谷子萌芽期抗旱相關QTL定位研究

代小冬,朱燦燦,王春義,秦 娜,宋迎輝,代書桃,李君霞

(河南省農業(yè)科學院 糧食作物研究所,河南 鄭州 450002)

干旱脅迫對植物的生長、光合作用、氣孔運動、營養(yǎng)代謝等產生不良影響,進一步影響植物的生長發(fā)育,造成作物產量和品質顯著下降。全球干旱、半干旱地區(qū)約占土地總面積的36%,占耕地面積的43%。中國是世界上主要干旱國家之一,干旱與半干旱土地面積約占全國土地面積的52.5%,占全國耕地面積的38%[1]。我國每年因干旱造成的糧食減產占氣象災害損失的50%左右。谷子(Setariaitalica(L.)Beauv)古稱粟,起源于我國黃河流域,是禾本科狗尾草屬的一個栽培種(2n=2X=18),是世界上最古老的栽培作物,迄今已經有8 700多年的歷史[2]。我國谷子的種植面積約200萬hm2,約占世界谷子總面積的80%,產量占世界總產的90%[3]。谷子以其抗旱耐瘠、營養(yǎng)豐富、耐儲藏著稱。另外,谷子還是優(yōu)良的飼草作物,是旱區(qū)畜牧業(yè)重要的飼料來源[4]。谷子的抗旱優(yōu)勢已被人們熟知和接受,對谷子抗旱性的研究也越來越受到人們的重視。代小冬等[5]認為,在PEG滲透劑模擬干旱脅迫下,谷子活力抗旱指數(shù)、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對胚芽長、相對胚根長與萌發(fā)抗旱指數(shù)極顯著正相關,可以作為谷子萌芽期抗旱性鑒定的指標。高汝勇等[6]研究了12個谷子品種的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長、苗高、鮮質量、活力指數(shù),并采用模糊隸屬函數(shù)對其抗旱性進行了評價。Qie等[7]利用谷子品種豫谷1號與青狗尾草構建的RIL群體定位到18個與抗旱相關的QTL。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn),SiARDP參與了依賴于ABA的信號傳導途徑,在提高谷子抗旱方面發(fā)揮了重要作用。Feng等[9]通過對谷子中39個核因子Y(NF-Y)基因的功能分析發(fā)現(xiàn),SiNF-YA1和SiNF-YB8可以激活相關抗旱基因,提升谷子生理狀態(tài),達到抗旱的目的。Tang等[10]對抗旱品種豫谷1號和干旱敏感品種安-04在干旱條件下的轉錄組進行分析,并結合耐旱相關的QTL,確定了20個抗旱候選基因。Wang等[11]發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫條件下有14個miRNAs 的表達量上調,4個miRNAs的表達量下調。Pan等[12]利用定量蛋白質組學分析的方法發(fā)現(xiàn)了321個蛋白與谷子的抗旱性相關。谷子的抗旱性研究雖然取得了一定的進展,但是由于谷子是區(qū)域性的小雜糧作物,對其研究的廣度和深度還遠遠不夠。鑒于此,本研究利用山西2010和K359×M4-1構建的F2群體為作圖群體,采用 2b-RAD測序技術構建遺傳連鎖圖譜,并進行谷子萌芽期抗旱相關QTL定位,以期鑒定一些新的、可穩(wěn)定遺傳的QTL位點,為解析谷子抗旱機制及抗旱新品種選育提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料山西2010和K359×M4-1分別來源于山西省農業(yè)科學院經濟作物研究所和河北省農林科學院谷子研究所。山西2010不僅具有較強的萌芽期抗旱性,而且在谷子苗期抗旱性鑒定評價中表現(xiàn)良好。K359×M4-1雖然具有兼抗咪唑乙煙酸和拿捕凈2種除草劑的優(yōu)異性狀,但是其萌芽期抗旱性較弱。以山西2010為母本,K359×M4-1為父本配制雜交組合,獲得包含100個單株的F2群體,并利用F2∶3家系的抗旱性確定F2群體的表型。

1.2 谷子萌芽期干旱脅迫處理

利用20%的PEG 6000對親本及100個F2∶3家系種子進行萌芽期抗旱性鑒定。每份材料選擇飽滿的種子,首先用5%次氯酸鈉消毒15 min,然后用ddH2O沖洗干凈。選擇50粒滅過菌的種子放入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中,然后將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱,28 ℃暗培養(yǎng)。每個培養(yǎng)皿中加入5 mL 20%的PEG 6000,作為干旱脅迫處理;加入5 mL ddH2O,作為對照,重復3次。

1.3 萌芽期抗旱性調查

分別調查第2,4,6,8天種子的發(fā)芽數(shù),并將第2,4,6,8天的種子萌發(fā)率記為nd2、nd4、nd6、nd8。參考Bouslama等[13]的方法計算萌發(fā)指數(shù)(PI,Promptness index)和萌發(fā)抗旱指數(shù)(SIDR,Sprout index of drought resisting),PI=1.00nd2+0.75nd4+0.50nd6+0.25nd8,SIDR=處理萌發(fā)指數(shù)/對照萌發(fā)指數(shù)。

1.4 建庫測序與基因分型

提取萌發(fā)種子的基因組DNA,抽提合格后,利用2b-RAD五標簽串聯(lián)技術進行測序文庫構建,文庫質控合格后在Illumina Hiseq X10平臺進行Paired-end測序(青島歐易生物科技有限公司)。利用SOAP軟件[14]將各樣品的測序數(shù)據比對到參考序列上,獲得可用于分型的Unique標簽數(shù)目及深度。利用最大似然法進行SNP位點的分型。為保證后續(xù)分析的準確性,分型工作完成后對分型結果進一步過濾:①剔除所有樣品中低于80%個體可以分型的位點;②剔除MAF低于0.01的位點;③剔除含有1種或4種堿基型的SNP位點;④剔除標簽內多于2個SNP的位點;⑤剔除只有1種分型的位點。然后篩選親本純合的SNP差異位點,并進行子代分型轉化。

1.5 遺傳圖譜構建

使用Joinmap 4.1[15]軟件剔除相似度=1的冗余標記,剔除X2>100的標記,剔除可分型個體數(shù)<80%的標記。將符合條件的標記利用Joinmap 4.1 軟件進行連鎖圖譜的構建,標記以LD>5進行分群,使用回歸算法和Kosambi′s函數(shù)[16]計算遺傳距離。

1.6 基因定位

根據作圖群體表型數(shù)據,結合遺傳連鎖圖譜,對性狀利用MapQTL[17]軟件進行QTL分析。具體分析步驟如下:①利用置換檢驗做1 000次重復,估算單個連鎖群范圍內α=0.05水平上的LOD閾值;②利用區(qū)間作圖法(Interval mapping,IM)進行QTL分析,在每條連鎖群上每隔1 cM對QTL存在的可能性掃描一次;③以單個連鎖群范圍內α=0.05水平上的LOD值作為閾值,即出現(xiàn)一個LOD峰值大于或等于閾值時視為該位點存在一個QTL。LOD峰值位置即為相應QTL基因最可能的位置。

2 結果與分析

2.1 親本與100個F2∶3家系的萌芽期抗旱性分析

山西2010的萌芽期抗旱性較好,萌發(fā)抗旱指數(shù)達到0.92,K359×M4-1的萌芽期抗旱性較差,僅為0.64。F2群體的萌發(fā)抗旱指數(shù)在0.47～0.94。表現(xiàn)出連續(xù)偏正態(tài)分布(圖1),表明該性狀為多基因控制的數(shù)量性狀。

圖1 親本及F2群體萌芽期抗旱性分析

2.2 遺傳連鎖圖譜構建結果

以山西2010與K359×M4-1雜交得到F2群體為作圖群體,利用篩選到的583個SNP標記進行遺傳圖譜的構建,獲得一張包含9個連鎖群的圖譜,總長為566.8 cM,標記平均間隔為0.97 cM(表1)。每條染色體長度為31.4～94.3 cM,平均長度為63.0 cM。染色體標記數(shù)目為31～106個,平均數(shù)目為64.8個。

表1 構建的遺傳連鎖圖譜信息

2.3 萌芽期抗旱性分析

利用MapQTL軟件對萌芽期抗旱性進行QTL分析,共檢測到3個萌芽期抗旱性相關QTL位點,分別位于第5,6染色體上,分別命名為qSIDR-5a、qSIDR-6a和qSIDR-6b(表2、圖2),可解釋12.4%～14.3%的表型變異,其中,第5染色體上qSIDR-5a的表型貢獻率最高,達到14.3%。

圖2 谷子萌芽期抗旱性QTL檢測

表2 F2群體中檢測到的萌芽期抗旱性QTL

3 結論與討論

干旱是限制作物生長的主要非生物逆境之一,對作物的產量和品質造成了嚴重的影響。谷子起源于我國,并在長期的馴化和栽培過程中適應了干旱、半干旱地區(qū)的生態(tài)環(huán)境,成為一種優(yōu)良的抗旱資源,在作物抗旱種質利用方面具有獨特的研究價值[18]。另外,谷子具有基因組小、重復序列少、生育期短、繁殖系數(shù)高等特點,已漸漸成為功能基因組研究的新模式作物。所以,谷子在抗旱機制研究方面具有顯著的優(yōu)勢。

萌芽期是作物對水分最敏感的時期,如果該時期受到干旱,將會對作物的正常生長和產量水平造成極大的影響[19]。萌芽期抗旱性研究在對谷子抗旱性早期鑒定和適宜干旱半干旱地區(qū)谷子品種選擇方面具有重要的意義。萌發(fā)抗旱指數(shù)是評價種子萌芽期抗旱性的可靠指標[13]。利用這個指標,已經成功鑒定出谷子[5,20]、水稻[21]、玉米[22]等作物的萌芽期抗旱性。

近年來,分子標記技術在作物抗逆性研究和優(yōu)質、高產、多抗品種選育方面發(fā)揮了重要作用[23-27]。過去常用于遺傳連鎖圖譜構建的第2代分子標記主要是 RFLP、AFLP、RFLP、ISSR和SSR等,隨著高通量測序技術的發(fā)展,SNP因具有良好的多態(tài)性和極高的豐度成為植物遺傳育種研究中的理想遺傳標記[28]。眾多學者利用SNP標記構建了多種作物的連鎖圖譜,并成功對控制小麥抽穗期和開花期[29]、玉米葉色[30]、鋁脅迫下甘藍型油菜萌發(fā)期相關性狀[31]、甜瓜果實苦味[32]等的基因進行了定位。利用SNP遺傳圖譜研究谷子萌芽期抗旱性還屬首次。本研究利用SNP遺傳圖譜,對干旱脅迫條件下親本及作圖群體種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)進行了QTL定位分析。共檢測到3個控制谷子萌芽期抗旱性的QTL,分別位于第5和第6染色體上。其中第5染色體上qSIDR-5a的表型貢獻率最高,達到14.3%。通過與Qie等[7]研究結果比較發(fā)現(xiàn),本研究定位的3個萌芽期抗旱QTL均未找到相同區(qū)間報道,是新的QTL。

谷子抗旱機制復雜,關于抗旱分子機制的研究還處于起步階段。隨著谷子基因組學和功能基因組學研究的不斷深入,越來越多的谷子抗旱相關基因將會不斷被挖掘,本研究結果可為闡明谷子抗旱分子機制和指導谷子生產實際奠定堅實的基礎。