Xpert Ultra超敏結(jié)核分枝桿菌基因檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用

天津市海河醫(yī)院（300222）韓東

1 概述

結(jié)核病(T B)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染所造成的傳染性疾病，在全球感染人數(shù)眾多，我國不但是全球結(jié)核病嚴重流行的國家之一，同時也是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)嚴重流行的國家[1]。結(jié)核病主要的診斷方法包括抗酸桿菌涂片染色鏡檢法和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法?？顾崛旧R檢法應(yīng)用廣泛，快速經(jīng)濟，但靈敏度較低；結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法為結(jié)核病診斷的金標準，但耗時較長，無法快速獲得結(jié)果，往往延誤疾病的診治。

在過去的幾十年里，使用聚合酶鏈反應(yīng)（polyrnerase chain reaction，P CR）從臨床標本中直接檢測結(jié)核分枝桿菌的DNA，使結(jié)核病的微生物診斷技術(shù)水平得到了顯著地提高。Xpert MTB/RIF (Xpert)檢測技術(shù)是一種以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)原理為基礎(chǔ)的體外診斷技術(shù)，通過核酸提取、擴增和檢測，將處理后的待檢標本放入密閉的反應(yīng)盒中，通過上述三位一體操作程序自動檢出痰標本是否菌陽、荷菌量多少，以及是否對利福平耐藥。這極大地縮短了檢測時間， 可以使確診患者更早的應(yīng)用抗結(jié)核藥物[2]，Xpert 比抗酸桿菌涂片染色鏡檢法更敏感、特異性更高，被世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦為結(jié)核病的快速診斷方法[3]，但是Xpert同樣也存在著許多的不足，由于Xpert的檢測限（LOD）為131菌落形成單位(cFU)／ml，相較于培養(yǎng)的LOD僅為1-10(cFU)／ml，其敏感性低于結(jié)核菌培養(yǎng)，除此之外Xpert的利福平耐藥性檢測還會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[4][5]。因此在2017年3月WHO推薦了一種新的檢測方法Xpert Ultra，這種檢測方法對結(jié)核分枝桿菌DNA檢測的敏感性更高，rpoB基因突變檢測的特異性更強，顯著提高了結(jié)核病的診斷水平。本文通過分析最新研究結(jié)果，比較了Xpert和Xpert Ultra在不同結(jié)核病發(fā)病地區(qū)以及不同發(fā)病部位中的表現(xiàn)，來討論Xpert Ultra在臨床工作中的的應(yīng)用。

2 Xpert Ultra在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

2.1 敏感性 一項通過對五個國家的回顧性研究，比較了277例呼吸道標本中結(jié)核分枝桿菌的檢測結(jié)果，在培養(yǎng)陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性分別為88.7%和81%，在涂片陽性培養(yǎng)陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性是98.9%和97.8%，在涂片陰性培養(yǎng)陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性是78.9%和66.1%。在一項包括2368名參與者的前瞻性多中心研究中，在培養(yǎng)陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性分別為88%和83%，涂片陰性培養(yǎng)陽性的標本中Xpert Ultra和xpert的敏感性是63%和46%[6]。這些數(shù)據(jù)顯示在涂片陽性標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性無明顯差異，但在涂片陰性標本中Xpert Ultra的靈敏度更高。在結(jié)核病低流行地區(qū)進行的一項研究也得到了類似的結(jié)果，培養(yǎng)陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性是95.7%和82.9%，涂片陽性培養(yǎng)陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性都是100%，涂片陰性培養(yǎng)陽性的標本中Xpert Ul tra和Xpert的敏感性是91.8%和66.7%，這表明Xpert Ultra對含菌量低標本的敏感性更高。這一優(yōu)勢有助于提高例如粟粒性結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎或早期結(jié)核菌感染等情況下，含菌量較低的臨床標本的診斷率[7]。尤其在HIV感染患者中，結(jié)核病患病率及死亡率均高于普通人群[8][9]，因此對于此類患者結(jié)核菌感染的檢測十分重要。一項研究觀察到，在HIV陰性患者中，Xpert Ultra和Xpert的敏感性為別91%和90%，并無顯著差異，但在HIV陽性患者中，Xpert Ultra的敏感性仍維持在90%，Xpert的敏感性卻下降到了77%[6]。在另外一項研究中也同樣發(fā)現(xiàn)，HIV陰性患者中，Xpert Ultra相較于Xpert并無顯著優(yōu)勢，但在HIV陽性患者中，Xpert Ultra的敏感性增加了11.7%[10]，更高的檢測敏感性可以幫助患者更早地接受抗結(jié)核治療，降低致死率。

兒科病人的敏感性：對于兒童人群的結(jié)核病診斷十分具有挑戰(zhàn)性。在一項包含453名符合條件兒童的研究中，Xpert Ultra對于呼吸道標本的敏感性和特異性分別為75.3%和96.9%[11]。對于感染HIV的兒童和未感染者HIV的兒童，Xpert Ultra的敏感性相似；在這項研究中，HIV的感染率為19.4%。不同的參考標準會得到不同的結(jié)果，當(dāng)以呼吸道標本的培養(yǎng)結(jié)果作為參考時，Xpert Ultra和Xpert在呼吸道標本上測定的靈敏度分別為65.8%和64.4%。當(dāng)以包含Xpert、Xpert Ultra、培養(yǎng)以及臨床資料的綜合信息作為參考時，Xpert Ultra的敏感性為73.7%，高于Xpert的63.2%[13]。在坦桑尼亞的另一項包含兩個中心研究中，培養(yǎng)陽性標本的Xpert Ultra靈敏度達到64.3%，相比于Xpert 的53.6%，Xpert Ultra在靈敏度上更為領(lǐng)先。同時在所有可用的標本中，相當(dāng)于平均每個病人2.46和2.11個樣本，Xpert Ultra和Xpert的靈敏度分別為75%和60.7%[12]。對于這兩種檢測方法，僅檢測首次標本時，特異性均為100%；但對于所有測試標本，Xpert Ultra的特異性為98.1%；Xpert的特異性仍為100%。在HIV未感染患者中，Xpert Ultra和Xpert的敏感性并沒有顯著差異，分別為52.6%和47.4%。相反的，在HIV感染患者中，Xpert Ultra的敏感度為88.9%，明顯高于Xpert 66.7%的敏感度。這項研究表明，與Xpert相比，Xpert Ultra的敏感性更高，尤其是在HIV陽性的兒童患者中，而這部分兒童患者可以占到所有研究患者總數(shù)的52%，比例相當(dāng)?shù)母遊12]。

2.2 特異性 在結(jié)核病高發(fā)病率地區(qū)進行的幾項研究表明，以結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)果為參照標準，與Xpert相比，Xpert Ultra的敏感性雖然增加，但與Xpert 98.7%的特異性相比，Xpert Ultra的特異性略有降低至96%[8]?；诰酆厦告湻磻?yīng)可以檢測到標本中在抗結(jié)核藥物治療后殺死的結(jié)核桿菌以及既往存在結(jié)核病史患者殘存的結(jié)核菌DNA，因此無法區(qū)分標本中的結(jié)核菌是死的桿菌還是活的桿菌，從而影響測試特異性的準確性[13][14][15]，而這種情況更可能發(fā)生在檢測敏感性更高的Xpert Ultra中，這也解釋了為何其特異性較Xpert略低。此外，與肺結(jié)核低發(fā)病率的地區(qū)相比，高發(fā)病率地區(qū)由于患者既往肺結(jié)核病史發(fā)生率更高，從而更容易導(dǎo)致檢測特異性的降低[8][16]。Xpert Ultra的檢測結(jié)果在原來Xpert的“高、中、低、極低”4個級別的基礎(chǔ)上增加了“微量”，共5個級別。Xpert檢測中不存在“微量”這個類別，與該類別相對應(yīng)的是多拷貝基因IS6110和IS1810陽性以及單拷貝基因rpoB陰性的PCR樣本，“微量”類別的出現(xiàn)是LOD提升的結(jié)果，會導(dǎo)致檢測特異性降低。Xpert Ultra檢測中“微量”結(jié)果表示檢測到極少量結(jié)核分枝桿菌DNA，有助于區(qū)分以前感染的死桿菌和正在進行的活動性肺結(jié)核，但需要注意的是當(dāng)檢測值為“微量”時，利福平的耐藥性無法判斷，這與Xpert Ultra的耐藥性檢測機制相關(guān)。

3 Xpert Ultra在肺外結(jié)核診斷中的應(yīng)用

許多研究都表明Xpert對于肺外結(jié)核的診斷結(jié)果可能會因為被測樣本的不同而有所不同。最近的一項關(guān)于Xpert的研究表明：腦脊液檢測結(jié)核菌的敏感性和特異性為71.1%和98%，胸腔積液的敏感性和特異性分別為50.9%和99.2%，而尿樣的敏感性和特異性為82.7%和98.7%[17]。到目前為止，有關(guān)Xpert Ultra對肺外結(jié)核診斷的研究還比較少。其中一項研究只選擇了涂片陰性的標本進行研究，其標本總體敏感性和特異性分別為75.9%和100%，另外的研究[18][19]顯示在含菌量較低的標本中，胸腔積液的敏感性僅為60.5%，其他部位的標本中腦脊液的敏感性為100%（3/3），關(guān)節(jié)液的敏感性為87.5%（7/8），腹腔積液的敏感性為33.3%（1/3），心包積液的敏感性為66.6%（2/3），尿液標本的敏感性為100%（12/12）。在這個研究中所有被檢測標本的特異性均為100%。然而，由于樣本數(shù)量較少，本文所得到的結(jié)果需要通過包含更多樣本的研究去進一步驗證。在一項包括200例肺外結(jié)核患者的回顧性研究中，Xpert Ultra和Xpert的總體敏感性分別為83.7%和67.4%，特異性為92%和96%，研究中包括103例胸腔積液標本，其中Xpert Ultra和Xpert的檢出率分別為43.7%和20.4%，研究中還包括71個組織穿刺標本，Xpert Ultra和Xpert的檢出率分別為78.9%和63.4%，略高于胸水。在另外一項包含108名患者的研究中，其胸腔積液樣本的Xpert Ultra和Xpert敏感性分別為61.11%和34.26%。國內(nèi)關(guān)于Xpert Ultra對于肺外結(jié)核標本的檢測研究還比較少見，但先前的一系列關(guān)于Xpert在肺外結(jié)核標本中的研究[20][21]均顯示其敏感性不足。

結(jié)核性腦膜炎是一種危及生命的肺外結(jié)核疾病，對于它的診斷仍然非常具有挑戰(zhàn)性，延誤診治會導(dǎo)致死亡率增高，在艾滋病感染患者中尤其明顯[22]。由于結(jié)核性腦膜炎是一種含菌量較低的結(jié)核感染，所以對于腦脊液的微生物診斷敏感性不高。最初Xpert Ultra和Xpert并不被推薦應(yīng)用于腦脊液的微生物檢測，但一些研究也在嘗試兩者在腦脊液中的應(yīng)用，在一項包含43例HIV陰性結(jié)核性腦膜炎患者的研究中，Xpert的敏感性為18.60%，而Xpert Ultra的敏感性較Xpert提高了44.19%。在另一項包含23例HIV陽性結(jié)核性腦膜炎患者的研究中，Xpert Ultra和Xper的敏感性分別為70%和43%。同時這項研究還強調(diào)結(jié)核性腦膜炎的腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)陽性率非常低[23]。在這項研究中，只使用了1ml離心的腦脊液用于Xpert和Xpert Ultra檢測，而微生物診斷與標本得量是呈正相關(guān)的，但在實際工作中常常無法獲得大量的腦脊液標本，這也是結(jié)核性腦膜炎診斷具有挑戰(zhàn)性的另一個原因。國內(nèi)的另一項研究表明，在同樣使用1～2ml腦脊液標本進行檢測時，Xpert Ultra的檢測敏感性顯著高于Xpert，這也表明Xpert Ultra更適用于實際臨床工作中。

總之，這些數(shù)據(jù)表明Xpert Ul tra較Xpert對于肺外結(jié)核的診斷敏感性更高。然而值得注意的是，這些測試結(jié)果在不同標本中存在較大差異，且由于研究的數(shù)量以及其包含的樣本數(shù)量均有限，其準確性仍需要更多的樣本去進一步驗證。

4 利福平耐藥檢測

Xpert的主要局限性是在利福平耐藥性檢測中出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)在MDR-TB<5%以及MDR-TB>15%范圍內(nèi)利福平耐藥檢測陽性預(yù)測值在70%～90%之間[4][24]，這是因為利福平耐藥性的檢測依賴于rpoB基因81 bp區(qū)域特異性DNA探針的缺失突變，而這種突變更容易出現(xiàn)在含菌量較少的樣本中。在Xpert Ultra中，檢測原理由半定量半巢式循環(huán)閾值的比較變?yōu)榘攵砍彩骄酆厦告湻磻?yīng)，運用了高分辨率熔解曲線技術(shù)，可更好地區(qū)分ropB突變種類，因此提高了利福平耐藥性檢測的準確性，降低了假陽性結(jié)果的幾率[6]。

由于兩種測試都針對單拷貝基因rpoB，Xpert Ultra和Xpert檢測利福平耐藥的靈敏度相似（92.7%～95%），同時Xpert Ultra對利福平耐藥檢測的特異性為98%和Xpert 99%的特異性并沒有顯著差異[8]。所以我們有必要對更多含菌量較低，相應(yīng)的也包含DNA含量更低的結(jié)核分枝桿菌標本進行研究，以評估新的耐藥檢測技術(shù)的可靠性。

5 結(jié)論

Xpert以及最近出現(xiàn)的Xpert Ultra正在被越來越多的應(yīng)用于臨床工作中，仔細了解這兩種檢測方法的優(yōu)勢及其局限性十分重要，本文對比較Xpert Ultra和Xpert兩種檢測技術(shù)性能的相關(guān)文獻進行了回顧。Xpert技術(shù)擁有較高的敏感度和特異性，可以精準、迅速地檢測出利福平耐藥基因（ropB突變基因），在臨床上對結(jié)核病的診斷上發(fā)揮了重要的意義，同時顯著提升了利福平耐藥性和MDR-TB 的檢測水平，不足的是雖然Xpert檢測痰標本總的敏感度很高，但對含菌量較少的標本檢測的敏感度較低。Xpert Ultra將檢測目的基因ropB的5條探針增加到6條探針，降低了Xpert MTB/RIF Ultra的LOD，使其接近于培養(yǎng)，提高了在菌量較少情況下的敏感性，因此Xpert Ultra的整體靈敏度高于Xpert，尤其對結(jié)核性胸膜炎和菌陰結(jié)核等含菌量較低標本[8][21]。

作為一種基于PCR的檢測方法，在既往結(jié)核病病史患者的非活動結(jié)核桿菌中，Xpert Ultra仍能夠檢測出相應(yīng)DNA，這種假陽性結(jié)果的出現(xiàn)會導(dǎo)致檢測特異性降低，而這種特異性降低在結(jié)核病高發(fā)地區(qū)更容易出現(xiàn)[11]，所以在臨床工作中遇到結(jié)核病復(fù)治的患者，需要全面地分析患者的病史、癥狀、體征、影像學(xué)檢查以及其他實驗室檢查等，不能單獨以Xpert Ultra結(jié)果確定患者是否存在活動性。

到目前為止，評估Xpert Ultra肺外結(jié)核診斷價值的文獻相對較少，涉及的樣本數(shù)量也相對有限，絕大多數(shù)的研究對象大多是呼吸道標本，因此對于呼吸道以外標本進行檢測，其結(jié)果的準確性及參考價值仍需謹慎對待。

對于利福平耐藥性進行的研究并未發(fā)現(xiàn)Xpert Ultra在檢測敏感性以及特異性方面有所提高。由于PCR檢測的目標基因仍然是單拷貝基因rpoB，并未預(yù)期其在敏感性方面能有所提高，但相比之下，由于引入了高分辨率熔解曲線技術(shù)，預(yù)計其特異性會有所提高，但和Xpert之間仍未出現(xiàn)明顯差異，造成這種結(jié)果的原因可能是由于Xpert Ultra技術(shù)的檢測優(yōu)勢在含菌量較低標本中更加明顯，相應(yīng)的也就是在耐多藥結(jié)核病發(fā)病率低的地區(qū)，而迄今為止，大多數(shù)研究都是在耐多藥結(jié)核病發(fā)病率較高的地區(qū)進行的。

綜上所述，Xpert Ultra在HIV陽性肺結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎或結(jié)核性胸膜炎等標本含菌量較低的情況下，對于結(jié)核病診斷敏感性顯著提高。Xpert Ultra技術(shù)總體提升了結(jié)核病的診斷水平，但是需要注意的是陰性的Xpert Ultra檢測結(jié)果仍不能完全排除結(jié)核病。盡管結(jié)核菌培養(yǎng)同樣存在假陰性的情況，但培養(yǎng)仍是結(jié)核病診斷的重要參考指標之一。因此，臨床工作中需要結(jié)合患者的臨床特點，微生物學(xué)檢測結(jié)果以及諸如Xpert Ultra這類新的PCR檢測技術(shù)的結(jié)果綜合分析，使結(jié)核病的診斷更加可靠。