恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在下呼吸道感染常見病原體檢測中的臨床應(yīng)用

李素娟 汪環(huán) 徐麗娟 牛臘梅

【摘要】目的：研究在下呼吸道感染中恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)痰液樣本中病原體檢測的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：選取本院2019年11月至2020年1月間收集的143例下呼吸道感染患者，采用恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測患者的痰液樣本，同時(shí)以傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法（培養(yǎng)法）與之進(jìn)行比較，判斷其在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。結(jié)果：采用恒溫?cái)U(kuò)增芯片法和培養(yǎng)法共檢測了143例下呼吸道痰液樣本，其中，總體恒溫?cái)U(kuò)增芯片法的陽性檢出率61.54，高于病原分離培養(yǎng)的檢出率25.87%。兩種方法的檢測結(jié)果一致性為64.34%，其中，肺炎克雷伯菌（Kappa=0.848）和金黃色葡萄球菌（Kappa=0.632）的檢出情況在兩種方法下的一致性較高。結(jié)論：相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法可以快速地檢測常見病原體，檢測時(shí)間短，且檢測結(jié)果更加靈敏，陽性率更高，可以輔助臨床快速、準(zhǔn)確判斷下呼吸道感染的致病原，有針對(duì)性地用藥和治療。

【關(guān)鍵詞】恒溫?cái)U(kuò)增芯片法;LAMP;培養(yǎng)法

[中圖分類號(hào)]R446.5：R56 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2021）01-0142-03

下呼吸道感染（lower respiratory tract infections，LRTIs）是一種臨床上的常見病、多發(fā)病[1]，嚴(yán)重威脅著人類的健康，由于大氣污染、人口老齡化、吸煙等多種因素，數(shù)據(jù)顯示成人死亡中下呼吸道感染者約占3%～5%[2]，居高不下的發(fā)病率和死亡率居給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。下呼吸道感染疾病可感染的病原體類型多樣，包括細(xì)菌、病毒、非典型病原體等。復(fù)雜的疾病類型加上多樣的病原體，導(dǎo)致臨床上普遍存在著對(duì)LRTIs確診難、用藥難的情況，因此，在治療LRTIs方面，及早明確病原體是極為關(guān)鍵的[3]。本研究采用恒溫?cái)U(kuò)增芯片法與傳統(tǒng)病原菌培養(yǎng)法，對(duì)143例LRTIs疑似患者進(jìn)行了病原檢測，初步了解新型的恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在臨床上的應(yīng)用價(jià)值。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年11月至12月在蘭州市第一人民醫(yī)院就診的143例LRTIs患者，其中男80例（55.9%，80/143）、女63例（44.1%，63/143），采集深部痰液樣本作為研究對(duì)象，年齡2～93歲，臨床診斷主要為發(fā)熱、咳嗽咳痰或咳血、社區(qū)獲得性肺炎、支氣管肺炎、急性支氣管炎、慢性肺心病等常見下呼吸道感染疾病。

1.2 儀器和試劑 試劑來源于北京博奧生物研發(fā)的呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增芯片法），該試劑盒檢測結(jié)果由博奧生物集團(tuán)有限公司研發(fā)的RTisochipTM-A恒溫?cái)U(kuò)增芯片核酸分析儀進(jìn)行分析。低速離心機(jī)（用于離心恒溫?cái)U(kuò)增芯片）、200μL離心管、微量移液器（規(guī)格：10～100μL）以及各種規(guī)格的離心架都是本實(shí)驗(yàn)室配置。

1.3 方法 ①恒溫?cái)U(kuò)增芯片法：按照試劑盒的要求采集所有患者痰液標(biāo)本，同時(shí)處理樣本并提取核酸，運(yùn)用微流控芯片、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，利用具有鏈置換功能的聚合酶在65℃恒溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，應(yīng)用熒光染料摻人法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測，擴(kuò)增陽性的樣品會(huì)產(chǎn)生類似實(shí)時(shí)熒光恒溫的“S”形擴(kuò)增曲線，一步完成對(duì)靶基因的擴(kuò)增和檢測。應(yīng)用核酸分析儀展開分析，一步完成檢測13種常見下呼吸道病原菌，包括流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群等[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析和處理，用x2檢驗(yàn)、例（%）表示計(jì)數(shù)指標(biāo)，當(dāng)P<0.05，說明差異顯著。采用Kappa分析一致性，在Kappa>0.4的情況下表示檢驗(yàn)結(jié)果具有一致性。

2 結(jié)果

2.1 分析恒溫?cái)U(kuò)增芯片法 檢出下呼吸道感染常見病原體的情況在143例痰液標(biāo)本中，共檢出88例呼吸道病原體陽性標(biāo)本，整體陽性率為61.54%（88/143）。單種病原體感染樣本49例（55.68%，49/88），混合感染樣本39例（44.32%，39/88），其中以肺炎支原體、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及流感嗜血桿菌混合感染占多數(shù)。88例陽性標(biāo)本中檢出12種共134株呼吸道病原體，其中檢出率占比前三位的分別為流感嗜血桿菌占32.84%（44/134），肺炎鏈球菌占26.12%（35/134），肺炎支原體占14.18%（19/134）。本次樣本中未檢出嗜肺軍團(tuán)菌，詳見表1。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)法 對(duì)下呼吸道感染常見病原體的檢出情況143例的痰液標(biāo)本中，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，其中37例標(biāo)本培養(yǎng)出病原體，整體陽性率25.87%（37/143），其中單種病原感染樣本32例（86.49%，32/37），混合感染樣本僅5例（13.51%，5/37），包括4例肺炎鏈球菌和其他病原體的混合感染，以及1例鮑曼不動(dòng)桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌的混合感染。同時(shí)，37例陽性標(biāo)本中共檢出9種40株常見的病原體，其中檢出率占比前三位的分別為流感嗜血桿菌占25.00%（10/40）、肺炎鏈球菌占30.00%（12/40）、金黃色葡萄球菌占17.50%（7/40），詳見表2。

2.3 恒溫?cái)U(kuò)增芯片法與培養(yǎng)法 對(duì)下呼吸道常見病原體檢出情況的結(jié)果比較對(duì)共計(jì)143例樣本同時(shí)進(jìn)行了恒溫?cái)U(kuò)增芯片法與培養(yǎng)法的檢測，結(jié)果顯示：恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測出病原體陽性的樣本共88例，總陽性率為61.54%（88/143），遠(yuǎn)高于培養(yǎng)法的檢測陽性率25.87%（37/143）。其中，芯片法與痰培養(yǎng)兩組結(jié)果均陽性37例，陰性55例，50例芯片法檢測陽性、痰培養(yǎng)結(jié)果陰性，1例芯片法檢測陰性、痰培養(yǎng)陽性。兩種檢測結(jié)果的一致性為64.34%（92/143），陽性符合率為25.87%（37/143），陰性符合率為38.46%（55/143），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=23.657，P=0.000），詳見表3。

而對(duì)于不同種病原菌的檢出情況比較，肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌在兩種檢測方法中的一致性都較高;其中，檢出一致性較好的前三位分別為肺炎克雷伯（Kappa值為0.848）、金黃色葡萄球菌（Kappa值為0.623），耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Kappa值為0.579）;嗜麥芽窄食單胞菌在兩種方法中都是在混合感染中被檢出，并且不具備一致性。

3 討論

本項(xiàng)研究采用的主要方法是恒溫?cái)U(kuò)增芯片法，該檢測方法是將微流控生物芯片技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合。因該檢測技術(shù)不需要模板的變性、退火的溫度變化過程，1h內(nèi)可完成檢測，可大大縮短檢測周期[6]。

本研究結(jié)果表明恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測病原體陽性的樣本共88例，其中混合感染占39例，總陽性率為61.54%（88/143），遠(yuǎn)高于培養(yǎng)法的檢測陽性率25.87%（37/143）。本研究結(jié)果也與之前的研究報(bào)道門類似，而從方法學(xué)本身的比較中可推論，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法較傳統(tǒng)培養(yǎng)法病原體檢出率高的原因可能在于：（1）傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)對(duì)于樣本來源、樣本條件、操作要求等多方面要求較高，導(dǎo)致陽性率不高;（2）恒溫?cái)U(kuò)增芯片法能夠從極微量的病原體遺傳物質(zhì)中進(jìn)行拷貝和擴(kuò)增，檢測靈敏度較高;（3）有些病原體，比如流感嗜血桿菌，服藥后，培養(yǎng)陽性率會(huì)降低?？梢钥闯觯瑑煞N方法的陽性和陰性符合率都比較低，一致性也不高，這可能與傳統(tǒng)痰液培養(yǎng)法病原體檢出率較低及部分病原菌無法培養(yǎng)、培養(yǎng)周期較長等因素相關(guān)[s]o

對(duì)本院的下呼吸道病原體分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得出，本研究中的88例陽性標(biāo)本中檢出12種共134株呼吸道病原體，其中檢出率占比前三位的分別為流感嗜血桿菌占32.84%（44/134），肺炎鏈球菌占26.12%（35/134），肺炎支原體占14.18%（19/134）與文獻(xiàn)報(bào)道基本吻合。此次研究的樣本絕大多數(shù)是來自兒科的樣本，共檢出19例肺炎支原體和3例肺炎衣原體，肺炎支原體的檢出率為14.18%，排在第三位，與文獻(xiàn)報(bào)道情況吻合。對(duì)于支原體、衣原體等非典型病原體，是無法通過培養(yǎng)法進(jìn)行檢測的，說明恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在非典型病原體感染的診斷中有更好的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法可以快速地檢測常見病原體，檢測時(shí)間短，且檢測結(jié)果更加靈敏，陽性率更高，可以輔助臨床快速、準(zhǔn)確判斷下呼吸道感染的致病原，有針對(duì)性地用藥和治療。

參考文獻(xiàn)

[1]王詠紅，郭雅潔，陳玉瑩，等.恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在兒童下呼吸道感染性疾病中的應(yīng)用價(jià)值評(píng)估[J].中國循證兒科雜志，2018，13（3）：176-179.

[2]廖魯燕，趙明偉，楊國峰.RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)黃光檢測技術(shù)對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷價(jià)值[J].中國防癆雜志，2018，40（1）：84-86.

[3]劉志遠(yuǎn)，潘健，張婷菊，等.恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在下呼吸道病原體檢測中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14（8）：1052-1053.

[4]李輝騰，郭旭光，陳瑞娟，等.熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測嗜肺軍團(tuán)菌方法的建立[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，38（22）：3136-3138.

[5]楊俊發(fā)，柴曉宇，許飛.LAMP技術(shù)在肺部非典型感染病原體檢測中的應(yīng)用[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（18）：2122-2124.

[6]周杰。張莉，張鮑虎，等.RNA恒溫?cái)U(kuò)增法在肺炎支原體檢測中的應(yīng)用[J].海南醫(yī)學(xué)，2017，28（9）：1433-1435.

[7]陳愉生，王大璇，李鴻茹，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在下呼吸道感染常見病原體檢測中的應(yīng)用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2014，34（4）：270-273.

[8]王詠紅，郭雅潔，陳玉瑩，等.恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在兒童下呼吸道感染性疾病中的應(yīng)用價(jià)值評(píng)估[J].中國循證兒科雜志，2018，13（3）：176-179.