)行。HNF4α 通過競爭與c-Myc結(jié)合來上調(diào)p21[41]，通過p21 抑制增殖；Sladek 等人提出肝臟中可能存在c-Myc/ Cyclin D1/HNF4α 循環(huán)[40]，進(jìn)一步研究表明，HNF4α/Cyclin D1 之間相互抑制協(xié)同控制了肝臟的細(xì)胞周期機制和代謝[39]。HNF4α 在控制增殖的過程中可能通過協(xié)調(diào)肝臟能量代謝與細(xì)胞增殖，調(diào)動細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)主要作用于肝細(xì)胞增殖，為肝細(xì)胞增殖提供合適的細(xì)胞環(huán)境，以此促進(jìn)肝細(xì)胞的再生。

5 結(jié)語

HNF4α 作為富集于成熟肝細(xì)胞的細(xì)胞因子，在調(diào)控肝細(xì)胞物質(zhì)代謝、抑制增殖、促進(jìn)分化、調(diào)控增殖等方面具有重要作用。HNF4α 在促進(jìn)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的作用已然明確，但其詳細(xì)機制仍不明確，明確HNF4α 對干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的調(diào)控機制有利于體外肝細(xì)胞的再生，有助于推動體外干細(xì)胞移植治療的發(fā)展，結(jié)合新興的細(xì)胞支架技術(shù)，有可能使人工肝臟成為可能，對重度肝損傷及肝癌的治療具有重要的臨床意義。HNF4α 在肝再生的研究表明HNF4α 在肝再生過程中對激活和終止兩階段均起到重要調(diào)節(jié)作用，在肝再生過程中起到了雙向調(diào)節(jié)作用，在肝再生的起始與終止階段均有重要作用，同時HNF4α 對肝再生的調(diào)節(jié)作用還可能通過改變細(xì)胞內(nèi)在環(huán)境，為肝再生提供適當(dāng)?shù)募?xì)胞環(huán)境來調(diào)節(jié)肝再生，外源性調(diào)控HNF4α 的表達(dá)可能影響肝細(xì)胞代謝，促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)向特定代謝途徑進(jìn)展，對臨床急慢性肝病促進(jìn)肝再生及術(shù)后肝功能的快速恢復(fù)具有重要意義。