臨床疑似病例中火雞組織滴蟲的檢測及其在臟器分布規(guī)律

戎杰，孔令明，陳喬光，侯照峰，劉丹丹，陶建平，許金俊*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

組織滴蟲病又稱黑頭病或盲腸肝炎，是由火雞組織滴蟲(Histomonasmeleagridis)引起的一種禽類原蟲病，以盲腸腫大、肝臟嚴(yán)重壞死以及排硫磺樣糞便為主要臨床特征[1-2]。多年以來，化學(xué)藥物一直是防治組織滴蟲病的主要手段，發(fā)揮了巨大的作用。由于對人體潛在的毒性和致癌性，歐盟已完全禁用所有對組織滴蟲病具有療效的化學(xué)藥物，美國也已禁止使用除硝基苯胂酸以外的其他化學(xué)藥物[3]，我國農(nóng)業(yè)部第193號公告中也將硝基咪唑類藥物列入《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》[4],因而導(dǎo)致該病在雞群和火雞群中大量暴發(fā)和流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。盡管部分天然植物提取物已被證實對蟲體的體外繁殖具有一定的抑制作用，但對自然或人工感染的組織滴蟲病療效甚微[7]，因此，針對該病的安全可靠的新藥或疫苗的研制顯得尤為迫切。

火雞組織滴蟲人工感染后在禽類體內(nèi)的分布規(guī)律有少量報道[8]，而自然感染雞組織臟器中蟲體的分布規(guī)律還不太清楚。本研究通過對2018年4至5月期間揚(yáng)州大學(xué)動物醫(yī)院21例臨床疑似組織滴蟲病的病雞體內(nèi)321個臟器組織中蟲體DNA 的PCR檢測，揭示臨床自然感染雞組織臟器中蟲體的分布規(guī)律，為闡明火雞組織滴蟲的致病機(jī)理和傳播途徑，以及藥物和疫苗的效果評價提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床病料

病料來自于2018年4至5月期間揚(yáng)州大學(xué)動物醫(yī)院接診的組織滴蟲病臨床疑似病例21例，這些病雞來自于江蘇省揚(yáng)州市及周邊地區(qū)，有散養(yǎng)草雞、商品蛋雞、三黃雞等多個品種，年齡通常在1至2月齡。所采取的組織臟器有：肝臟、胰腺、膽囊、食道、腺胃、肌胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、氣管、肺臟、心臟、腎臟、腦、脾臟、法氏囊和盲腸扁桃體共19種組織器官，共有321份組織器官樣品。

1.2 主要試劑

DL2000 Marker、MiniBEST通用基因組DNA提取試劑盒Ver.5.0購自TaKaRa公司；1 kb DNA Ladder、10×PCR Buffer、dNTP mix、TaqDNA聚合酶購自上海生工生物工程有限公司；含火雞組織滴蟲 18S rRNA 基因的陽性質(zhì)粒 pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA 由本實驗室構(gòu)建并保存；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 樣品DNA的提取

按照TaKaRa公司的DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，用NanoDrop2000測定純度和濃度后-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 臟器中火雞組織滴蟲蟲體DNA的PCR檢測

按照參考文獻(xiàn)[9]設(shè)計擴(kuò)增火雞組織滴蟲18S rRNA基因片段的引物，預(yù)期擴(kuò)增片段576 bp,引物由北京六合華大基因公司合成，序列如下：F1:5′-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3′；F2:5′-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：ddH2O 18.25 μL，10× PCR Buffer 2.50 μL，10 mol/L dNTP mix 2.00 μL，10 μmol/L F1 0.50 μL，10 μmol/L F2 0.50 μL，50 ng/μLTaqDNA聚合酶0.25 μL，DNA模板1.00 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性35 s，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用1.2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，EB染色15 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。每次PCR檢測時設(shè)立pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA 為模板的陽性對照和以滅菌水為模板的陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 病雞臨床表現(xiàn)和剖檢變化

病雞臨床表現(xiàn)為：精神沉郁、縮頭垂翅、被毛蓬亂而無光澤、呆立或聚堆，排黃綠色稀糞，糞便中甚至有時帶有組織碎片和血液。病雞解剖可見：肝臟腫大，表面存在稍凹陷的圓形潰瘍灶，數(shù)量和大小不等，有時會相互融合形成大面積潰瘍區(qū)(圖1A)，少數(shù)病雞肝臟上黃白色的壞死點散在分布(圖1B)；盲腸則顯著腫大，盲腸壁增厚明顯，內(nèi)有栓塞物，黏膜呈現(xiàn)出血、壞死和潰瘍(圖1C)；其他組織臟器病變不明顯。

A：典型肝臟病變；B：非典型肝臟病變；C：典型盲腸病變圖1 疑似組織滴蟲病病雞的肝臟與盲腸

2.2 PCR檢測

將臨床病料組織樣品提取DNA后進(jìn)行PCR檢測，部分臟器的PCR檢測凝膠電泳結(jié)果見圖2，其中陽性對照在576 bp處有條帶，樣品中呈陽性的在576 bp 處也出現(xiàn)條帶，而陰性對照無條帶。所有樣品的PCR檢測統(tǒng)計結(jié)果見表2。由表2可見，不同臟器蟲體檢出率不同，其中肝臟和盲腸檢出率最高，分別為57.1%和52.4%；回腸、脾臟、腎臟、肌胃、胰腺和腦的檢出率依次為43.8%、40.0%、40.0%、37.5%、35.7%、33.3%；心肺及其他腸道組織甚至法氏囊等檢出率都較低，低于30%；膽囊的檢出率為0。

表2 321份組織樣品PCR檢測結(jié)果

M. DL2000 Marker; 1.陽性對照；2.陰性對照；3.肝；4.脾；5.肺；6.腎；7.腦；8.回腸；9.肌胃；10.腺胃；11.胰腺；12.十二指腸；13.氣管；14.食道；15.法氏囊；16.盲腸；17.直腸；18.盲腸扁桃體；19.膽囊圖2 部分疑似病雞組織器官的蟲體DNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

關(guān)于火雞組織滴蟲在人工感染雞火雞體內(nèi)的檢測與分布規(guī)律，國內(nèi)外有過一些研究和報道。禚振男[10]使用實驗室分離純培養(yǎng)的火雞組織滴蟲單克隆蟲株 JSYZ-A 株經(jīng)泄殖腔感染 15日齡蘇禽黃羽肉雞，并在感染后不同時間采取12個臟器樣本進(jìn)行 PCR 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盲腸與肝臟分別在第13天和 第 16天時檢出率最高達(dá)到 100%，隨后降低；從第10天開始可以發(fā)現(xiàn)在十二指腸、空腸、直腸和脾臟中能檢測到火雞組織滴蟲；至感染第13天后可檢測到腺胃和心臟均有火雞組織滴蟲存在；在感染第19天后的肺臟中才能檢測到蟲體。說明火雞組織滴蟲主要寄生于盲腸和肝臟，在十二指腸、空腸、直腸、脾臟、腺胃及心臟等也會出現(xiàn)蟲體感染。而Singh等[11]運(yùn)用多克隆抗體免疫組化技術(shù)，成功地在試驗感染火雞的多個器官中定位了火雞組織滴蟲抗原，發(fā)現(xiàn)盲腸、肝臟、肺、脾檢出率為 100%，法氏囊檢出率為60%，心臟、小腦、前胃、胰腺等檢出率較低。孔令明等[12]將 JSYZ-A 株蟲體通過泄殖腔感染15日齡蘇禽黃羽肉雞，在感染后1～34 d內(nèi)，每3 d撲殺5只感染雞，采集其不同組織臟器樣品，并對樣品進(jìn)行PCR檢測。試驗結(jié)果表明肝臟、盲腸、十二指腸、空-回腸、直腸、腺胃和法氏囊均檢測到火雞組織滴蟲，肝臟、盲腸存在時間最長，同時脾、肺和腦等組織也檢測到了火雞組織滴蟲，在腎臟和胰臟中并未發(fā)現(xiàn)火雞組織滴蟲。Lotfi等[13]通過人工感染試驗也觀察到雞肝臟與盲腸以外器官的病理變化，并在肺和脾等組織中檢測到組織滴蟲的存在。本次自然感染雞臟器分布結(jié)果與人工感染獲得的結(jié)果基本一致，同時臟器分布上也存在一定微小差異，這些差異與人工感染蟲株的毒力、試驗動物的種類、觀察的時間點等因素相關(guān)。

與人工感染試驗后的臟器檢出率較高相比而言，臨床疑似病料中蟲體DNA的檢出率不高，究其原因，存在多方面的可能[14-15]。首先，腸道和糞便中含有一些TaqDNA聚合酶的抑制劑，會造成某些樣品的假陰性結(jié)果，PCR方法對盲腸樣品的檢出率為52.4%，低于肝臟樣品的57.1%，也證實了這種可能性的存在；其次，Bilic 等[16]也指出根據(jù)18S rRNA序列分析，各基因型間存在一定的遺傳多樣性，而同一基因型內(nèi)的遺傳異質(zhì)性也存在差異，這可能也是檢出率稍低的原因；此外，一些未知物種或與其他原生生物(如毛滴蟲或四毛滴蟲)的混合感染被認(rèn)為是引起組織滴蟲病的原因或引起與組織滴蟲病類似的癥狀和病變，這也是臨床樣品中檢出率不高的原因之一[17]。

綜上，本研究系統(tǒng)地闡述了臨床病雞中火雞組織滴蟲體內(nèi)的分布規(guī)律，進(jìn)一步明確了其靶器官為盲腸和肝臟。除靶器官肝臟與盲腸外，也可通過檢測回腸、脾臟和腎臟等檢出率較高的組織臟器來確認(rèn)是否感染，為組織滴蟲病的臨床診治提供一定的參考，也為以后探究其致病機(jī)理和疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。