苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖的條件優(yōu)化研究

黃 麗，黃鳳柳

（廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 熱帶農(nóng)林學(xué)院，廣東 廣州 510507）

佛手瓜，又名合掌瓜、拳頭瓜、福壽瓜，是一種具有豐富營養(yǎng)價值和極高藥用價值的綠色蔬菜［1］.但由于其口感欠佳，限制了佛手瓜的推廣，對佛手瓜進行深加工、延長產(chǎn)業(yè)鏈、增加附加值勢在必行.近年來，針對佛手瓜的研究大多是初加工，目前已開發(fā)的產(chǎn)品有酸奶、果脯、蜜餞、蔬菜酒、果醬及腌制品等，但這些產(chǎn)品存在技術(shù)含量和營養(yǎng)附加值不高的缺點［2］.佛手瓜富含多種活性物質(zhì)，包括來自于葉子的抗氧化提取物、從種子中分離出的某些胰島素抑制因子、乳汁中含有的植物凝集素、果肉中富含的果膠、黃酮以及對巨噬細胞功能有調(diào)節(jié)作用的生物活性多糖等［3-6］.對佛手瓜中活性物質(zhì)的提取及其相關(guān)產(chǎn)品的深加工日益成為國際研究熱點和難點.其中多糖具有降血糖、降血脂、抗病毒等多種生物活性功能，備受人們關(guān)注，研究佛手瓜種多糖的提取，然后進行相應(yīng)的深加工具有較強的應(yīng)用價值.國外關(guān)于佛手瓜水溶性多糖的研究和探索多有報道［7-8］.但是，國內(nèi)關(guān)于佛手瓜多糖的研究尚處于初步階段，相關(guān)提取工藝研究的報道目前只有熱水浸提法［9］和超聲波輔助法［10］.兩種方法均提取的是粗多糖，對多糖的純化、結(jié)構(gòu)和活性并沒有進一步研究.因此，為了對以多糖為有效活性成分的佛手瓜原料和佛手瓜多糖產(chǎn)品的質(zhì)量有一個比較和評判標(biāo)準，研究佛手中瓜水溶性多糖含量測定方法具有一定的實際意義.

多糖含量的檢測方法主要可以分為兩類：一是高效液相或酶法，高效液相法需要昂貴儀器和多糖純品，酶法則需要特定的酶，以上兩種方法都是直接測定多糖本身，操作步驟均較繁瑣.二是地衣酚-鹽酸法、蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法，這幾種方法具有簡便和快速的優(yōu)點，但是，地衣酚-鹽酸法因為所用試劑昂貴且用量大，不通用；蒽酮-硫酸法存在較嚴重的穩(wěn)定性問題，容易被色氨酸含量較高蛋白質(zhì)所影響，且重現(xiàn)性不好；關(guān)于多糖的含量測定大都采用苯酚-硫酸法，但該法也存在平行樣品之間的吸光度相差較大、檢測的重現(xiàn)性與準確性不好等缺點［11］.因此，本研究從檢測波長、樣品添加順序、試劑用量、顯色測定條件等方面進行了苯酚-硫酸法測定佛手瓜中水溶性多糖的首次研究，并研究了其線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率等，以期得出苯酚-硫酸法測定佛手瓜中水溶性多糖含量的最佳測定條件，從而為佛手瓜中多糖提取以及利用活性物質(zhì)進行佛手瓜的精深加工提供參考.

1 試劑與方法

1.1 材料與試劑

綠皮佛手瓜，購自增城中新鎮(zhèn)超市；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、石油醚、正丁醇、氯仿等試劑均為分析純；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）、子華牌循環(huán)水真空泵（B-2-DⅡ）、布氏漏斗（實驗室提供）、分光光度計（N723）、恒溫烘箱（101-3）、高速粉碎機（SN-400）、高速離心機（廣豐科技）.

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的制備和溶液的配制

佛手瓜樣品制備：佛手瓜去皮去核，切片，60 ℃烘箱中烘干，粉碎過80目篩即得.

佛手瓜多糖溶液配制：取適量佛手瓜樣品用石油醚回流1 h去除脂肪，曬干樣品，往燒杯中倒入脫脂后的樣品，添加20倍質(zhì)量的水，放入81 ℃恒溫水浴鍋中（需要保鮮膜包住燒杯，并不時攪拌），熱水浸提138 min，抽濾得濾液.濾液中加入Servage試劑（濾液∶氯仿∶正丁醇=16∶4∶1），萃取去除蛋白及有機溶劑，將上清液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，稀釋定容.

佛手瓜多糖粉末制備：重復(fù)佛手瓜多糖溶液配制過程的脫脂、水提、脫蛋白操作，往上清液中加入無水乙醇，使乙醇體積分數(shù)為80%，過夜醇沉12 h，離心，干燥至恒重即可得.

葡萄糖標(biāo)準溶液配制：精確稱取干燥至恒重的葡萄糖0.015 0 g于250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即可得60 ug/mL的葡萄糖標(biāo)準溶液.

1.2.2 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖條件優(yōu)化

（1）最大吸收波長的確定

分別吸取佛手瓜水溶性多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準溶液2 mL，以空白試劑為對照，加入6%苯酚1 mL，搖勻，加入濃硫酸5 mL搖勻，放置5 min，沸水浴15 min，取出后冷卻到室溫，在波長范圍為400～600 nm內(nèi)采用紫外可見分光光度計測定吸光度，記錄其最大吸收值對應(yīng)的波長.

（2）試劑添加順序的確定

以空白試劑為對照，固定佛手瓜水溶性多糖溶液和試劑用量：佛手瓜水溶性多糖溶液2 mL（P），6%苯酚溶液1 mL（B），濃硫酸5 mL（N），改變樣品添加順序：PBN、BPN、BNP、NBP 、PNB，放置5 min，沸水浴15 min，取出后冷卻到室溫，測定吸光度，確定其樣品添加順序.

（3）試劑用量的確定

濃硫酸用量分別控制在 4.0，4.5，5.0 ，5.5，6.0，6.5 mL，以試劑空白為空白對照.測定吸光度，得出最適濃硫酸用量. 6%苯酚的用量分別控制在 0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL，以試劑空白為空白對照.測定吸光度，得出最適苯酚用量.試驗中苯酚應(yīng)避光保存，防止苯酚被氧化影響顯色效果.

（4）顯色測定條件

顯色溫度分別控制在20、40、60、80 ℃，以試劑空白為空白對照.測定吸光度，得出最適顯色溫度.顯色時間分別控制在5、10、15、20、25 min，以試劑空白為空白對照.測定吸光度，得出最適顯色時間.

1.2.3 換算因子和多糖含量的計算

（1）葡萄糖標(biāo)準曲線的繪制

分別吸取葡萄糖標(biāo)準溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于比色管中，加水至刻度，搖勻，即得12、24、36、48、60 ug/mL的葡萄糖標(biāo)準使用液，以試劑空白為空白對照，根據(jù)上述試驗優(yōu)化的苯酚-硫酸法進行測定，繪制葡萄糖標(biāo)準溶液曲線.

（2）換算因子的計算

式中：m佛手瓜多糖粉末的質(zhì)量（mg），c備用液中佛手瓜多糖葡萄糖質(zhì)量濃度（mg·mL-1），d備用液稀釋倍數(shù).

（3）水溶性多糖含量的計算

準確稱取材料制備中干燥得到的佛手瓜樣品10 g，脫脂、水提和脫蛋白，將萃取后得到的上清液定容，得到樣品液，以空白試劑為對照，參照公式（2）來計算佛手瓜水溶性多糖含量.

式中：C樣品中葡萄糖質(zhì)量濃度（ug·mL-1），D樣品液稀釋倍數(shù)，F(xiàn)換算因子，M佛手瓜的樣品質(zhì)量（g）.

1.2.4 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖方法學(xué)驗證試驗

（1）精密度試驗

吸取5份佛手瓜水溶性多糖溶液2 mL，根據(jù)上述優(yōu)化后的苯酚-硫酸法進行測定，重復(fù)測定5次，計算相對標(biāo)準偏差RSD值（n=5），驗證方法的精密度.

（2）穩(wěn)定性試驗

綜上所述：腦卒中篩查中采納頸動脈超聲，可有效診斷出頸動脈狹窄程度及其血流參數(shù)，并分析其超聲特征，值得臨床信賴并進一步推廣。

吸取1份佛手瓜水溶性多糖溶液2 mL，根據(jù)上述優(yōu)化后的苯酚-硫酸法進行測定，每隔30 min測1次吸光度值，考察3 h內(nèi)佛手瓜水溶性多糖的穩(wěn)定性，計算RSD值（n=6），驗證顯色液及方法的穩(wěn)定性.

（3）加樣回收率試驗

取5個比色管，分別加入1 mL佛手瓜水溶性多糖溶液和1 mL葡萄糖標(biāo)準溶液，根據(jù)上述優(yōu)化后的苯酚-硫酸法進行測定，計算加樣回收率，計算RSD值（n=5）.

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖條件優(yōu)化

2.1.1 最大吸收波長的確定

佛手瓜多糖在苯酚-濃硫酸作用下生成絡(luò)合衍生物，其組分較單一，顯色效果較好［13］.佛手瓜多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準溶液在400～600 nm的波長范圍內(nèi)掃描結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，佛手瓜多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準溶液均在485 nm處有最大吸收，確定最大吸收波長為485 nm.

圖1 最大吸收波長的確定

2.1.2 試劑添加順序的確定

陰婉婷等人測定蛹蟲草多糖含量研究時，改變濃硫酸及苯酚的加入順序會使產(chǎn)物穩(wěn)定，靈敏度提高，并具良好重現(xiàn)性［14］.本文嘗試改變試劑添加順序研究其對吸光度值的影響，如圖2所示.結(jié)果表明，吸光度按依次減弱的順序為：PBN＞BPN＞BNP＞NBP＞PNB，因此，吸光度最大時試劑最佳添加順序是PBN，即佛手瓜多糖溶液，苯酚，濃硫酸.這可能是因為濃硫酸的添加會快速水解多糖，所以要放在最后；而先加入苯酚會使反應(yīng)更充分，所以要放在前面.

圖2 樣品添加順序?qū)ξ舛鹊挠绊?/p>

2.1.3 試劑用量的確定

（1）濃硫酸用量

濃硫酸用量是反應(yīng)顯色過程的重要影響因素.圖3為濃硫酸不同用量對吸光度的影響.結(jié)果表明，吸光度隨濃硫酸用量的增加而不斷提高，但超過5.5 mL后，隨著濃硫酸用量的增加，吸光度反而下降，這可能是因為過量的硫酸導(dǎo)致顯色物質(zhì)的分解.因此，濃硫酸最佳用量為5.5 mL.

圖3 不同濃硫酸用量對吸光度的影響

（2）苯酚用量

不同苯酚用量對吸光度值的影響如圖4所示.結(jié)果表明，吸光度隨著苯酚用量增加而增加，當(dāng)苯酚用量0.9 mL時吸光度最大，0.9 mL之后吸光度值開始減小.該結(jié)果與張居作等人在進行苦瓜多糖苯酚-硫酸法的苯酚用量試驗結(jié)果類似［15］.這可能是因為隨著苯酚用量的增加，濃硫酸會搶先跟苯酚反應(yīng)，導(dǎo)致與佛手瓜多糖反應(yīng)會減少.因此，苯酚最佳用量為0.9 mL.

圖4 不同苯酚用量對吸光度的影響

2.1.4 顯色測定條件的確定

顯色溫度和時間會直接影響多糖的析出以及顯色反應(yīng)的程度.

（1）顯色溫度

圖5為不同顯色溫度對吸光度值的影響.結(jié)果表明，溫度在20～40 ℃之間，吸光度隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達到40 ℃時，吸光度最大，大于40 ℃時吸光度開始減小.這可能是因為溫度低顯色反應(yīng)速度變慢，而溫度升高到佛手瓜多糖保護溫度40 ℃及以上，佛手瓜水溶性多糖活性結(jié)構(gòu)又會遭到破壞.因此，最佳顯色溫度為40 ℃.

（2）顯色時間

圖5 不同顯色溫度對吸光度的影響

不同顯色時間對吸光度值的影響如圖6所示.結(jié)果表明，顯色時間5 min時，吸光度最大.當(dāng)顯色時間繼續(xù)增加時，吸光度開始降低，這可能是因為顯色時間過長導(dǎo)致橙色復(fù)合物發(fā)生了分解.因此，最佳顯色時間為5 min.

圖6 不同顯色時間對吸光度的影響

2.2 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖換算因子和多糖含量的計算

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準曲線的繪制

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸光度-葡萄糖質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線，如圖7所示.結(jié)果表明，線性回歸方程y= 0.016 7x-0.079 0，R2為0.999 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 5.線性關(guān)系良好.

圖7 葡萄糖標(biāo)準曲線

2.2.2 換算因子和多糖含量的計算結(jié)果

本試驗利用佛手瓜中的水溶性多糖來計算換算因子，避免了用葡萄糖做標(biāo)準引起的系統(tǒng)誤差，而且因為組成上與待測樣品最接近，結(jié)果會比較接近真實值.為了提高苯酚-硫酸法的準確性，目前多糖含量測定時大多采用校正系數(shù)或換算因子的方法［16］.本試驗對3次備用液的吸光度進行了平行測定，吸光度平均值0.576，按公式（1）計算得到換算因子F=2.55.

試驗中對3次樣品液的吸光度進行平行測定，吸光度的均值為0.436，試驗中對樣品液進行了800倍的稀釋，代入換算因子，按公式（2）計算得到佛手瓜水溶性多糖的含量為0.629 1%.

2.3 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖方法學(xué)驗證試驗

2.3.1 精密度試驗結(jié)果

為確定試驗的精密度，在上述優(yōu)化后的條件下，對顯色反應(yīng)進行精密度試驗. 5次吸光度測定的結(jié)果分別為0.430，0.442，0.401，0.437，0.428，RSD=3.71%，顯示優(yōu)化后的苯酚-硫酸法精密度良好.

2.3.2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

為確定試驗的穩(wěn)定性，在上述優(yōu)化后的條件下，對顯色反應(yīng)進行穩(wěn)定性試驗.顯色液在0.5 h時的吸光度值為0.424，顯色液在3 h時的吸光度值為0.425，穩(wěn)定性試驗中RSD=0.08%，結(jié)果表明，顯色液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.因此，優(yōu)化后的苯酚-硫酸法穩(wěn)定性良好.

2.3.3 加樣回收率試驗結(jié)果

按照樣品測量方法，在上述優(yōu)化后的條件下，對顯色反應(yīng)進行加樣回收率試驗.如表1所示，平均回收率為110.1%，RSD為1.52%.結(jié)果表明，優(yōu)化后的苯酚-硫酸法加樣回收率較高.

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

3 結(jié)論

苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖含量最佳測定條件是：最大吸收波長485 nm；試劑最佳添加順序：多糖溶液，苯酚，濃硫酸；試劑最佳用量：濃硫酸5.5 mL，苯酚0.9 mL；顯色測定最佳條件：溫度40 ℃，顯色時間5 min.回歸方程為y=0.016 7x-0.079 0，相關(guān)系數(shù)為0.999 5.該方法平均回收率110.1%，RSD1.52%，顯色液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.苯酚-硫酸法是測定佛手瓜中水溶性多糖含量的一種高穩(wěn)定性和高回收率的方法，為將來利用活性物質(zhì)進行佛手瓜的精深加工打下基礎(chǔ)，同時具有很高的實際應(yīng)用價值.