肝外膽管癌差異表達(dá)基因相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展

王家興，申文鳳，張乾，馮學(xué)敏，任建軍

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010050)

0 引言

膽管癌(Cholangiocarcinoma，CCA) 起源于肝內(nèi)或肝外膽管粘膜上皮細(xì)胞，是沿著膽管產(chǎn)生的惡性腫瘤，可以侵犯膽管的任何部位。CCA 分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌。流行病學(xué)調(diào)查表明，CCA 占消化道腫瘤的3%。發(fā)病率在我國惡性病變中居第四位左右，死亡率居前三位[1]。近年來的疾病的發(fā)生率顯著攀升[2]，其中肝外膽管癌(Extrahepatic Cholangiocarcinoma，ECC) 占膽管癌的80%～90%[3]，但關(guān)于ECC 的發(fā)生率尚無大規(guī)模的流行病學(xué)報告資料。盡管ECC在手術(shù)、化療和放療等方面取得了進(jìn)展，但接受根治性治療的膽管癌患者的5 年生存率仍不到35%[4]。ECC 早期診斷十分困難，發(fā)現(xiàn)多晚期，腫瘤患者平均存活期不到12 個月[5]。

全基因組調(diào)查和高通量轉(zhuǎn)錄組分析的最新進(jìn)展表明，人類基因組僅包含20000 個蛋白質(zhì)編碼基因，占總基因組的2%[6]。盡管10 到20 倍的基因組序列被轉(zhuǎn)錄成長的非編碼RNA(lncRNA)，而不是蛋白質(zhì)編碼的RNA[7]。lncRNA 在功能上被定義為長度＞200 個核苷酸(nt)的轉(zhuǎn)錄物，沒有蛋白質(zhì)編碼的可能性。近年來，lncRNA 和與其相聯(lián)系的信使RNA 的功能和作用機(jī)制越來越受到科學(xué)界的關(guān)注[8-10]。2011 年，Salmena 等[11]提出了競爭性的內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ce-REA)假說。也就是說，lncRNA 可以通過MRE 吸附miRNA，抑制miRNA 的效用，間接可調(diào)蛋白質(zhì)編碼基因的表現(xiàn)。因此，腫瘤相關(guān)的差異lncRNAs、mRNAs的鑒定及其分子生物學(xué)功能的研究可為腫瘤分子生物學(xué)研究提供參考。全面了解CCA 差異基因在疾病的診斷和預(yù)后中的作用機(jī)制，對于明確膽管癌的個體化診斷和預(yù)后具有重要意義。本文就ECC 相關(guān)基因的研究進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步闡明疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 肝外膽管癌差異LncRNA 的研究現(xiàn)狀

LncRNA 的表達(dá)水平通常低于編碼基因，在分子生物學(xué)中已成為腫瘤的重要調(diào)控因子，并表現(xiàn)出更多的組織和細(xì)胞特異性的表達(dá)模式。LncRNAs 的保守性較差，已被證明通過順式或反式作用機(jī)制控制不同水平的基因表達(dá)途徑。因此，分析lncRNAs 和mRNAs 的共同表現(xiàn)，有助于預(yù)測包括癌癥在內(nèi)的各種疾病發(fā)展過程中的功能作用，并為最終疾病機(jī)制打下基礎(chǔ)，在深入了解其機(jī)制的基礎(chǔ)上，才能發(fā)掘與診斷和治療相關(guān)標(biāo)志物的目標(biāo)點。據(jù)之前的報道[12-13]，lncRNA 可以調(diào)節(jié)人的惡性腫瘤中的各種生物過程。研究表明lncRNA 可能會影響癌癥的發(fā)展過程，包括染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、分子運(yùn)輸、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等。lncRNA 幾乎在基因表達(dá)的每個階段都發(fā)揮了廣泛的調(diào)節(jié)作用，包括轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳水平。此外，lncRNA 通過多種調(diào)節(jié)途徑對癌癥發(fā)展和進(jìn)展起著重要作用的證據(jù)越來越多。這些觀察結(jié)果提示了lncRNA可能的病理生理作用。

1.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

一項研究[14]通過在ECC 中進(jìn)行了lncRNA 和mRNA 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)ECC 中差異表達(dá)了268 個lncRNA 和459 個mRNA。其中78 例lncRNA 和66mRNA 表達(dá)較癌旁組織上調(diào)2 倍以上，190 例lncRNA 和393mRNA 表達(dá)下調(diào)，證實了ECC 與配對癌旁組織lncRNA 表達(dá)的差異。共表達(dá)mRNA 和lncRNA 的功能分析表明，這些失調(diào)的lncRNA 可能與已知的ECC 相關(guān)的生物學(xué)過程和途徑有關(guān)。Han 的研究[15]通過全基因組lncRNA 篩選和功能分析，明確lncRNA是否失調(diào)并參與關(guān)鍵的炎癥途徑。報告發(fā)現(xiàn)，H19，C3P1，AC005550.3，PVT1 和LPAL2 具有區(qū)別膽管癌與正常組織的特征，包括APOC1P1，PVT1 和LPAL2 已被證明在膽管癌發(fā)病過程中調(diào)節(jié)遷移和一些關(guān)鍵炎癥基因，提示異性lncRNA可能具有檢測膽管癌的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，一組lncRNA 在肝內(nèi)膽管癌和ECC 樣本中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，具有不同的臨床特性和表現(xiàn)，這表明lncRNA 有可能識別CCA 細(xì)胞中癌灶的位置，并區(qū)分不同的CCA 亞型，提示lncRNA 可能的調(diào)控機(jī)制在肝內(nèi)膽管癌與ECC 之間可能存在差異。

1.2 LncRNA MALAT1

lncRNA Malat1(Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1，轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1)參與了多種腫瘤類型的發(fā)生發(fā)展，在多種癌癥中觀察到MALAT1 的異常表達(dá)。本研究[16]考察了MALAT1 在人肝門部膽管癌細(xì)胞系和臨床腫瘤標(biāo)本中的作用。結(jié)果表明，MALAT1 在肝門部膽管癌組織和細(xì)胞系中特異性上調(diào)，并與病理腫瘤分期，腫瘤橫徑大，神經(jīng)周圍浸潤有關(guān)。敲除MALAT1 抑制CCA 細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。此外，趨化因子受體4(chemokine receptor-4，CXCR4)參與了MALAT1 誘導(dǎo)的人肝門部膽管癌的生長，遷移和侵襲。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1 在調(diào)節(jié)肝門部膽管癌細(xì)胞的生長，遷移和侵襲過程中發(fā)揮致癌作用，認(rèn)為MALAT1 可能是肝門部膽管癌潛在的治療靶點。Shi Jian 的研究[17]發(fā)現(xiàn)肝門部膽管癌患者血漿標(biāo)本中PCAT1，MALAT1 和CPS1-IT1 的循環(huán)顯著增加。通過ROC 分析發(fā)現(xiàn)三種血漿lncRNA 的ROC 曲線值(AUC)下面積分別為0.784、0.860 和0.677。這三個因素的進(jìn)一步組合表明更高的療效(AUC 為0.893；靈敏度為85.5%；特異性為93.2)。本研究表明MALAT1，PCAT1 和CPS1-IT1可作為早期診斷肝門部膽管癌的新的生物標(biāo)志物。

1.3 LncRNA PCAT1

lncRNA PCAT1(prostate cancer-associated transcript 1，前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1)與多種癌癥有關(guān)。研究[18]進(jìn)一步證實PCAT1 在ECC 組織樣品和細(xì)胞系中上調(diào)。轉(zhuǎn)染試驗中RNA沉默后PCAT1 的下調(diào)降低了ECC 細(xì)胞的生長，增加了細(xì)胞凋亡。transwell 實驗證實PCAT1 能抑制ECC 細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，PCAT1 是microRNA(miR-122)的競爭性內(nèi)源，其生物信息學(xué)分析和熒光素酶報告基因分析表明PCAT1 通過miR-122 調(diào)節(jié)Wnt1 表達(dá)。此外，PCAT1 下調(diào)使糖原合成酶激酶3 水平升高，并顯著降低整個細(xì)胞裂解液和細(xì)胞核部分的-catenin 水平，提示PCAT1 沉默抑制Wnt/-catenin 信號通路。外源表達(dá)Wnt1 逆轉(zhuǎn)PCAT1 沉默誘導(dǎo)的ECC 細(xì)胞生長抑制的抑制作用。這些結(jié)果提示，PCAT1 沉默通過miR-122 抑制和WNT1 表達(dá)降低Wnt/-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制ECC進(jìn)展，提示PCAT1 可能是ECC 相關(guān)的潛在治療靶點。

2 肝外膽管癌相關(guān)基因的研究現(xiàn)狀

由于膽管癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為未來的研究重點可以放在膽管癌的基因方面[19,20]。目前研究發(fā)現(xiàn)p53、p73、PTEN、K-ras、p16、c-myc、Bcl-2 和RASSF1 等與肝外膽管癌可能具有潛在的聯(lián)系。

2.1 p53 和p73 基因

p53 基因的分子變化頻率是癌癥研究中最高的，涉及人類半數(shù)以上的惡性腫瘤。研究表明p53 與膽管癌有關(guān)，尤其是伴有原發(fā)性硬化性膽管炎的膽管癌。Suto 等人[21]分析了52例肝外膽管癌患者的基因。結(jié)果表明，肝外膽管癌患者K-ras、p53 和APC 基因突變率分別為9.6%、32.7%和0。這項研究提示了p53 的表達(dá)可能與肝外膽管癌的分化程度有關(guān)，可作為ECC 的預(yù)后指標(biāo)之一。其中p73 基因和p53 基因具有很大的同源性，經(jīng)常出現(xiàn)在惡性腫瘤的發(fā)生過程中。由于兩者的作用有共同點，因此也可以說兩者歸入同一家族。張志勇等[22]研究分析了41 例肝外膽管癌和10 例膽總管囊腫中p73和p53 的表達(dá)。結(jié)果表明，p73 基因在人肝外膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；另外，由于p73 和p53 的表達(dá)是相關(guān)的，所以兩者之間可能存在有互補(bǔ)作用。另一個與 p53 有較密切關(guān)系的是 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，第10 號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白)，屬近些年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因。Zhou 等[23]的研究結(jié)果表明neoalbaconol(NA)可以通過靶向在10 號染色體上檢測到的磷酸鹽和PTEN 通過AKT 途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，NA通過上調(diào)PTEN 抑制人的膽管癌細(xì)胞生長，支持PTEN 作為人膽管癌的新型化學(xué)治療的可行性。

2.2 ras 基因

Ras 基因由K-Ras、N-Ras 和H-Ras 組成。引起膽管癌的RAS 基因主要是K-RAS 和N-RAS。肝外膽管癌K-ras 基因點突變可用于區(qū)分ECC 與良性膽管病變[24]。K-ras 基因點突變多見于膽管的癌變區(qū)或癌前病變，其密碼子第12 位點突變，可使其編碼的甘氨酸變?yōu)樘扉T冬氨酸，而膽管良性病變無K-ras 點突變，提示了ras 基因與肝外膽管癌的潛在相關(guān)性。ras 相關(guān)底物(Ras correlative C3 creotoxin substrate 1，Rac1)，是內(nèi)皮細(xì)胞功能關(guān)鍵介體的一種小的鳥苷三磷酸酶。Liu 的研究[30]表明在74 例肝外(ECC) 標(biāo)本和相匹配的相鄰正常黏膜，Rac1 在腫瘤組織中的表達(dá)明顯較高(53.12%)。阻止Rac1 表達(dá)可有效抑制癌細(xì)胞的生長。Rac1 基因的miRNA 沉默抑制增殖并誘導(dǎo)QBC939 細(xì)胞凋亡。其結(jié)果提示Rac1 可能是ECC 的新基因治療靶標(biāo)。

2.3 p16 基因

p16 基因又稱MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994 年由美國率先報道的新型腫瘤抑制基因。定位于9 號染色體q21，編碼產(chǎn)物是一種相對分子質(zhì)量為16×103的蛋白，可直接作用于細(xì)胞周期素依賴激酶4(cyclin dependent kinase 4，CDK4)、CDK6 及周期素 D(cyclin D)等，抑制細(xì)胞從G1 期向S 期轉(zhuǎn)變，起到改變細(xì)胞周期的作用，被認(rèn)為是一個重要的腫瘤抑制基因。p16 基因缺失及突變在人類的惡性腫瘤中普遍存在。Li 等[25]的研究結(jié)果揭示了Cul4B(Cullin 4B，一種組裝泛素連接酶復(fù)合物的支架蛋白)的表達(dá)可以作為ECC 患者的預(yù)后標(biāo)志物，并發(fā)現(xiàn)Cul4B 抑制腫瘤抑制基因P16 的表達(dá)，揭示了p16 與ECC 的潛在聯(lián)系。

2.4 c-myc 基因

c-myc 基因位于8 號染色體q24 上，基因編碼的的蛋白產(chǎn)物是p62，能使細(xì)胞無限增殖，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。有研究[26]顯示膽管癌細(xì)胞中膜內(nèi)蛋白水解介導(dǎo)的上皮細(xì)胞粘附分子胞外域(EpEx)和胞內(nèi)域(EpICD)的過表達(dá)顯著增加細(xì)胞生長和增殖。其過表達(dá)也增加了活性形式的β-連環(huán)蛋白和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)靶基因(例如c-myc 和cyclinD1)的表達(dá)水平，同樣EpICD 的過表達(dá)顯著增強(qiáng)了ECC細(xì)胞的遷移和侵襲性。表明c-myc 的表達(dá)與ECC 細(xì)胞遷移、侵襲性等潛在的關(guān)系，EpICD 的空間定位及其與β-連環(huán)蛋白的相互作用可能在ECC 進(jìn)展和侵襲中很重要。

2.5 Bcl-2 基因

Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2) 是從 B 細(xì)胞濾泡性淋巴瘤中分離出來的首個被認(rèn)為有抑制凋亡作用的基因，位于18 號染色體q21 位點。其過度表達(dá)已被證實存在于多種腫瘤組織。Eva 等[27]通過免疫組織化學(xué)分析了在組織微陣列中組合的128 個腫瘤組織(42 個肝內(nèi)膽管癌，70 個ECC和16 個膽囊癌)，與正常組織(29 例)相比，CCA 表達(dá)p53，bcl-2，bax 和COX-2 的頻率更高，數(shù)據(jù)顯示p53，bcl-2，bax和COX-2 在CCA 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。ECC 中p16，bcl-2 和p53 的差異表達(dá)表明，在表型和遺傳譜中存在位置相關(guān)的差異，進(jìn)一步支持了P53、p16 以及bcl-2 與ECC 的潛在聯(lián)系。

2.6 RASSF1 基因

RASSF1 基因是于2000 年Dammnn 于3 號染色體 p21.3 發(fā)現(xiàn)的一種新型抑癌基因。因其核苷酸序列C 端與小鼠 RAS 效應(yīng)蛋白 Nore1 的同源性很高，故得名 RAS association domain family 1(RAS 相關(guān)區(qū)域家族 1)。陳勇軍等[28]檢測 48 例ECC 組織及 12 例癌旁組織中的 RASSF1A 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn) RASSF1A 在ECC 組織中轉(zhuǎn)錄表達(dá)缺失陽性率可達(dá) 68.75%，并且其缺失與ECC 的轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。RASSF1 作為一種新型的抑癌基因可能為早期診治ECC 提供一些新的道路。

3 小結(jié)

根據(jù)《2020 年NCCN 肝膽腫瘤臨床實踐指南(V1 版)》提示，肝外膽管癌可將CEA 和CA-199 作為新增的基線檢查，但同時提示其特異性較低[29]。目前，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果證實ECC 與鄰近非癌組織之間存在差異基因表達(dá)。這些功能失調(diào)基因可能與已知的ECC 相關(guān)的生物學(xué)過程和途徑有關(guān)，提示這些基因具有潛在的研究價值。綜上所述，轉(zhuǎn)錄組測序的研究不僅有效地從基因水平揭示ECC 的病理生理機(jī)制，對差異基因的研究也有助于ECC 的早期診斷和治療。