紅豆杉資源提取紫杉醇技術(shù)進展

韓木先，祝劍峰，李 輝，王祖才，姚敏敏

（湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學院生態(tài)環(huán)境學院，湖北武漢 430200）

紫杉醇是一種天然抗癌活性物質(zhì)，被用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌等，同時也在研究與其他抗癌藥物聯(lián)用的治療方法，是獲得FDA 批準的第一個來自天然植物的化學藥物[1]，其臨床應(yīng)用范圍正逐步擴展[2]。

當前，只發(fā)現(xiàn)紫杉醇天然存在于紅豆杉屬和澳洲紅豆杉屬植物中，且它們紫杉醇含量極低，僅僅為干質(zhì)量的0.005% ～0.07%，而且不同的植物種屬以及不同的植物器官含量有較大差異[3]。因為紅豆杉類植物生長特別緩慢，紫杉醇在樹皮中的含量最高，但紅豆杉樹剝了樹皮會死亡。要獲取天然紫杉醇，需要新剝?nèi)淦さ戎参锝M織，再提取，如從砍伐樹木、收集、分離、萃取紫杉醇，人力物力財力耗費極大，消耗森林資源，難產(chǎn)業(yè)化。因天然紫杉醇提取難實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，從植物中提取代價太高，紫杉醇原料來源不足，尋找新的植物資源、新技術(shù)迫在眉睫。利用紅豆杉資源提取紫杉醇的技術(shù)，迄今為止已經(jīng)探索出利用生物技術(shù)的離體培養(yǎng)法、內(nèi)生菌培養(yǎng)法、微生物轉(zhuǎn)化法等多種方法獲得紫杉醇[1，4-5]。近年來，如何獲取紅豆杉資源和得到紫杉醇的新技術(shù)，已成為研究熱點。

1 離體培養(yǎng)法

離體培養(yǎng)，又稱植物組織培養(yǎng)或植物無菌培養(yǎng)，是利用植物離體的器官、植物組織或植物細胞以及原生質(zhì)體等，通過無菌、人工培養(yǎng)基及適宜溫度等條件誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后得到植株的技術(shù)。

離體培養(yǎng)法是得到紫杉醇的重要方法，也是合成前體紫杉醇來源的一重要技術(shù)，因其無污染、不破壞自然資源及不受自然條件的限制，得到迅速發(fā)展。

1.1 細胞培養(yǎng)法

細胞培養(yǎng)法指通過體外模擬體內(nèi)環(huán)境，使細胞生存、生長、繁殖，該方法能維持細胞主要結(jié)構(gòu)和功能[6]。

研究表明，早在 20世紀70 年代，針對歐洲紅豆杉，早有胚培養(yǎng)的研究。Zeldin等的研究結(jié)果顯示，大量的研究集中在紅豆杉的細胞培養(yǎng)上，培養(yǎng)的種或變種大部分已證實有紫杉醇產(chǎn)生[7]。美國 Christen等于1989年，已通過對太平洋紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)出紫衫醇[8-9]。不久以后，日本、德國和韓國等相續(xù)報道了可以通過細胞培養(yǎng)的技術(shù)，獲取高含量的紫杉醇。梅興國等的研究顯示，通過對比研究兩相培養(yǎng)系統(tǒng)中紅豆杉細胞的生長與代謝規(guī)律，40d培養(yǎng)后，紫杉醇的產(chǎn)量為 30.19mg/L[10]。這些研究顯示，紅豆杉懸浮細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇，進而實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，有望實現(xiàn)。趙晶以東北紅豆杉為原料，通過檢測技術(shù)的優(yōu)化、誘導、高產(chǎn)細胞篩選，建立了細胞懸浮體系，并通過添加代謝調(diào)節(jié)因子提高細胞懸浮體系中的紫杉醇產(chǎn)量，初步構(gòu)建了高效獲取紫杉醇的技術(shù)體系[11]。李純以東北紅豆杉幼莖為材料，在適宜的（補光）環(huán)境條件下，對東北紅豆杉愈傷組織誘導，然后不斷地進行繼代培養(yǎng)，選擇紫杉醇含量高且穩(wěn)定的愈傷組織，進行高產(chǎn)細胞株系的篩選，并對細胞懸浮培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得到一套優(yōu)化工藝[12]。

由于該方法不受自然條件限制，紫杉醇產(chǎn)量較高等優(yōu)點，是當今實現(xiàn)紫杉醇工業(yè)化生產(chǎn)最有前途的方法。

1.2 發(fā)根培養(yǎng)法

發(fā)根培養(yǎng)法是離體培養(yǎng)的另一方向，是通過發(fā)根土壤桿菌誘導紅豆杉細胞，得到發(fā)根，然后大量培養(yǎng)，再從中提取紫杉醇[6，13]。Vikas Srivastava等詳細介紹了發(fā)根培養(yǎng)法的應(yīng)用、前景、應(yīng)用案例等[14]。因為發(fā)根生長速率快、遺傳穩(wěn)定，并且正常根的分化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，發(fā)根培養(yǎng)法很有希望成為獲取產(chǎn)紫杉醇的重要技術(shù)。

黃遵錫等的研究結(jié)果表明，通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導紅豆杉芽外植體，誘導出的毛狀根，40d后轉(zhuǎn)化率達到30%。經(jīng)反應(yīng)檢測，毛狀根中的紫杉醇含量達到短葉紅豆杉愈傷組織的1.3～8.0倍，過程中，毛狀根也分泌了紫杉醇[15]。盛長忠等的研究表明，通過誘導愈傷組織，20d 的愈傷組織對該細菌比較敏感，當感染時間為5min時，冠癭誘導率達到15.0 %，對冠癭組織檢測顯示，有特異的胭脂堿存在并產(chǎn)生了紫杉醇[16]。Katarzyna Syklowska-Baranek等研究了兩種前體l-苯丙氨酸和對氨基苯甲酸對紅豆杉培養(yǎng)物中紫杉醇的生長和積累的影響，l-苯丙氨酸可使紫杉醇產(chǎn)量從40.3μg/L至568.2μg/L，而對氨基苯甲酸對紫杉烷產(chǎn)量的影響不太明顯，紫杉醇產(chǎn)量最高（221.8μg/L）[17]。

該技術(shù)前景很好：發(fā)根生長速度快，不需要植物激素，有穩(wěn)定的遺傳性，且正常根的分化結(jié)構(gòu)及次生代謝含量高。但當前該工藝尚未成熟，還不足以支撐紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)[18，19]。

2 內(nèi)生菌法

Stierle等人1993年的研究結(jié)果表明，可利用內(nèi)生植物真菌來生產(chǎn)紫杉醇和相關(guān)的紫杉烷，檢測結(jié)果顯示為，產(chǎn)生了紫杉醇，并且是由真菌生成的。隨后，他們又分離到一株內(nèi)生真菌—小孢擬盤多毛孢菌，其發(fā)酵水平又比內(nèi)生植物真菌略高。該研究具有重要研究意義和潛在的商業(yè)價值，但紫杉醇含量偏低，近期難以實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。Yong-Cheng Li等研究了紫杉醇積累過程中內(nèi)生真菌與其宿主的相互作用。Zaiyou J等研究用分離出的高效生產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，用于紫杉醇的生產(chǎn)，效果良好。

真菌法是近年來研究的熱點，但菌種的獲得、保存較困難，目前僅可得到微克級的紫杉醇，就商業(yè)化生產(chǎn)目標，目前的研究現(xiàn)狀，任重而道遠。

3 微生物轉(zhuǎn)化法

通過生物酶類的高度選擇性，將得到的紫杉醇結(jié)構(gòu)類似的一些紫杉烷類化合物，轉(zhuǎn)化得到紫杉醇的半合成前體，通過簡化分離過程，提高了資源的利用率。目前，紫杉醇類似物之間基因修飾以獲得更高活性的新化合物，已經(jīng)成為一個新的研究領(lǐng)域，已有一些以紫杉烷類化合物為底物進行生物轉(zhuǎn)化的、有意義的研究，但該技術(shù)還遠未成熟，未能達到商業(yè)化生產(chǎn)。

4 紫杉醇研究的展望

由于全球環(huán)境的不斷惡化及人類對健康長壽的期望，醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⑾脑絹碓蕉嗟淖仙即?。目前還無法從紅豆杉資源大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇，導致紫杉醇價格昂貴，許多病人無法支付其費用。如何充分利用紅豆杉資源大規(guī)模得到并利用好紫杉醇，已成為研究的重點領(lǐng)域。