黔北麻羊FABP3基因多態(tài)性及其與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性研究

艾錦新，龍安炬，羅衛(wèi)星，蔡惠芬*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart fatty acid binding protein, H-FABP)是脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)家族中重要的一員，又名FABP3，是一種低分子量胞漿蛋白，主要在心肌、骨骼肌和脂肪細(xì)胞中表達(dá)[1-3]。FABP3基因主要通過參與胞內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，調(diào)節(jié)脂肪代謝；在脂肪生成過程中，F(xiàn)ABP3基因通過在心肌和脂肪細(xì)胞中沉積甘油三酯，從而促進(jìn)肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat, IMF)沉積，增加IMF含量[4-5]。山羊的FABP3基因定位于2號(hào)染色體上，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成[6]。在基因多態(tài)性上，余剛等[7]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因第2外顯子的SNP與陜北絨山羊的生長(zhǎng)性狀(胸圍、管圍)、胴體性狀(眼肌面積、背膘厚度)顯著相關(guān)。羅燕等[8]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因外顯子2存在多態(tài)位點(diǎn)且具有3種基因型AA、AB和BB，其中BB基因型是影響中國(guó)美利奴羊IMF的優(yōu)勢(shì)基因型。曲亮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因多態(tài)性與蘇淮豬的胴體性狀極顯著相關(guān)。王珊等[10]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因HaeⅢ位點(diǎn)存在多態(tài)性，各基因型秦川牛及其雜種牛的體質(zhì)量、胸圍存在顯著差異。在基因表達(dá)水平上，Huang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，30～90日齡的公哈薩克綿羊肌肉組織FABP3基因的mRNA表達(dá)水平與肌間脂肪含量呈極顯著的強(qiáng)正相關(guān)。岳彩娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因的表達(dá)量與灘羊背最長(zhǎng)肌、股二頭肌及腰大肌的IMF均呈正相關(guān)。沙爾山別克·阿不地力大等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段拜城油雞的肌肉組織中FABP3基因mRNA表達(dá)量與其IMF含量呈一定的相關(guān)性。這些研究結(jié)果表明，F(xiàn)ABP3基因可能是影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因。

黔北麻羊是貴州省三大優(yōu)良地方山羊品種之一，其具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、膻味輕、肉質(zhì)鮮美、皮張品質(zhì)好、生產(chǎn)性能優(yōu)等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者和養(yǎng)殖戶的青睞[14-15]。本研究以黔北麻羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)影響山羊肌肉發(fā)育和肉質(zhì)相關(guān)性狀的FABP3基因進(jìn)行研究，在FABP3基因中檢測(cè)影響黔北麻羊重要經(jīng)濟(jì)表型的基因突變，尋找與生長(zhǎng)發(fā)育性狀具有關(guān)聯(lián)性的遺傳標(biāo)記，為后續(xù)的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)選取貴州省習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同、健康無(wú)病的6月齡黔北麻羊120只(公羊67只、母羊53只)，頸靜脈釆血8 mL，用肝素鈉抗凝，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

血液基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；核酸染料、DL2000 Maker、2×EsTaqMasterMix均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；雙蒸水、TAE緩沖液、瓊脂糖凝膠均為實(shí)驗(yàn)室自備。

1.3 主要儀器

梯度PCR儀(Bio-rad公司)；高速離心機(jī)(無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司)；超微量分光光度計(jì)(NANODROP 2000，Thermo公司)；電泳槽和電泳儀(DYY-6C型，北京六一儀器廠)；凝膠成像成像儀(Bio-rad公司)。

1.4 基因組DNA提取

試驗(yàn)采用血液基因組DNA提取試劑盒，分別對(duì)120頭黔北麻羊血液中的基因組DNA進(jìn)行抽提，并用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，取檢測(cè)結(jié)果完好的DNA樣品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增測(cè)序

根據(jù)GenBank發(fā)布山羊FABP3基因序列(NC_030809.1)，利用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物用于該基因全部外顯子的擴(kuò)增，引物詳細(xì)信息見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為30 μL：2×EsTaqMasterMix 13 μL，DNA模板3 μL，上、下游引物各2 μL，雙蒸水10 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，鑒定正確的PCR產(chǎn)物送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物信息

1.6 生長(zhǎng)性狀指標(biāo)測(cè)定

按照文獻(xiàn)[16-17]測(cè)定各試驗(yàn)羊的生長(zhǎng)性狀指標(biāo)(包括體重、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、胸深、胸寬和管圍)，并做好數(shù)據(jù)記錄。

1.7 SNP篩查與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析和峰圖比對(duì)，篩選出SNP位點(diǎn)；然后利用Microsoft Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)各基因型在黔北麻羊群體中的分布情況，計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)及卡方值(χ2)。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件一般線性模型(GLM)對(duì)各基因型與生長(zhǎng)性狀指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著水平，結(jié)果均以“最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。一般線性模型如下：

Yij=μ+&ij+bij+&ij×bij+eij，

式中，Yij表示性狀表型值，μ表示總體均值，&ij表示基因型效應(yīng)，bij表示品種效應(yīng)，eij為隨機(jī)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 FABP3基因PCR擴(kuò)增

以黔北麻羊FABP3基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增FABP3基因全部外顯子區(qū)，1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致，條帶清晰明亮，無(wú)非特異性擴(kuò)增，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，說明引物特異性良好，PCR產(chǎn)物可直接用于測(cè)序。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.引物分別為P1、P2、P3、P4、P5，每對(duì)引物2個(gè)重復(fù)圖1 黔北麻羊FABP3基因產(chǎn)物電泳

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列分析

PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)分析，在黔北麻羊FABP3基因第5外顯子區(qū)域篩選出1個(gè)SNP位點(diǎn)(C/T)，命名為g.13665051C>T，該突變未引起編碼氨基酸發(fā)生改變，屬同義突變，產(chǎn)生3種基因型：CC、CT和TT；同時(shí)在黔北麻羊FABP3基因3′非翻譯區(qū)(3′UTR)也篩選出1個(gè)SNP位點(diǎn)(G/A)，命名為g.13664737G>A，該突變產(chǎn)生3種基因型：GG、AG和AA，測(cè)序峰如圖2所示。

圖2 黔北麻羊FABP3基因單個(gè)樣本測(cè)序峰

2.3 FABP3基因遺傳學(xué)分析

對(duì)黔北麻羊FABP3基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行群體遺傳特性分析，結(jié)果見表2。由表2可知，黔北麻羊FABP3基因g.13665051C>T位點(diǎn)中CC為優(yōu)勢(shì)基因型，等位基因C為優(yōu)勢(shì)等位基因，該基因座基因純合度為0.562，雜合度為0.438，有效等位基因?yàn)?.779，多態(tài)信息含量為0.341，屬中度多態(tài)位點(diǎn)；黔北麻羊FABP3基因g.13664737G>A位點(diǎn)中GG為優(yōu)勢(shì)基因型，等位基因G為優(yōu)勢(shì)等位基因，該基因座基因純合度為0.531，雜合度為0.469，有效等位基因?yàn)?.883，多態(tài)信息含量為0.359，屬中度多態(tài)位點(diǎn)。卡方(χ2)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，g.13665051C>T和g.13664737G>A突變位點(diǎn)的基因型分布均未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2 SNPs位點(diǎn)在黔北麻羊中的群體遺傳信息

2.4 FABP3基因不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)黔北麻羊FABP3基因SNPs位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表3。由表3可知，在黔北麻羊群體中，F(xiàn)ABP3基因g.13665051C>T位點(diǎn)中CC、CT和TT基因型個(gè)體間的體重差異不顯著(P>0.05)，CT基因型個(gè)體的體高、體斜長(zhǎng)、胸寬和管圍顯著高于CC和TT基因型個(gè)體(P<0.05)，CC和CT基因型個(gè)體的胸圍、胸深顯著高于TT基因型個(gè)體(P<0.05)，其中雖然CC和CT基因型個(gè)體的胸圍、胸深無(wú)顯著差異(P>0.05)，但是CT基因型個(gè)體的胸圍、胸深高于CC基因型個(gè)體；在FABP3基因g.13664737G>A位點(diǎn)中GG、AG和AA不同基因型的生長(zhǎng)性狀指標(biāo)均差異不顯著(P>0.05)。

表3 黔北麻羊FABP3基因SNPs位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

FABP3基因具有特異結(jié)合脂肪酸及調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的重要功能，對(duì)畜禽的肉質(zhì)性狀、生長(zhǎng)性狀兼有影響[18]。本研究通過PCR產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)對(duì)黔北麻羊FABP3基因的SNP進(jìn)行檢測(cè)，篩選出2個(gè)SNPs位點(diǎn)g.13665051C>T和g.13664737G>A,其中g(shù).13665051C>T位于外顯子5，產(chǎn)生3種基因型：CC、CT和TT；g.13664737G>A位于3′非翻譯區(qū)，產(chǎn)生3種基因型：GG、AG和AA。其中g(shù).13665051C>T突變是位于編碼區(qū)的同義突變，編碼區(qū)的同義突變雖不改變編碼的氨基酸，但可能引起外顯子拼接增強(qiáng)，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)量[19-20]。有研究表明，同義突變可以通過改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)[21]或改變核糖體通過mRNA特定區(qū)域時(shí)的速度[22]來(lái)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。因此，g.13665051C>T突變?nèi)钥赡苁菚?huì)改變蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)正常功能的重要突變。

多態(tài)信息含量、雜合度與群體遺傳多樣性密切相關(guān)，其值的高低反映了群體內(nèi)個(gè)體的均質(zhì)度，群體遺傳變異程度越大，說明該群體的遺傳多樣性就越豐富，選擇潛力就越大，對(duì)育種改良就越有利[1]。本研究從純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量等指標(biāo)多角度對(duì)黔北麻羊群體的遺傳變異程度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)g.13665051C>T位點(diǎn)基因座的純合度為0.562，雜合度為0.438，有效等位基因?yàn)?.779，多態(tài)信息含量為0.341，為中度多態(tài)位點(diǎn)；g.13664737G>A位點(diǎn)基因座的純合度為0.531，雜合度為0.469，有效等位基因?yàn)?.883，多態(tài)信息含量為0.359，為中度多態(tài)位點(diǎn)，說明2個(gè)SNPs位點(diǎn)的群體遺傳變異程度較大，遺傳多樣性較為豐富，具有一定的選擇潛力?？ǚ?χ2)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，黔北麻羊群體FABP3基因的基因型分布并未受到遺傳漂變及人工選育的影響[23]，符合Hardy-Weinberg平衡。

近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，生長(zhǎng)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于畜禽的育種改良中，大大提高了育種效率，縮短了育種進(jìn)程[24]。本研究除在黔北麻羊FABP3基因外顯子5和3′非翻譯區(qū)各發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)外，并未發(fā)現(xiàn)其他突變位點(diǎn)，這與黃李勇等[1]在新疆巴什拜羊FABP3基因外顯子2發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)和趙雪[25]在東北半細(xì)毛羊、小尾寒羊、杜泊和道賽特羊4個(gè)群體中發(fā)現(xiàn)FABP3基因外顯子2存在4個(gè)突變位點(diǎn)，外顯子3存在3個(gè)突變位點(diǎn)的結(jié)果存在差異，可能是由于品種、遺傳基礎(chǔ)和樣本數(shù)量不同所致。本研究采集了黔北麻羊的體重、體高、體斜長(zhǎng)、胸深、胸寬、胸圍及管圍等生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)，并與在FABP3基因上篩選出的2個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，g.13665051C>T突變位點(diǎn)除了對(duì)黔北麻羊體重?zé)o顯著影響外，對(duì)其體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、胸深、胸寬和管圍均有顯著影響；但g.13664737G>A突變位點(diǎn)對(duì)黔北麻羊體重、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、胸深、胸寬和管圍均無(wú)顯著影響。由此推測(cè)，g.13665051C>T突變位點(diǎn)在對(duì)黔北麻羊生長(zhǎng)性狀指標(biāo)上的影響程度大于g.13664737G>A突變位點(diǎn)。余剛等[26]研究發(fā)現(xiàn)周歲陜北絨山羊FABP3基因內(nèi)含子3存在SNP位點(diǎn)，產(chǎn)生2種基因型：AA和AB，其AB基因型的體高、胸圍顯著高于AA基因型；曾鴻普等[27]研究發(fā)現(xiàn)五指山豬FABP3基因外顯子2存在多態(tài)性，產(chǎn)生3種基因型：AA、AB和BB,其8月齡AB基因型五指山豬的體質(zhì)量、體長(zhǎng)和10月齡AB基因型五指山豬的胸圍顯著高于AA、AB基因型。上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)在g.13665051C>T位點(diǎn)上的研究結(jié)果存在一定的相似性，證實(shí)了FABP3基因上的SNP位點(diǎn)與部分生長(zhǎng)性狀存在關(guān)聯(lián)性，且會(huì)對(duì)部分生長(zhǎng)性狀產(chǎn)生影響。而柴志欣等[4]研究發(fā)現(xiàn)麥洼牦牛FABP3基因外顯子4存在T7339C突變，但該突變對(duì)麥洼牦牛的生長(zhǎng)性狀均無(wú)顯著影響，這與本試驗(yàn)g.13664737G>A位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果一致。綜合分析2種不同結(jié)果，可能是由于檢測(cè)的位點(diǎn)、品種、采集生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)的階段及統(tǒng)計(jì)分析方法不同引起。在本次關(guān)聯(lián)性分析中，g.13665051C>T位點(diǎn)中CT基因型的體高、體斜長(zhǎng)、胸寬和管圍均顯著高于CC、TT基因型，CT基因型的胸深、胸圍顯著高于TT基因型，這表明g.13665051C>T突變位點(diǎn)顯著影響黔北麻羊的諸多生長(zhǎng)性狀指標(biāo)，初步推測(cè)FABP3基因外顯子5的g.13665051C>T突變有可能作為一種遺傳標(biāo)記，通過對(duì)優(yōu)勢(shì)基因型的選擇，從而加快對(duì)黔北麻羊的育種改良。

4 結(jié)論

本研究在黔北麻羊FABP3基因外顯子5和3′非翻譯區(qū)各檢測(cè)出1個(gè)SNP位點(diǎn)，分別為g.13665051C>T、g.13664737G>A。其中g(shù).13665051C>T為同義突變，產(chǎn)生3種基因型：CC、CT和TT；g.13664737G>A產(chǎn)生3種基因型：GG、AG和AA。通過遺傳學(xué)分析，黔北麻羊FABP3基因存在較為豐富的遺傳多態(tài)性。經(jīng)關(guān)聯(lián)性分析顯示，g.13665051C>T突變位點(diǎn)對(duì)黔北麻羊體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、胸深、胸寬和管圍均有顯著影響，可作為一種遺傳標(biāo)記用于輔助性選擇。