膠體金免疫層析技術(shù)在豬病毒病診斷中的應(yīng)用與研究進展

肖璐，謝晶，曹冶，葉勇剛，于吉鋒，廖黨金，林毅，李興玉，魏勇，葉健強，潘夢，康潤敏

(四川省畜牧科學(xué)研究院動物遺傳育種四川省重點實驗室,四川 成都 610066)

膠體金(colloidal gold)又叫金溶膠，是氯金酸在還原劑的作用下形成一種帶有負電荷的穩(wěn)定的疏水金顆粒懸液，膠體金顆粒能夠?qū)Χ喾N生物高分子物質(zhì)進行吸附結(jié)合，且這種結(jié)合不會影響其生物特性，是免疫反應(yīng)的理想標(biāo)記物。膠體金標(biāo)記技術(shù)以膠體金顆粒為核心，將其作為示蹤標(biāo)志物，是一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金檢測技術(shù)主要包括：斑點免疫金滲濾法(dot immunogold filtration assay, DIGFA)和膠體金免疫層析法(immunochromatographic test strip, ICST)，目前在豬病診斷、檢測領(lǐng)域中使用最為廣泛的當(dāng)屬ICST。

1 研究背景及原理

在1857年，英國學(xué)者采用還原法從氯金酸水溶液中成功地制備出了膠體金，并發(fā)現(xiàn)了其能發(fā)生顏色變化，這一發(fā)現(xiàn)對膠體金技術(shù)發(fā)展具有重要的意義。上世紀(jì)60年代Feldherr等提出以膠體金作為電子顯微鏡的示蹤標(biāo)志物；70年代，F(xiàn)aulk等首次建立了基于膠體金的檢測技術(shù)，開創(chuàng)了該技術(shù)在免疫分析領(lǐng)域應(yīng)用的先河；80年代末至90年代初，Spielberg等研究學(xué)者為了檢測抗HIV的斑點免疫金滲濾試驗從而最早地建立了DIGFA，Beggs等建立了一種更加簡便快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，即ICST，最早用于人尿和血清中HCG的檢測。此后，膠體金作為一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)得到很快發(fā)展。

ICST以硝酸纖維素膜為載體，利用毛細管作用將已知的特異性抗原或抗體固定于膜上作為檢測帶；將膠體金標(biāo)記物置于玻璃纖維的結(jié)合釋放墊上干燥，一端與膜相連，另一端與樣品墊相連，當(dāng)加入液體待測品后，樣品通過樣品墊毛細管的擴散作用向前移動，隨后通過含標(biāo)記物的玻璃纖維，使標(biāo)記物重新水化，并與膠體金標(biāo)記物相互反應(yīng)，然后一起向前泳動至檢測線，陽性反應(yīng)時，會出現(xiàn)直觀的紅線，陰性反應(yīng)則不見顏色變化。

2 膠體金技術(shù)在豬病診斷中的應(yīng)用

2.1 在豬病毒性腹瀉診斷中的應(yīng)用

豬腹瀉病是現(xiàn)代規(guī)模集約化養(yǎng)豬場的一種最為常見的多因素性疾病，在豬的疾病中出現(xiàn)腹瀉癥狀的占30%40%，仔豬腹瀉發(fā)病率更高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。引起豬腹瀉性疾病的病毒主要以豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、A型豬輪狀病毒(porcine rotavirus group A)為主。膠體金檢測技術(shù)簡單快速、高效靈敏、檢測結(jié)果直觀且明顯，尤其適合豬場或基層檢測豬腹瀉病毒。李嘉琛[1]將膠體金顆粒標(biāo)記TGEV的N蛋白單克隆抗體，以羊抗小鼠IgG和單克隆抗體N蛋白分別作為質(zhì)控線和檢測線，建立了TGEV ICST技術(shù)檢測方法，其檢測靈敏度可達1.02.0TCID50/0.1 mL。汪懌旸等[2]基于單克隆抗體 mAb-C11建立了一種基于膠體金技術(shù)的PEDV快速檢測方法，最低檢測限度可達310個TCID50病毒量。劉兆磊等[3]在硝酸纖維素膜上噴加純化的抗豬輪狀病毒VP6蛋白多克隆抗體和羊抗鼠IgG，建立了豬輪狀病毒ICST檢測方法，該方法最低可檢出1∶32稀釋的病毒培養(yǎng)液(TCID50為10-6.25/0.1 mL)。Li等[4]也選擇了N蛋白，建立了PEDV ICST技術(shù)，與商業(yè)試劑盒檢測結(jié)果相比，此方法能在10 min內(nèi)完成檢測，其靈敏度、特異性分別可達96.0%、90.8%。Lyoo等[5]建立的PEDV ICST技術(shù)，其檢測限度可達104.0TCID50/mL，與RT-PCR檢測技術(shù)相比，所建立方法對糞便樣品的檢測靈敏度和特異性分別達到95%和98.6%。

2.2 在豬圓環(huán)病毒病診斷中的應(yīng)用

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)主要引起豬多系統(tǒng)功能障礙類疾病，同時，PCV2會侵害免疫系統(tǒng)，造成豬的免疫抑制，引發(fā)其他繼發(fā)感染，導(dǎo)致豬群死亡。此病在世界各國普遍存在、蔓延，給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了較大威脅和經(jīng)濟損失。時建立等[6]將膠體金顆粒標(biāo)記PCV2 Cap蛋白和兔IgG，包被至玻璃纖維膜上制備金標(biāo)墊，再將抗原和羊抗兔IgG分別包被至檢測線與質(zhì)控線上，建立了檢測PCV2 ICST檢測方法并組裝檢測卡，與常規(guī)PCV2 ELISA商品化試劑盒的檢測符合率高于95%。張禹等[7]基于G蛋白，以PCV2病毒顆粒和兔IgG分別作檢測線與質(zhì)控線組裝成膠體金試紙條，樣品檢測結(jié)果顯示與ELISA總符合率達到98%，賈蕊[8]選擇Cap蛋白，組建了可在5 min內(nèi)完成檢測的PCV2 ICST檢測試劑盒，其檢測靈敏度為1∶25 600，該試紙條可室溫儲存6個月，274份血清樣品檢測結(jié)果與ELISA商品試劑盒的總符合率為98.17%。Jin等[9]選擇PCV2的Cap蛋白，組建了PCV2 ICST技術(shù)，500份臨床血清樣品檢測結(jié)果與商業(yè)化ELISA試劑盒的符合率達到94%，所建立技術(shù)特異性良好，檢測效率較高。

2.3 在豬口蹄疫診斷中的應(yīng)用

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)感染偶蹄類動物而引發(fā)的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，F(xiàn)MDV有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3及Asia1型，口蹄疫流行廣、傳播快、發(fā)病率高，曾多次在世界范圍內(nèi)發(fā)生大流行，對畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的威脅。 朱玉嬋等[10]采用膠體金為標(biāo)記物制備了快速定量檢測Asia1型FMDV ICST檢測方法，擬合檢測曲線，用金標(biāo)分析儀實現(xiàn)了定量檢測，該方法特異性強、敏感性高，15 min內(nèi)可完成檢測，最低檢出限度達到0.78 μg/mL。孫燕燕等[11]將膠體金顆粒與口蹄疫 A型疫苗株 146S 病毒粒子結(jié)合，作為金標(biāo)抗原，與其抗體分別作為檢測帶與質(zhì)控帶，組裝A型FMDV ICST檢測試紙條，該試紙條特異、靈敏、穩(wěn)定性高，最低檢測抗體效價達到1∶128。Yang等[12]建立了O型FMDV ICST技術(shù)，可在5 min內(nèi)完成檢測，其檢測靈敏度可達95% (38/40)，且與其他病毒抗體無交叉反應(yīng)，與ELISA商品試劑盒的檢測效率相當(dāng)。 Kanatbek等[13]首先表達了FMDV的特異性重組蛋白2C、3A、3B及3D，分別基于此4種蛋白建立了FMDV ICST檢測技術(shù)，基于所建立的技術(shù)和商業(yè)化試劑盒同時對100份健康未免疫牛血清樣品、25份陽性牛血清樣品、90份健康經(jīng)免疫血清進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其符合率均超過90%，且基于2C的ICST檢測效果最佳，但總體而言仍有5%～9%的假陽性率。

2.4 在豬繁殖與呼吸綜合征診斷中的應(yīng)用

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的豬的一種傳染性極高的繁殖障礙與呼吸系統(tǒng)傳染病，以免疫抑制為特征，入侵機體后可破壞免疫系統(tǒng)，造成嚴(yán)重免疫抑制和混合感染，其暴發(fā)與流行給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，危害嚴(yán)重。吳斌等[14]基于膠體金技術(shù)，以PRRSV多克隆抗體，HP-PRRSV單克隆抗體及羊抗鼠IgG二抗分別作為檢測線和質(zhì)控線，建立了PRRSV抗ICST檢測技術(shù)，其最低檢測限度為100 TCID50，60份臨床樣品檢測結(jié)果與PRRSV RT-PCR診斷試劑盒檢測結(jié)果的符合率達到91%。Yu等[15]也基于N蛋白，建立了PRRSV ICST技術(shù)，用所建立方法對來自韓國71家豬場的991份經(jīng)檢測的、已知PRRSV陰陽性的血清樣品進行檢測，結(jié)果顯示該方法的靈敏度達97.5%，其特異性達91.1%，此結(jié)果與PRRSV ELISA商品試劑盒的結(jié)果接近。Li等[16]選擇了PRRSV的NSP7蛋白，構(gòu)建了PRRSV的膠體金檢測方法，1 034份血清樣品檢測結(jié)果顯示，膠體金免疫層析與2種不同的ELISA商業(yè)試劑盒的總體符合率分別達到91.7%、88.9%，由此說明ICST技術(shù)在PRRSV的快速診斷中具有一定的優(yōu)勢。

2.5 在豬瘟診斷中的應(yīng)用

豬瘟(classical swine fever, CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸性烈性傳染病，豬感染后表現(xiàn)為高熱稽留，全身多發(fā)性出血、母豬繁殖障礙等，該病被OIE列為種類法定通報的動物傳染病之一，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為“一類動物疫病”。王澤洲等[17]以純化的豬瘟病毒(CSFV)重組E2蛋白和純化全病毒為抗原，用鑭系元素銪為熒光標(biāo)記，建立了檢測豬瘟抗體的鑭系熒光ICST快檢試劑盒，該試劑盒特異性強，穩(wěn)定準(zhǔn)確，其批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于5%和10%。王向鵬等[18]基于CSFV E2蛋白的單克隆抗體，組裝了CSFV ICST檢測試紙條，其最低檢測限度可達到103.5TCID50，且與常見的豬病毒無交叉反應(yīng)，可區(qū)分CSFV的野毒株和弱毒株。Ren等[19]同樣基于保守的E2蛋白，建立了CSFV ICST檢測方法，與商業(yè)化試劑盒的檢測結(jié)果一致性超過93%。Li等[20]選擇CnC2 蛋白，建立了CSFV ICST檢測技術(shù)，通過對各血清型CSFV菌株的敏感性測試可知，檢測結(jié)果的敏感性達到97%(65/67)，檢測特異性達到100%(98/98)，結(jié)果與現(xiàn)有的商品化試劑盒一致，相關(guān)系數(shù)達到0.935。

2.6 在豬偽狂犬病診斷中的應(yīng)用

豬偽狂犬病(pesudorabies, PR)由豬偽狂犬病毒(pesudorabies virus, PRV)引起多種家畜、野生動物的一種以發(fā)熱、腦脊髓炎為主的急性傳染病。PRV一旦進入豬群，其凈化難度較大，危害難以根除。李曦等[21]以PRV gE蛋白和兔抗鼠IgG分別作為T線和C線，組裝了PRV ICST試劑條，184份樣品的檢測結(jié)果顯示，與PRV gE ELISA商品檢測試劑盒的檢測結(jié)果相比較，該組裝試紙條檢測的特異性為81.6%，敏感度為90.7%。雷有玲等[22]基于重組gE蛋白和豬IgG分別作為檢測線和質(zhì)控線，組裝了檢測PRV ICST檢測試紙條，其與商品化試劑盒檢測結(jié)果的符合率高于95%，可穩(wěn)定保存6個月，檢測PRV野毒陽性血清的靈敏度可達1∶1 280。邱榮超等[23]以膠體金標(biāo)記了gB蛋白作為探針，建立了PRV ICST快速檢測試紙條，其敏感性與商品化試劑盒符合率可以達到91.04%。Shen等[24]研發(fā)了一種PRV熒光免疫層析檢測試紙條(F-ICS)，最低檢測限度為0.13 ng/mL，檢測線范圍(DLR)為0.13～2.132 ng/mL，最低檢測線比普通的試紙條還低10倍，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，此技術(shù)與PCR的檢測結(jié)果一致。Li等[20]也選擇糖蛋白gB作為膠體金標(biāo)記，把葡萄糖球菌蛋白A和gB抗體分別接種于鮮花纖維膜上組裝了膠體金試劑盒，結(jié)果顯示條帶的特異性為98.1%，與對照抗PRV血清的敏感性為96.0%，296份血清樣品檢測結(jié)果顯示與商業(yè)化試劑盒相比一致性達到93.6%。

2.7 在其他豬病毒病診斷中的應(yīng)用

此外，ICST技術(shù)在豬乙型腦炎、非洲豬瘟、豬流感等常見豬病診斷中也有報道[25-29]。其中，乙型腦炎病毒膠體金免疫層析檢測技術(shù)能明顯區(qū)別陰陽性血清，其靈敏度與特異性分別可達到84.8%、97.7%。組裝的非洲豬瘟病毒膠體金免疫層析試劑盒能檢測到的重組蛋白最低濃度可達45 ng/mL。目前針對豬流感病毒的膠體金免疫層析技術(shù)涉及H1N1、H3及H1N1、H3二聯(lián)膠體金，其檢測效率高，特異性強。

3 膠體金免疫層析技術(shù)的優(yōu)點與瓶頸

膠體金作為示蹤標(biāo)記物在基礎(chǔ)研究和檢驗檢疫中應(yīng)用十分廣泛，ICST與PCR、熒光定量PCR(qPCR)、ELISA、病原分離鑒定等常見病毒檢測技術(shù)相比，其優(yōu)勢十分明顯(表1)。首先，快捷簡便，結(jié)果直觀。ICST檢測試紙條體積小、便攜且操作快速簡便，5 min內(nèi)可根據(jù)顏色變化判讀結(jié)果，而PCR結(jié)果還需借助凝膠電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)，qPCR需通過熒光定量PCR儀讀取數(shù)據(jù)，ELISA則需要酶標(biāo)讀數(shù)儀讀取吸光度，PCR、qPCR和ELISA檢測耗時在3 ～4 h，而病原分離鑒定的檢測則周期更長。第二，安全。ICST安全無污染，而另外3種檢測技術(shù)中均可能接觸有害試劑，安全性均不及ICST。第三，成本低。ICST檢測完全不需要特殊或昂貴儀器設(shè)備，也不需專業(yè)技術(shù)人員，檢測成本低廉。因此ICST簡單、快速、成本低廉，更適用于現(xiàn)場和基層直接檢測應(yīng)用，適合批量檢測和篩查，普適性強。第四，不需樣品處理。ICST檢測時，不需要對樣品進行前處理，而PCR、qPCR需要提取樣品核酸，ELISA需要高速離心后分離樣品血清，病原分離鑒定則需要對樣品進行研磨或破碎處理。

表1 幾種常見檢測方法的比較

ICST是動物疫病快速診斷領(lǐng)域的一個重要的發(fā)展方向，優(yōu)勢突出，但也存在一些發(fā)展瓶頸。首先，通過顏色進行結(jié)果判讀，只能作為定性檢測，無法實現(xiàn)定量或半定量檢測，且在組織樣品檢測時ICST并不適用；其次，采用ICST檢測時，一次檢測僅能獲得一個樣品的單一對應(yīng)結(jié)果，還未實現(xiàn)多重檢測，且目前看來ICST的多重檢測存在一定的技術(shù)難度，在多重或混合靶標(biāo)的篩查中發(fā)展受限；第三，與PCR、qPCR或ELISA相比，ICST靈敏度和特異性仍有待提升，尤其是糞便等樣品檢測中，當(dāng)病毒含量較低時，檢出率不如分子學(xué)及免疫學(xué)檢測技術(shù)，因此ICST更適合普篩，不能滿足標(biāo)準(zhǔn)或高要求的檢測需求。

4 小結(jié)與展望

隨著現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，密集型、集約化的飼養(yǎng)模式穩(wěn)步發(fā)展，伴隨日益發(fā)達的豬群的跨區(qū)域流通貿(mào)易，無形之間增加了豬群間的接觸幾率，從而加速了疾病的傳播概率，豬群多疾病混合感染的日益漸增，引發(fā)豬群死亡，造成巨大的損失。PRV、CSFV、乙型腦炎病毒(JEV)、PCV2、PRRSV、FMDV及豬細小病毒(PPV)等是豬群中主要的重要豬病毒性病原，常常混合感染，目前，獸醫(yī)實驗室診斷常用技術(shù)仍以核酸檢測或血清檢測為主，但是該方法均耗時長、操作過程復(fù)雜、檢測成本高且對檢測人員有一定的技術(shù)要求，因此與ICST相比，其普適性較低。ICST作為一種新的免疫學(xué)方法，有著檢測快速、價格低廉、操作簡單、攜帶方便、安全無污染等特點，在動物檢驗檢疫中有著廣泛的應(yīng)用前景，但其準(zhǔn)確性及靈敏性仍有待提升，以期獲得更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，其檢測范圍也有待擴大，以便適用于更廣泛的檢測范圍?？傮w而言，膠體金免疫層析技術(shù)的出現(xiàn)及推廣可極大地降低臨床、基層及偏遠落后地區(qū)的病原檢測難度，有其重要的應(yīng)用必要性和不可取代性，對實現(xiàn)我國動物檢疫工作的科學(xué)化、標(biāo)準(zhǔn)化和快捷化具有重要意義。