表面活性劑改善高固體系木質(zhì)纖維素酶水解的研究

谷 丞 霍 丹 韓 瀟 陳 輝 楊秋林 李 霖 薛鵬程 司傳領(lǐng) 裴繼誠(chéng)

（天津科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457）

木質(zhì)纖維素是植物光合作用形成的天然高分子有機(jī)復(fù)合物，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。因其價(jià)格低廉，來(lái)源廣泛、且可生物降解等特點(diǎn)，是生產(chǎn)第三代燃料乙醇最理想的原料。

木質(zhì)纖維素生物煉制生產(chǎn)燃料乙醇過(guò)程通常包括預(yù)處理、水解、發(fā)酵、蒸餾等單元操作。其中纖維素水解為可發(fā)酵糖是纖維素乙醇煉制過(guò)程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。一直以來(lái)關(guān)于木質(zhì)纖維原料酶水解的報(bào)道主要集中在基于木質(zhì)纖維原料物理化學(xué)結(jié)構(gòu)和纖維素酶兩方面。木質(zhì)纖維素原料本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其與纖維素酶的結(jié)合有一定限制，包括纖維素的聚合度[1]、結(jié)晶度[2]、顆粒粒徑[3]、對(duì)纖維素酶的可及性[4-5]、保水值[6]以及底物中半纖維素和木質(zhì)素等非纖維物質(zhì)對(duì)纖維素酶的無(wú)效吸附等[7]；對(duì)纖維素酶的研究主要側(cè)重于酶活性的提高、成本的降低等方面[8]。然而，以上研究都是在低濃條件下、即底物濃度在2%或以內(nèi)完成的。在木質(zhì)纖維素制備燃料乙醇的工業(yè)生產(chǎn)中，為滿足后續(xù)蒸餾過(guò)程經(jīng)濟(jì)性要求即降低發(fā)酵產(chǎn)物的蒸餾能耗、提高設(shè)備的利用率、節(jié)約酶水解用水、減少?gòu)U水治理成本等，蒸餾濃縮后乙醇濃度必須不少于4%，即酶水解后葡萄糖濃度至少達(dá)到8%。因此，酶水解反應(yīng)的底物濃度至少為20%才能滿足上述對(duì)酶水解液中葡萄糖含量的要求。然而，有研究表明，在底物濃度高于10%時(shí)纖維素原料不能完全有效轉(zhuǎn)化，一次加料上限為12% ～15%[9]。可能是因?yàn)殡S著底物含量增加，終產(chǎn)物和抑制物相應(yīng)增多，漿料黏度增大，底物得不到有效攪拌導(dǎo)致酶不能與其充分接觸，高濃度的抑制作用逐漸增強(qiáng)，纖維素轉(zhuǎn)化率隨之下降[10]。為改善高固體系木質(zhì)纖維素酶水解的流變性能，多采用表面活性劑對(duì)高固體系流變性能進(jìn)行改性[11]。

木質(zhì)素磺酸鈉是一種陰離子表面活性劑，由于磺酸的離子化而帶負(fù)電荷，其相對(duì)分子質(zhì)量介于200～10000 之間，是紙漿生產(chǎn)的副產(chǎn)品。在木質(zhì)纖維素的酶解過(guò)程中，木質(zhì)素磺酸鈉可以吸附在木質(zhì)素表面并形成空間位阻和水合膜，從而可降低纖維素酶對(duì)木質(zhì)素的非生產(chǎn)性吸收，進(jìn)一步增強(qiáng)木質(zhì)纖維素的酶水解效率[12]。

本研究將木質(zhì)素磺酸鈉引入到高固體系的纖維素酶水解中，考察木質(zhì)素磺酸鈉加入量對(duì)酶水解的影響，并將木質(zhì)素磺酸鈉與其他類型的表面活性劑復(fù)配，改善高固體系的流變性和纖維素酶的假性吸附，進(jìn)一步提高纖維素酶水解效率。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

桉木片，購(gòu)自廣西金桂紙業(yè)；將桉木片用植物粉碎機(jī)磨粉后取40～60目，平衡水分后備用。纖維素酶（C2730）和纖維二糖酶（C6105），生物試劑，均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；木質(zhì)素磺酸鈉，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；其他化學(xué)藥品均為分析純。

1.2 酶水解固體基質(zhì)的制備

桉木粉預(yù)處理?xiàng)l件為：氯化鎂濃度0.2 mol/L，固液比1∶10，溫度170℃，保溫時(shí)間20 min。反應(yīng)所得預(yù)處理固體用去離子水洗滌至中性，并平衡水分，其中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量分別為：58.20%、4.33%和34.21%。

1.3 纖維素酶水解

準(zhǔn)確稱取已預(yù)處理的10.00 g（±0.1 g）絕干桉木粉，置于250 mL錐形瓶中，加入一定量的0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 值為4.8），配成底物濃度為10%（w/V）的懸浮液，并加入不同量的表面活性劑。然后向反應(yīng)體系中加入纖維素酶（15 FBU/g）及纖維二糖酶（18.75 CBU/g），并加入1 滴乙酸乙酯，用于防止水解過(guò)程中微生物及雜菌的產(chǎn)生。將上述樣品放置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中，于50℃下反應(yīng)72 h，期間振蕩器的轉(zhuǎn)速保持在150 r/min。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物在90℃水浴中加熱10 min，對(duì)纖維素酶進(jìn)行滅活處理。酶解混合物經(jīng)真空過(guò)濾后得酶解液及固體殘?jiān)?/p>

對(duì)酶解液中的還原糖含量進(jìn)行測(cè)定，其中酶解過(guò)程中的還原糖轉(zhuǎn)化率（酶水解效率）計(jì)算見(jiàn)式（1）。

式中，YRSc為酶水解效率，%；mRS為酶水解液中還原糖質(zhì)量，mg；mc0為生物質(zhì)中纖維素的絕干質(zhì)量，mg；n為稀釋倍數(shù)；C為水解液中的還原糖含量，mg/mL；V為水解液體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)纖維素酶水解的影響

2.1.1 木質(zhì)素磺酸鈉加入量對(duì)酶水解效率的影響

圖1 為木質(zhì)素磺酸鈉加入量對(duì)酶水解效率的影響。如圖1所示，隨著底物中木質(zhì)素磺酸鈉加入量的增加，酶水解效率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，但都較未添加木質(zhì)素磺酸鈉樣品有所提高。當(dāng)木質(zhì)素磺酸鈉加入量為0.4%時(shí)（相對(duì)于固體底物質(zhì)量），酶水解效率為93.72%，相對(duì)于未加入木質(zhì)素磺酸鈉時(shí)提高了12.5個(gè)百分點(diǎn)。說(shuō)明微量木質(zhì)素磺酸鈉的加入提高了高固體系的酶水解效率。MgCl2預(yù)處理固體中仍然含有大量的木質(zhì)素，而負(fù)電性極強(qiáng)的木質(zhì)素磺酸鈉會(huì)吸附到固體基質(zhì)中殘存的木質(zhì)素表面，從而降低了纖維素酶在木質(zhì)素上可能會(huì)發(fā)生的“無(wú)效吸附”，提高酶水解效率[13]。由于木質(zhì)素磺酸鈉中的帶負(fù)電的磺酸基團(tuán)可與纖維素酶中帶正電的氨基結(jié)合，在酶水解體系中木質(zhì)素磺酸鈉的加入可與纖維素酶（Cel）形成木質(zhì)素磺酸鈉（LS）-纖維素酶聚集體（LCCs），從而可穩(wěn)定纖維素與纖維素酶間的鏈接。但若木質(zhì)素磺酸鈉加入量過(guò)高或木質(zhì)磺酸鹽的磺化度過(guò)高，帶的負(fù)電荷過(guò)高，產(chǎn)生的高負(fù)電荷的LCCs 聚集體則與帶負(fù)電的纖維素之間產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電斥力，從而減少纖維素與纖維素酶的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。因此，當(dāng)木質(zhì)素磺酸鈉加入量過(guò)大時(shí)，酶水解效率反而略有降低。

圖1 木質(zhì)素磺酸鈉加入量對(duì)酶水解效率的影響

2.1.2 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間下酶水解效率的影響

酶水解時(shí)間是影響葡萄糖得率的重要因素。木質(zhì)素磺酸鈉的加入是否會(huì)縮短酶水解的時(shí)間需要做進(jìn)一步驗(yàn)證。圖2為木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間下酶水解效率的影響。

圖2 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間下酶水解效率的影響

由圖2可知，反應(yīng)時(shí)間在0～48 h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶水解效率快速增長(zhǎng)，當(dāng)反應(yīng)48 h時(shí)，酶水解效率達(dá)到最高值。超過(guò)48 h，酶水解效率有所下降。主要是由于反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，水解液中的葡萄糖重新吸附到固體底物中，以及過(guò)高濃度葡萄糖的聚集抑制了酶水解反應(yīng)的進(jìn)行。因此，最佳的酶水解時(shí)間為48 h，即木質(zhì)素磺酸鈉的加入不會(huì)縮短酶水解的時(shí)間，但會(huì)大大提高葡萄糖的得率，從而提高纖維素酶的水解效率。

2.1.3 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)不同pH 值下酶水解效率的影響

pH值是纖維素酶水解的關(guān)鍵影響因素，圖3為木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)不同pH值下纖維素酶水解效率的影響。

圖3 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)不同pH值下酶水解效率的影響

由圖3 可知，隨著酶解體系pH 值的增加，酶解效率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為5.0時(shí)，酶解體系的轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到95.26%，較未添加樣提高了9.03%。當(dāng)pH 值高于5.0 時(shí)，酶水解效率反而有所降低。因此，最佳的酶水解pH 值為5.0。相同pH 值下，添加0.4%木質(zhì)素磺酸鈉，可提高纖維素的酶水解效率，最高可提高10.4個(gè)百分點(diǎn)。

2.1.4 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)不同底物濃度下酶水解效率的影響

酶水解固體底物濃度越高，水解液中葡萄糖的濃度就會(huì)相應(yīng)增加，從而可降低后續(xù)發(fā)酵的成本。然而底物濃度越高，體系流變性會(huì)相應(yīng)降低，從而酶與底物中纖維素的接觸點(diǎn)可能會(huì)降低、體系中聚集的過(guò)量葡萄糖也會(huì)對(duì)酶水解產(chǎn)生抑制作用，因此在現(xiàn)有條件下控制底物濃度是達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定反應(yīng)體系pH 值5.0、木質(zhì)素磺酸鈉加入量0.4%、反應(yīng)72 h，反應(yīng)溫度50℃，考察木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)不同濃度固體底物酶水解的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

如圖4 可知，隨著酶水解體系中底物濃度的增加，酶水解效率是逐漸降低的，未添加木質(zhì)素磺酸鈉的酶水解體系降低的尤為明顯。這與體系流變特性以及聚集的葡萄糖量過(guò)多有關(guān)。同時(shí)，與未添加木質(zhì)素磺酸鈉的相比，隨著底物濃度的提高，添加木質(zhì)素磺酸鈉可顯著提高纖維素的酶水解效率，如當(dāng)?shù)孜餄舛葹?7%時(shí)，添加木質(zhì)素磺酸鈉可將酶水解轉(zhuǎn)化率提高13.0個(gè)百分點(diǎn)?？赡芘c木質(zhì)素磺酸鈉可提高高濃度體系的流變性有關(guān)。

圖4 木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)不同底物濃度下酶水解效率的影響

2.2 木質(zhì)素磺酸鈉與其他類型表面活性劑復(fù)配對(duì)酶水解效率的影響

通過(guò)上述2.1 中的分析，木質(zhì)素磺酸鈉作為一種陰離子性表面活性劑，對(duì)MgCl2預(yù)處理固體基質(zhì)的高固體系酶水解有明顯的促進(jìn)作用。但當(dāng)pH 值較低時(shí)，木質(zhì)素由于羧基離子的作用而帶負(fù)電荷，木質(zhì)磺酸鹽也帶負(fù)電荷，兩者之間存在靜電斥力，從而進(jìn)一步降低了木質(zhì)磺酸鹽對(duì)木質(zhì)素的吸附。同時(shí)，木質(zhì)磺酸鹽形成的空間位阻不足以有效降低纖維素酶對(duì)木質(zhì)素的無(wú)效吸附。因此，筆者考察了木質(zhì)素磺酸鈉與陽(yáng)離子表面活性劑（十六烷基三甲基溴化銨，CTAB）和非離子表面活性劑（吐溫80）復(fù)配對(duì)改善高固體系的酶水解效率的作用效果。

2.2.1 木質(zhì)素磺酸鈉與陽(yáng)離子表面活性劑復(fù)配

為考察CTAB 與木質(zhì)素磺酸鈉復(fù)配對(duì)酶水解的影響，本實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)體系中加入相同量（0.4%）的木質(zhì)素磺酸鈉，并按照m(CTAB)∶m(LS)=0.05∶1～3∶1的比例加入CTAB，酶解反應(yīng)體系的pH 值5.0，反應(yīng)時(shí)間48 h，底物濃度10%，反應(yīng)溫度50℃，研究表面活性劑復(fù)配對(duì)酶水解效率的影響。

圖5 為CTAB 與木質(zhì)素磺酸鈉質(zhì)量比對(duì)纖維素酶水解效率的影響。由圖5可知，當(dāng)木質(zhì)素磺酸鈉的加入量一定，隨著CTAB 加入量的提高，酶水解效率逐漸增加。當(dāng)CTAB 的加入量相對(duì)于木質(zhì)素磺酸鈉為0～0.5時(shí)，酶水解效率迅速增加，當(dāng)m(CTAB)∶m(LS)為0.7∶1～1.5∶1時(shí)，酶水解效率增加較平緩；當(dāng)m(CTAB)∶m(LS)為1.5∶1時(shí)，酶水解效率最高為99.56%，即酶水解體系中的固體基質(zhì)中的纖維素基本全部轉(zhuǎn)化為還原糖。再增加CTAB 的相對(duì)加入量，酶水解效率略有降低?？傮w而言，陽(yáng)離子表面活性劑CTAB 的加入，可明顯提高酶水解效率。

圖5 CTAB與木質(zhì)素磺酸鈉的質(zhì)量比對(duì)酶水解效率的影響

2.2.2 木質(zhì)素磺酸鈉與非離子表面活性劑復(fù)配

為考察吐溫80 與木質(zhì)素磺酸鈉復(fù)配對(duì)酶水解的影響，在反應(yīng)體系中加入相同量（0.4%）的木質(zhì)素磺酸鈉，并按照質(zhì)量比m(吐溫80)∶m(LS)=0.05∶1～1.5∶1加入吐溫80，酶解反應(yīng)體系的pH 值5.0，反應(yīng)時(shí)間48 h，底物濃度10%，反應(yīng)溫度50℃，研究表面活性劑復(fù)配對(duì)酶解效率的影響。

圖6為吐溫80與木質(zhì)素磺酸鈉的質(zhì)量比對(duì)纖維素酶水解效率的影響。由圖6可知，當(dāng)木質(zhì)素磺酸鈉的加入量一定，隨著吐溫80 加入量的提高，酶水解效率逐漸增加。當(dāng)吐溫80 的加入量相對(duì)木質(zhì)素磺酸鈉為0～0.2時(shí)，酶水解效率迅速增加，當(dāng)吐溫80的加入量相對(duì)木質(zhì)素磺酸鈉為0.3～1 時(shí)，酶水解效率增加平緩，當(dāng)m(吐溫80)∶m(LS)為1∶1 時(shí)，酶水解效率最高為99.98%，即酶水解體系中的固體基質(zhì)中的纖維素基本全部轉(zhuǎn)化為還原糖。再增加吐溫80 的相對(duì)加入量，酶水解效率略有降低?？傮w而言，吐溫80 的加入，可明顯提高酶水解效率。

圖6 吐溫80與木質(zhì)素磺酸鈉的質(zhì)量比對(duì)酶水解效率的影響

3 結(jié) 論

本研究以木質(zhì)素磺酸鈉為主要助劑，考察其對(duì)經(jīng)金屬氯鹽預(yù)處理的桉木粉在高固體系纖維素酶水解中的影響。

3.1 木質(zhì)素磺酸鈉作為陰離子表面活性劑，可促進(jìn)高濃度固體基質(zhì)的流動(dòng)性，防止纖維素酶與底物中木質(zhì)素的“無(wú)效吸附”，可顯著提高高固體系纖維素酶水解的效率，降低生產(chǎn)成本。

3.2 在酶水解體系中添加0.4%的木質(zhì)素磺酸鈉，酶水解效率可達(dá)93.72%，比未添加樣品提高了12.50%；并且底物濃度越大，木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)酶水解效率的優(yōu)化作用越大，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?7%時(shí)，添加木質(zhì)素磺酸鈉，可將酶水解效率提高13.0個(gè)百分點(diǎn)。

3.3 將木質(zhì)素磺酸鈉分別與CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）和吐溫80 兩種表面活性劑復(fù)配，結(jié)果表明，表面活性劑復(fù)配對(duì)高固體系的纖維素酶水解效率均有協(xié)同促進(jìn)作用；當(dāng)m(CTAB)∶m(木質(zhì)素磺酸鈉)為1.5∶1時(shí)，酶水解效率可達(dá)99.56%；當(dāng)m(吐溫80)∶m(木質(zhì)素磺酸鈉)為1∶1 時(shí)，酶水解效率為99.98%，纖維素基本可完全水解為還原糖。