基于葉綠體片段序列的蘋果屬植物遺傳多樣性

高 源,王大江,王 昆,李連文,樸繼成

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點實驗室,遼寧 興城 125100)

遺傳多樣性研究是揭示物種的進(jìn)化歷史[1]、分析其進(jìn)化潛力和未來命運[2]、探討物種稀有或瀕危原因[3]的重要工具。從分子水平上研究植物的遺傳多樣性水平、遺傳結(jié)構(gòu)及其形成機(jī)制有利于揭示物種應(yīng)對環(huán)境變化的進(jìn)化潛力,對其遺傳多樣性的保護(hù)及保護(hù)計劃的制定都具有非常重要的意義[4-6]。

蘋果屬(MalusMill.),屬薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科(Maloideae)。中國是世界蘋果屬植物最大的基因中心和遺傳多樣性中心,擁有豐富的原始種和類型。其中有自然分布區(qū)并訂有學(xué)名未經(jīng)整理的野生種有21種,有栽培分布區(qū)的栽培種和雜交種共6種,至今許多地方仍有蘋果野生群落分布,如新疆野蘋果等[7-8]。目前,普遍認(rèn)為我國蘋果屬植物野生種有兩大密集分布地區(qū),即以新疆野蘋果為主的新疆密集分布區(qū)和主要包括四川、云南西部、貴州及西藏東南部地區(qū)的橫斷山脈分布區(qū)[9]。除此之外,蘋果屬植物野生種在我國17個省或自治區(qū)均有分布[10],其中以山荊子分布最廣,在各個調(diào)查分布區(qū)幾乎都可以找到,其次為變?nèi)~海棠、湖北海棠和三葉海棠。

薔薇科葉綠體基因組高度保守,非編碼區(qū)進(jìn)化速度較快,變異主要以點突變和插入/缺失為主[11],適用于科和屬的系統(tǒng)研究[12],在植物遺傳多樣性親緣演化關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[13]。國外學(xué)者較早地開展蘋果屬植物一至兩個葉綠體DNA(cpDNA)區(qū)域的變異研究[14],國內(nèi)利用葉綠體基因matk對蘋果屬植物的研究得出葉綠體基因matk并不適用于栽培蘋果種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育分析以及近緣種間及種下類群材料的遺傳關(guān)系分析的結(jié)論[15-16];僅僅利用一個葉綠體基因區(qū)域trnL-trnF也難以解析具有復(fù)雜遺傳背景的泰沂山區(qū)蘋果屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[17]。利用葉綠體基因進(jìn)行果樹種質(zhì)資源系統(tǒng)發(fā)育研究已經(jīng)由基因間隔區(qū)發(fā)展到具有多態(tài)性的多個基因間隔區(qū)組合分析的階段[18]。新的蘋果參考基因組的發(fā)布[19-20]并未獲得完整的葉綠體基因組,要利用葉綠體DNA對具有復(fù)雜遺傳背景的蘋果屬植物的遺傳變異分析,仍然需要用大群體、進(jìn)化速率快的多個區(qū)域方可實現(xiàn)。因此,本研究在對我國蘋果屬植物種質(zhì)資源進(jìn)行考察收集和保存的基礎(chǔ)上,利用葉綠體基因序列(trnH-psbA、trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF)研究其遺傳多樣性水平,解析不同種群內(nèi)和種內(nèi)居群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化,探討不同種在不同區(qū)域范圍內(nèi)單倍型的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,推測蘋果屬植物不同種的起源演化進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試722份蘋果屬植物種質(zhì)來自于12個省和地區(qū),分屬于蘋果屬的15個種(表1)。所有種質(zhì)為近10 a間野外考察新收集材料,通過野外表型鑒定外相應(yīng)的蘋果屬各種后,入國家蘋果資源圃繁殖保存。因此，供試材料中有669份取自遼寧興城國家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃,48份取自吉林省公主嶺國家果樹種質(zhì)公主嶺寒地果樹圃,5份取自云南省昆明國家果樹種質(zhì)云南特有果樹及砧木圃。

表1 蘋果屬植物的722份種質(zhì)資源

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

供試材料春季嫩葉的基因組DNA,采用德國QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit提取。利用紫外分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA原液的濃度和純度,經(jīng)檢驗合格后稀釋至40 ng/μL備用。

篩選26個葉綠體DNA基因間區(qū)的36對通用引物,經(jīng)過擴(kuò)增和預(yù)測序檢測,挑選擴(kuò)增穩(wěn)定、序列無回文結(jié)構(gòu)、poly結(jié)構(gòu)較少、雙向測序可以測通的區(qū)域,最終確定Shaw等[21]報道的葉綠體DNA序列中的4個基因間區(qū)trnH-psbA、trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF對應(yīng)的4對通用引物(表2),交由上海生工(Sangon)有限公司合成。4對通用引物PCR反應(yīng)體系參照高源等[22]優(yōu)化的反應(yīng)體系,PCR擴(kuò)增條件參照Volk等[23]報道的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,具體反應(yīng)程序如下:

表2 4個葉綠體DNA基因間區(qū)及4對通用引物序列基本信息

CP20:80 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min,4 ℃保存待用。

CP21與CP23相同:80 ℃ 5 min;96 ℃10 s,50 ℃退火5 s,60 ℃ 4 min,30個循環(huán);60 ℃ 10 min,4 ℃保存待用。

CP22:96 ℃ 5 min;96 ℃ 1 min,57 ℃退火2 min,72 ℃ 2.5 min,34個循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存待用。

用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,擴(kuò)增得到單一條帶的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行正、反向測序,所有材料的4個葉綠體DNA基因間區(qū)測通。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

人工校對722份材料的4個葉綠體DNA基因間區(qū)trnH-psbA、trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF的正反向測序的序列,使用MEGA 7.0[24]軟件拼接、比對和合并,使用DnaSP ver5.10.01[25]軟件計算供試種質(zhì)在葉綠體DNA水平的遺傳多樣性參數(shù)以及單倍型,經(jīng)過中介鄰接網(wǎng)絡(luò)(MJ,Median-Joining network)算法和最大簡約(MP,Maximum Parsimony)算法計算和優(yōu)化后,運用NetWork ver4.6.1.2構(gòu)建葉綠體DNA單倍型鄰接網(wǎng)絡(luò)圖,通過Arlequin v3.5[26]軟件對標(biāo)準(zhǔn)分子變異分析(Analysis of molecular variation,AMOVA)評價種群間和種群內(nèi)的遺傳分化。具體參照高源等[22]的分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果屬植物葉綠體DNA變異

4對葉綠體通用引物對722份中國原產(chǎn)蘋果屬植物種質(zhì)的4個葉綠體DNA基因間區(qū)trnH-psbA、trnS-trnGspacer+intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF進(jìn)行擴(kuò)增,獲得序列長度分別為343,1 457,1 336,984 bp,合并后的序列長度為4 120 bp。722份材料的4個葉綠體DNA基因間區(qū)共有579個變異位點(Vs),其中15個為單一突變位點(Ss)、36個為簡約信息性位點(Ps)和528個為插入-缺失位點(Is)。其單倍型數(shù)目(h)分別為48,24,24,10個,單倍型(基因)多樣性(Hd)最高的區(qū)域是trnH-psbA,最低的區(qū)域是5′trnL-trnF,分別為0.808和0.577。核苷酸多樣性(Pi)最大和最小的區(qū)域分別為trnH-psbA(Pi=0.034 09)和5′trnL-trnF(Pi=0.000 78)。722份蘋果屬植物種質(zhì)的4個cpDNA區(qū)域組合后的片段,共有100個單倍型,核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異(K)、單倍型多樣性(Hd)、單倍型多樣性方差(Vh)和標(biāo)準(zhǔn)差(Sh)分別為 0.009 52,39.021 33,0.879,0.000 06,0.008(表3)。

表3 722份蘋果屬植物的4個葉綠體DNA基因間區(qū)的多態(tài)性

2.2 蘋果屬植物的遺傳分化

供試的722份蘋果屬植物分屬于15個種,將每個種作為一個種群,每個種群按照來源區(qū)域分成不同居群。722份蘋果屬植物種質(zhì)可以為15個種群、44個居群,種群和居群標(biāo)準(zhǔn)分子變異分析(AMOVA)結(jié)果表明,種群間的遺傳變異占41.93%,種內(nèi)不同居群間的遺傳變異占6.11%,而種內(nèi)各居群內(nèi)的遺傳變異占51.96%(表4)。所有可遺傳變異的相關(guān)性均極顯著(P<0.001)。

表4 蘋果屬15個種和種內(nèi)居群的分子變異

2.3 蘋果屬植物種群歷史變化動態(tài)分析

對722份蘋果屬植物種質(zhì)的4個葉綠體DNA基因間區(qū)進(jìn)行Tajima′s測驗(表5),Tajima′s D值全部為負(fù)值,最低值和最高值的區(qū)域分別5′trnL-trnF和trnH-psbA,值分別為-2.334 90和-0.226 34。區(qū)域trnS-trnGspacer+intron和5′trnL-trnF的D值分別在P<0.05和P<0.01的水平上顯著,區(qū)域trnH-

表5 722份蘋果屬植物4個葉綠體DNA基因間區(qū)的Tajima′s測驗

2.4 蘋果屬植物單倍型分布

4個區(qū)域合并之后的葉綠體基因片段共有單倍型100個。新疆野蘋果的單倍型最多,242份新疆野蘋果種質(zhì)有52個單倍型,其中有72份種質(zhì)集中在單倍型H_15,有76份種質(zhì)集中在單倍型H_42,其余新疆野蘋果分散在其余的50個單倍型中。山荊子有24個單倍型,其中有105份山荊子集中在單倍型H_6中,有10份種質(zhì)落在單倍型H_10中,還有13份種質(zhì)在單倍型H_18中。變?nèi)~海棠主要集中在單倍型H_4中,花葉海棠也主要集中在H_4中,垂絲海棠主要集中在H_6和H_24,湖北海棠的2份種質(zhì)中有1份獨享單倍型H_3,另1份屬單倍型H_31。中國蘋果主要集中在單倍型H_6、H_10和H_15,花紅以H_6中最多,其余分散在12個單倍型中;楸子以H_6中最多,其余種質(zhì)分散在13個單倍型中;八棱海棠共有8個單倍型,以H_6中種質(zhì)最多;西府海棠4份種質(zhì)分成了3個單倍型。隴東海棠、滇池海棠、滄江海棠和山楂海棠均分別獨享一個單倍型。

分別運用中介鄰接網(wǎng)絡(luò)(MJ)算法和最大簡約算法(MP)來計算和優(yōu)化722份蘋果屬植物種質(zhì)的4個葉綠體DNA基因間區(qū)組合的單倍型關(guān)聯(lián)關(guān)系,構(gòu)建單倍型關(guān)聯(lián)圖(圖1)。H和mv分別表示單倍型和中介矢量位點,主干由23個中介矢量位點和20個單倍型組成,23個中介矢量位點仍然為缺失單倍型。位于網(wǎng)絡(luò)圖中心區(qū)域的單倍型為mv8、mv9、mv16、mv17和mv18,均為缺失單倍型,其向3個方向擴(kuò)散,其一是由mv17向外擴(kuò)散至H_6,并形成由H_6、H_43、H_45和mv11組成的閉合環(huán);其二是由mv8逐步經(jīng)過單倍型H_21、H_89、mv6,并形成由mv1、mv4、mv6和H_87組成的閉合環(huán);其三是由mv16分化為mv18和H_70,mv18和H_70的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),mv18形成2個分支,H_70也有2個分支,并在其中一個分支的末端具有星狀輻射。由此,由中心區(qū)域不斷衍生形成有4個主要支系,第一支系是以單倍型H_6為代表,第二支系以H_15為代表,第三支系主要由H_3、H_4、H_29、H_31、H_41和H_51組成,第四支系以H_10為代表。

圖1 蘋果屬15個種的4個cpDNA區(qū)域組合的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.1 第一支系單倍型分布 網(wǎng)絡(luò)圖中H_6代表一個單倍型組合,包含單倍型H_6、H_11、H_12、H_19、H_26、H_33、H_36、H_38、H_44。單倍型H_6包含30份八棱海棠、4份垂絲海棠、13份花紅、16份楸子、105份山荊子(河北24份、黑龍江45份、吉林12份、遼寧1份、內(nèi)蒙古14份、山西9份)、1份西府海棠、1份新疆野蘋果和19份中國蘋果,H_11包含3份花紅和3份山荊子,H_12包含1份八棱海棠和2份山荊子,H_19包含1份山荊子,H_26包含2份山荊子,H_33包含2份花紅和1份山荊子,H_36包含1份花紅,H_38包含1份八棱海棠,H_44包含1份八棱海棠。H_6單倍型組合共包含了114份山荊子、33份八棱海棠、19份中國蘋果、19份花紅、16份楸子、4份垂絲海棠、1份新疆野蘋果和1份西府海棠。以H_6為中心形成星狀輻射,向5個分支擴(kuò)散,第一分支為經(jīng)由mv5形成H_9和H_7單倍型,H_7進(jìn)一步衍生為H_8和H_27;第二分支為H_13,第三分支為H_18,第四分支和第五分支分別為H_43和H_45,與H_6和mv11形成閉合環(huán),mv11向外圍衍生為H_32,H_43向外圍衍生為H_24。H_7包括4份楸子(吉林1份、黑龍江3份)、33份山荊子(黑龍江17份、吉林1份、內(nèi)蒙古15份)和1份中國蘋果(吉林),H_27包括1份內(nèi)蒙古山荊子,H_8包括4份山荊子(黑龍江3份和內(nèi)蒙古1份)。H_9包括2份山荊子(內(nèi)蒙古1份和黑龍江1份),H_13為1份黑龍江山荊子,H_18為1份花紅(河北)、6份楸子(河北)和13份山荊子(河北12份、吉林1份)。H_45包括1份河北山荊子,H_43包括3份山荊子(甘肅1份和河北2份)和1份中國蘋果(新疆)。H_39為1份楸子(河北),H_32為1份山荊子(河北)。H_24節(jié)點包含H_24和H_25 2個單倍型,H_24包括4份垂絲海棠(甘肅)、2份楸子(甘肅)和4份山荊子(甘肅1份、黑龍江1份和內(nèi)蒙古2份),H_25包括1份楸子(陜西)、1份山荊子(內(nèi)蒙古)和1份新疆野蘋果(鞏留)。以H_6為中心的星狀輻射區(qū)域,共包含了14份楸子、64份山荊子、4份垂絲海棠、2份中國蘋果、1份花紅和1份新疆野蘋果,主要以山荊子散布在各單倍型中,閉合環(huán)向外圍演化形成的3個單倍型。

2.4.2 第二支系單倍型分布 單倍型H_21由2份新疆霍城的新疆野蘋果和1份中國蘋果白太平構(gòu)成,H_89由1份新疆霍城的新疆野蘋果,H_87也是新疆霍城的1份新疆野蘋果。H_21衍生H_63的分支,此分支還包含H_74、H_88、H_92、H_94和H_95,分支包含8份新疆霍城的新疆野蘋果和2份新源的新疆野蘋果。

mv4有2條衍生路線,一條衍生至mv2,一條衍生至mv7。衍生至mv2的路線經(jīng)過2個鄰接的閉合環(huán),形成3個分支。2個閉合環(huán)中有3個未缺失的單倍型H_58、H_65和H_67,分別包含4份新疆野蘋果(霍城3份和新源1份)、1份新疆野蘋果(新源)和1份新疆野蘋果(新源)。3個分支其一為單倍型H_57,對應(yīng)1份新疆野蘋果(新源);其二為單倍型H_46和H_47,分別由1份花葉海棠獨享;其三由內(nèi)向外的衍生單倍型依次為H_76、H_79和H_86,分別對應(yīng)1份霍城新疆野蘋果、1份鞏留新疆野蘋果和1份鞏留新疆野蘋果。

由mv4衍生至mv7的形成2個鄰接的閉合環(huán),其一由mv7、H_90、H_83、H_62、H_59、H_82、H_16、H_15和mv3組成,其二由mv3、H_15、H_54和H_68組成,mv3和H_15為2個閉合環(huán)的連接點。H_15是2個閉合環(huán)的連接點之一,同時又是網(wǎng)絡(luò)圖上最大的星狀輻射的中心。由mv7經(jīng)歷2條進(jìn)化路徑,趨同演化匯合于H_15。H_15代表最大的一個星狀輻射的中心,包含單倍型組合H_15、H_60、H_61、H_66和H_98,單倍型H_15包含14份八棱海棠、1份垂絲海棠、5份花紅、7份楸子、8份山荊子、72份新疆野蘋果和21份中國蘋果,72份新疆野蘋果中有14份來源于鞏留、9份來源于霍城、49份來源于新源,單倍型H_60包括1份新源新疆野蘋果,H_61為1份新源新疆野蘋果,H_66為1份霍城新疆野蘋果,H_98為1份鞏留新疆野蘋果。最大的輻射中心H_15單倍型組合共包含76份新疆野蘋果、21份中國蘋果、14份八棱海棠、8份山荊子、7份楸子、5份花紅和1份垂絲海棠,其中51份為新源的新疆野蘋果。H_54與H_15相連,H_54代表單倍型組合包含單倍型H_54、H_42、H_69、H_78、H_81、H_93、H_96和H_99,H_54包括6份新疆野蘋果,其中來源于鞏留3份、霍城2份和新源1份;H_42包括77份新疆野蘋果,其中來源于鞏留36份、霍城13份和新源28份;H_69包括3份新疆野蘋果,其中來源于霍城2份和鞏留1份,H_78包括2份新疆野蘋果,其中來源于鞏留1份和霍城1份;H_81包括1份來源于霍城的新疆野蘋果, H_93和H_96分別包括來源于霍城的1份和鞏留的1份新疆野蘋果,H_99包括1份鞏留新疆野蘋果。H_54單倍型組合中全部為新疆野蘋果,其中新疆鞏留新疆野蘋果43份、新疆霍城新疆野蘋果20份、新疆新源新疆野蘋果29份。H_68包括1份新疆新源的新疆野蘋果,H_90為1份新疆霍城新疆野蘋果。mv7向上的閉合環(huán),經(jīng)由全部為新疆野蘋果的單倍型以及mv3,演化為H_15。H_83為1份新疆霍城新疆野蘋果,H_62為1份霍城和2份新源新疆野蘋果,H_59為1份新源新疆野蘋果,H_82為1份霍城新疆野蘋果,H_16為2份花紅和4份中國蘋果。mv7向下的閉合環(huán),經(jīng)過4個新疆野蘋果獨享的單倍型和1個花紅和新疆野蘋果的混合單倍型,演化為H_15。

mv7經(jīng)過一步突變衍生單倍型H_90,H_90進(jìn)一步向外圍經(jīng)過48步突變衍生擴(kuò)散形成單倍型H_20,由1份山楂海棠獨享單倍型H_20。

單倍型H15為最大的星狀輻射中心,向外圍分別演化為H_75、H_48、H_52、H_77和H_55,H_75為1份新疆鞏留新疆野蘋果,H_48為1份甘肅的中國蘋果,H_55為1份新疆新源的新疆野蘋果,H_77為1份鞏留的新疆野蘋果。H_52為單倍型組合,還包含單倍型H_49、H_56、H_84、H_97和H_100。單倍型H_52為21份新疆野蘋果(鞏留10份、霍城4份和新源7份),H_49為2份新疆野蘋果(霍城1份和新源1份)和1份甘肅中國蘋果,H_56為2份新源的新疆野蘋果,H_84為1份霍城新疆野蘋果,H_97為1份鞏留新疆野蘋果,H_100為1份鞏留新疆野蘋果。以H_15為中心的星狀輻射向外圍擴(kuò)散形成的所有單倍型中共包含了14份鞏留新疆野蘋果、6份霍城新疆野蘋果、11份新源新疆野蘋果和2份甘肅的中國蘋果。

2.4.3 第三支系單倍型分布 mv18第1個分支衍生為H_51并形成H_51、H_4、H_23和mv20組成的閉合環(huán),另外一個分支是分別由mv21、mv22和mv23以及mv25、mv26和mv27組成的2個閉合環(huán)相連接。第1個分支的H_51為1份四川的變?nèi)~海棠,H_4為22份四川的變?nèi)~海棠和1份云南的變?nèi)~海棠,H_23為1份垂絲海棠和9份山荊子(甘肅、黑龍江、內(nèi)蒙古和山西)。單倍型H_51分別經(jīng)由H_4和H_23演化為mv20。H_23依次衍生為H_28和H_29。H_28為2份八棱海棠、1份垂絲海棠、9份花紅、3份楸子、1份山荊子和1份中國蘋果;H_29單倍型為2份西府海棠,位于網(wǎng)絡(luò)圖最外圍。mv20經(jīng)過29個突變位點演化為H_3,H_3為1份云南的湖北海棠;經(jīng)過1個突變位點演化為mv19,并形成H_31和H_41 2個單倍型。H_31位1份湖北海棠和1份新疆野蘋果,H_41為1份八棱海棠。mv18的第2個分支經(jīng)過第1個閉合環(huán)后在最外圍形成單倍型H_2,包括1份云南的花紅;經(jīng)過第2個閉合環(huán)在最外圍形成單倍型H_1、H_5和H_50,其分別為1份滄江海棠、1份滇池海棠和1份隴東海棠。

2.4.4 第四支系單倍型分布 mv16衍生的單倍型H_70為1份新疆的楸子,H_70向外圍擴(kuò)展為mv12和H_17。mv12衍生為最外圍的單倍型H_71和H_40,分別為1份新疆的中國蘋果和1份山西楸子、1份山西中國蘋果。H_17衍生成的單倍型H_10為小星狀輻射的中心,H_10包含3份八棱海棠、8份花紅、4份楸子和16份山荊子(河北8份、黑龍江8份)和13份中國蘋果(河北2份、黑龍江1份、吉林8份、內(nèi)蒙古1份和山東1份)。星狀輻射的外圍有單倍型H_14、H_30、H_34、H_35和H_37,分別為1份黑龍江山荊子、1份新疆楸子和1份河北西府海棠、1份河北楸子、1份河北花紅、1份河北花紅。以H_10為中心的性狀輻射主要包含蘋果屬植物的栽培種。

2.5 蘋果屬植物種群遺傳關(guān)系

計算供試蘋果屬植物15個種間的遺傳距離并用Neighbour-Joining的方法構(gòu)建聚類樹(圖2)。通過種群遺傳距離的比較,在Neighbor-Joining聚類樹可以識別4個種群組合,花紅、山荊子、西府海棠、八棱海棠、楸子、變?nèi)~海棠、花葉海棠、湖北海棠和垂絲海棠被歸在種群組合Ⅰ中,中國蘋果和新疆野蘋果歸在種群組合Ⅱ中,滇池海棠、滄江海棠和隴東海棠歸在種群組合Ⅲ中,山楂海棠單獨成為種群Ⅳ。

圖2 基于群體間遺傳距離構(gòu)建的蘋果屬15個種的一致性NJ樹

3 討論

3.1 蘋果屬植物遺傳多樣性

722份蘋果屬植物的4個葉綠體DNA區(qū)域中,核苷酸多樣性和單倍型多樣性最高的區(qū)域均為trnH-psbA(Pi=0.034 09,Hd=0.808),最低的區(qū)域均為5′trnL-trnF(Pi=0.000 78,Hd=0.577)。4個葉綠體DNA合并區(qū)域的遺傳多樣性(Pi=0.008 52,Hd=0.879),明顯高于170個物種的平均數(shù)值(0.826～0.670)[27]。在葉綠體DNA水平上,蘋果屬植物具有高水平的遺傳多樣性。中國原產(chǎn)蘋果屬植物具有較高核苷酸多樣性和單倍型多樣性,表明其由一個大而穩(wěn)定的種群經(jīng)過長時間演化所產(chǎn)生或是2個不同系群的種群二次接觸,這與Clegg等[28]的理論是相一致的。

3.2 蘋果屬植物起源演化分析

722份中國原產(chǎn)蘋果屬植物4個葉綠體DNA區(qū)域的Tajima′s D 檢驗全部為負(fù)值,蘋果屬植物在進(jìn)化過程中有明顯的種群擴(kuò)張。區(qū)域trnS-trnGspacer+intron 和5′trnL-trnF的D值分別在P<0.05和P<0.01的水平上顯著,區(qū)域trnH-psbA和trnT-5′trnL分別在P>0.10和0.10>P>0.05水平上不顯著。4個cpDNA區(qū)域片段組合后的Tajima′s D值為-1.503 16,在P>0.10檢測水平上不顯著。區(qū)域trnS-trnGspacer+intron 和5′trnL-trnF的遺傳進(jìn)化過程不符合中性進(jìn)化模型,自然選擇為其遺傳變異主要動力;而區(qū)域trnH-psbA和trnT-5′trnL則符合中性進(jìn)化模型,遺傳變異主要來自于種群內(nèi)突變或隨機(jī)漂變。整體符合中性進(jìn)化模型,說明蘋果屬植物的遺傳進(jìn)化以種群內(nèi)突變或者隨機(jī)漂變?yōu)橹鳌?/p>

中國原產(chǎn)蘋果屬植物按照種和來源劃分為15個種群和44個居群。考慮到地理因素造成的遺傳分化,按照地理來源劃分的居群內(nèi)的遺傳差異是變異的主要因素,種群內(nèi)居群間的遺傳變異最少,說明種內(nèi)差異和地理隔離造成的各種居群內(nèi)差異是蘋果屬植物遺傳變異的主要因素,這與高源等[29]利用SSR分子標(biāo)記方法對蘋果屬植物研究取得的結(jié)果相一致。

根據(jù)不同種群間的遺傳距離進(jìn)行聚類,種群組合Ⅰ的9個種中,包括主要分布于云南和四川橫斷山區(qū)的4個野生種變?nèi)~海棠、湖北海棠、花葉海棠和垂絲海棠,及野生種山荊子與4個栽培種楸子、八棱海棠、西府海棠和花紅;中國蘋果與新疆野蘋果歸為一組;滇池海棠、滄江海棠和隴東海棠歸為一組;山楂海棠獨成一組,與其他種的遺傳距離均較遠(yuǎn)。蘋果屬植物各種的分類歸屬與其種屬關(guān)系和地理分布明顯相關(guān),這與張春雨等[30]對蘋果屬植物的遺傳關(guān)系研究得出相同的結(jié)論。

722份蘋果屬植物種質(zhì)的4個葉綠體DNA區(qū)域合并片段的單倍型鄰接網(wǎng)絡(luò)圖中,各地方種群所屬的單倍型呈現(xiàn)一種混雜的分布格局,有的種獨享單倍型,有的單倍型涵蓋多個地區(qū)的多個種。鄰接網(wǎng)絡(luò)中心位置的單倍型mv8、mv9、mv16、mv17和mv18形成閉合環(huán),由中心區(qū)域向不同的方向衍生出蘋果屬各種,但其全部為缺失單倍型,有可能這些最原始的單倍型材料已經(jīng)流失滅絕,也有可能是在我們已經(jīng)密集搜集的區(qū)域還沒有遇到。

由網(wǎng)絡(luò)中心區(qū)域不斷衍生形成的4個主要支系充分體現(xiàn)出蘋果屬植物不同種具有不同的演化路線。

第一支系以單倍型H_6為中心,H_6包含了二分之一供試的山荊子種質(zhì)、垂絲海棠、八棱海棠、楸子、花紅和三分之一供試的中國蘋果。并形成以單倍型H_6為中心的星狀輻射,星狀輻射的外圍單倍型均以山荊子居多,說明山荊子具有明顯的種群擴(kuò)張。單倍型H_6也是相對較老的單倍型。

第二支系中,由缺失單倍型經(jīng)過2條線路趨同演化至單倍型H_15,在這個過程中有個最大的單倍型H_54全部為新疆野蘋果,衍化成的H_15包含了新疆野蘋果、山荊子、垂絲海棠和4個栽培種中國蘋果、八棱海棠、楸子和花紅。H_15包含的76份新疆野蘋果中有51份來自新疆新源,除此之外還包含了三分之一供試的中國蘋果種質(zhì)。此支系的衍化過程可以說明三點:第一,新疆野蘋果在進(jìn)化過程中有向新疆新源的新疆野蘋果趨同進(jìn)化的趨勢;第二,新疆野蘋果起源要早于4個栽培種中國蘋果、八棱海棠、楸子、花紅的部分種質(zhì),栽培種中的部分單倍型由新疆野蘋果的單倍型演化而來;第三,單倍型H_15包含了4個栽培種和2個野生種,是相對比較古老的單倍型。以H_15為中心的星狀輻射,向外圍種群擴(kuò)張,外圍單倍型以新疆野蘋果為主。說明在新疆野蘋果的進(jìn)一步演化過程中,由于人類活動與蘋果屬植物的栽培種以及山荊子和垂絲海棠之間有基因交流。第一支系中有個比較特殊的分支,山楂海棠遠(yuǎn)離以新疆野蘋果為主的衍生路線,在外圍獨享一個單倍型。山楂海棠與新疆野蘋果的遺傳距離較遠(yuǎn),從未知單倍型經(jīng)過多步突變演化形成。部分栽培蘋果由新疆野蘋果演化而來,本研究中部分栽培蘋果的起源演化過程與前人推斷結(jié)論相一致[31],但本研究中還有一部分蘋果栽培種的發(fā)展演化與新疆野蘋果并不相關(guān)。

第三支系單倍型H_3、H_4、H_29、H_31、H_41、H_51均分別為湖北海棠、變?nèi)~海棠和花葉海棠、西府海棠、湖北海棠、八棱海棠以及變?nèi)~海棠,根據(jù)單倍型由內(nèi)而外的衍化順序,由中心到外圍的分生順序依次為變?nèi)~海棠、花葉海棠、八棱海棠、湖北海棠和西府海棠。變?nèi)~海棠和花葉海棠經(jīng)歷了分化又趨同演化,湖北海棠分化要晚于變?nèi)~海棠和花葉海棠,西府海棠的分化要晚于蘋果屬植物的其他3個栽培種八棱海棠、花紅和楸子。

第四支系以山荊子和中國蘋果為主的單倍型H_10為中心,形成小的星狀輻射,向外圍種群擴(kuò)張形成了山荊子、楸子、花紅和西府海棠。山荊子與部分中國蘋果有共享單倍型,說明山荊子與在中國栽培兩千多年的中國蘋果的起源演化過程明顯相關(guān),Duan等[31]認(rèn)為山荊子參與了中國栽培蘋果的馴化過程,而本結(jié)果再次證明了該結(jié)論。西府海棠還是出現(xiàn)在外圍,再次說明其分化時間要晚于蘋果屬的其他供試栽培種。中國蘋果并未在外圍單倍型中出現(xiàn),中國蘋果的部分單倍型分化要早于楸子、花紅和西府部分單倍型。第四支系云南的花紅、滇池海棠、滄江海棠和隴東海棠各在外圍獨享一個單倍型,其中云南的花紅在其中一支分支上分化時間要早,滇池海棠、滄江海棠和隴東海棠在另一分支,滇池海棠和隴東海棠的親緣關(guān)系要近于滄江海棠,滇池海棠的分化時間要略晚于隴東海棠。