棉花GhMADS43基因的克隆及酵母自激活分析

張曉紅,李曉琪,張 崢,胡根海

(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 新鄉(xiāng) 453003)

MADS-box家族基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真菌、動物和植物中,其在植物中的功能主要是根、葉片、花和果實等的發(fā)育調(diào)控[1-3]。AP1和FUL是MADS-box家族基因中的兩類基因,其序列具有很高的相似性,屬于AP1/SQUA基因亞家族,它們在植物莖尖和花分生組織發(fā)育的過程中有著重要的作用[4-7]。

擬南芥中,AGL8/FUL基因在植株莖尖、花序和莖生葉中高調(diào)表達(dá)[8],該基因除了控制植株形態(tài)的轉(zhuǎn)變、莖生葉的生長和復(fù)合葉的形態(tài)發(fā)育,還具有影響果莢的成熟和開裂等功能[9]。擬南芥FUL蛋白調(diào)控的靶標(biāo)基因SAUR10參與莖和花序的分枝角度發(fā)育,影響植物的株型發(fā)育[10]。番茄FUL蛋白在乙烯調(diào)控合成途徑中與1個MADS-box蛋白RIN作用來調(diào)控番茄果實的成熟[11-12]。桔梗中也有研究表明,FUL同源基因PlacFL1和PlacFL3可能在調(diào)節(jié)開花時間和花的發(fā)育中起保守作用,而PlacFL2可能參與桔梗休眠調(diào)節(jié)[13]。禾本科植物AP1/FUL基因重復(fù)在其小穗的進(jìn)化過程中有重要的作用[14]。AP1基因的功能集中于花器官的識別,它在細(xì)胞分裂素途徑中能抑制細(xì)胞分裂素的合成并激活細(xì)胞分裂素的降解,最終阻止萼片的形成[15-16],還可以調(diào)控樹木光周期途徑中樹木季節(jié)性的生長[17]。然而,AP1/SQUA亞組中基因在棉花莖尖分生組織發(fā)育乃至花分生組織發(fā)育過程中的功能及調(diào)控通路研究仍未見詳細(xì)報道。

棉花是我國重要的一種經(jīng)濟(jì)作物,目前，我國棉花種植在向新疆全程機械化推進(jìn),其中早熟性和株型是很重要的研究方向[18-20]。為探索MADS-box 家族基因中FUL基因在棉花莖尖分生組織和花發(fā)育調(diào)控過程中的功能,本研究以棉花栽培種中棉所50和早鈴1號為材料,克隆FUL的同源基因GhMADS43,對其進(jìn)行組織特異性表達(dá)模式及酵母自激活性分析,為后期篩選與該蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ),從而為棉花早熟分子改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

所用棉花栽培種材料為中棉所50(CCRI50)和早鈴1號(Zaoling No.1)。試驗所用DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、pMD18-T載體、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司,植物多糖多酚總RNA抽提試劑盒購自天根公司,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自康為世紀(jì)公司,誘餌空載體質(zhì)粒pGBKT7、對照質(zhì)粒pGBKT7-53及酵母菌株Y2HGold購自Clontech,引物合成及序列測定由英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 材料處理及取樣

試驗材料種植于河南科技學(xué)院D407人工氣候培養(yǎng)室,培養(yǎng)條件為長日照,光照/黑暗為14 h/10 h,光照時間為8:00-22:00,溫度為28 ℃,分別選取棉花材料中棉所50在二葉展平時期的根、莖、葉、頂芽、開花當(dāng)天的花、10 d的纖維和胚珠等不同組織。并于四葉展平期到七葉展平期取2個棉花材料的莖尖樣品,取樣后快速放入液氮中冷凍,并于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 GhMADS43基因克隆

根據(jù)陸地棉基因組序列,設(shè)計含有合適酶切位點的特異引物,以棉花莖尖的cDNA為模板,對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL,其中10×PCR Buffer 5 μL,dNTPs 4 μL,上下游引物(10 μmol/L)各2 μL,EXTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL,cDNA模板5 μL,滅菌ddH2O 31.75 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用加了核酸染料Gelred的1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,并將陽性克隆送英駿生物技術(shù)有限公司測序驗證。試驗中所用PCR引物見表1。

1.4 基因的定量表達(dá)分析

使用天根多糖多酚RNA抽提試劑盒提取不同組織樣品的總RNA,所使用RNA的質(zhì)量需保證A260/280在1.8～2.1,A260/230大于1.8。使用TaKaRa 公司RR047A試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,使用gDNA Eraser消化總RNA中殘留的基因組DNA,進(jìn)行30 min反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA。使用SYBR Green分析法并用TaKaRa公司熒光定量試劑盒RR420A對基因進(jìn)行表達(dá)分析,所用儀器為Applied Biosystems Q6實時熒光定量PCR儀。試驗中所用熒光定量PCR引物見表1。

表1 棉花GhMADS43基因克隆及表達(dá)所用引物

1.5 誘餌重組載體構(gòu)建

以測序正確的pMD18-GhMADS43菌液為PCR模板,通過特異性Infusion引物再次擴(kuò)增GhMADS43的基因序列,并將載體 pGBKT7用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切形成黏性末端,利用Infusion連接試劑盒進(jìn)行連接。將連接后的新鮮菌液送英駿生物技術(shù)有限公司測序,測序結(jié)果正確的陽性克隆即為重組誘餌質(zhì)粒。

1.6 酵母轉(zhuǎn)化及快速篩選

參照Clontech公司酵母雙雜交手冊進(jìn)行酵母菌株Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。分別將轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒后的Y2HGold 酵母菌涂布于SD/-Trp平板,倒置放30 ℃恒溫箱培養(yǎng)3～5 d,挑取SD/-Trp平板上菌落生長良好、直徑約2～3 mm的菌落于1.5 mL無菌離心管,加入含有終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡那霉素的SD/-Trp液體培養(yǎng)基1 mL,以封口膜封口后在200 r/min的搖床上30 ℃培養(yǎng)10 h,進(jìn)行PCR鑒定。具體方法: 吸取20 μL酵母菌液于PCR管中,6 000 r/min離心3 min,棄上清液,加入20 μL酵母菌裂解液,渦旋振蕩1 min,沸水浴中處理10 min,-80 ℃冰箱中冷凍15 min,12 000 r/min離心30 s,重復(fù)沸水浴和超低溫冰箱冷凍1次,取1 μL上清液作為PCR模板進(jìn)行檢測。取6 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 誘餌蛋白毒性和自激活檢測

參照Clontech公司Matchmaker TM Gold 酵母雙雜交系統(tǒng)手冊,將轉(zhuǎn)化后的重組誘餌載體、pGBKT7-53載體和陰性對照的酵母菌Y2HGold分別加入6 μL 0.9%的NaCl溶液并點于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/-His/-Ade平板上。30 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3～5 d,觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhMADS43基因克隆與分析

將從棉花栽培種材料中克隆到的GhMADS43基因的 CDS 序列,連接pMD-18載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α并進(jìn)行測序驗證。結(jié)果表明,GhMADS43基因CDS全長696 bp,編碼231氨基酸(圖1-A)。進(jìn)化樹分析表明,GhMADS43蛋白與可可中的FUL的同源蛋白TcAGL8親緣關(guān)系相近(圖1-B)。

M.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)記;1.GhMADS43基因的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 GhMADS43基因的表達(dá)分析

組織特異性表達(dá)模式分析得出,GhMADS43基因在棉花的根和頂芽中優(yōu)勢表達(dá),在成熟的花、纖維和胚珠中表達(dá)量顯著降低(圖2-A)。選取一式果枝早熟棉早鈴1號和無限果枝早熟棉材料中棉所50從四葉展平時期至七葉展平時期的莖尖分生組織樣品進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明,從五葉期開始GhMADS43基因在無限果枝中棉所50中的表達(dá)量高于一式果枝早鈴1號,隨著取樣時間的推移,在中棉所50的六葉期和七葉期，GhMADS43基因的表達(dá)量顯著高于早鈴1號(圖2-B)。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 GhMADS43基因誘餌載體的構(gòu)建和鑒定

根據(jù)測序正確的基因序列設(shè)計Infusion引物,以T載體為模板擴(kuò)增基因序列,并與雙酶切后的誘餌質(zhì)粒pGBKT7進(jìn)行重組,轉(zhuǎn)化子以基因的特異性引物做菌液PCR鑒定。結(jié)果表明,成功擴(kuò)增到GhMADS43全長片段,選取陽性克隆進(jìn)行測序并對測序結(jié)果分析,獲得與預(yù)期結(jié)果相符且讀碼框正確的序列,成功構(gòu)建酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7-GhMADS43(圖3)。

M.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)記;1.pGBKT7-GhMADS43誘餌載體質(zhì)粒提取檢測;2.雙酶切誘餌載體進(jìn)行驗證。

2.4 誘餌質(zhì)粒酵母菌的鑒定和毒性檢測

將上述構(gòu)建好的誘餌載體和陽性對照pGBKT7-53分別轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2HGold 中,待生長3～5 d后挑取2 mm左右的酵母單克隆在SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,并進(jìn)行菌液PCR,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖(圖4-A)所示,誘餌重組質(zhì)粒和陽性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后酵母菌落PCR產(chǎn)物條帶大小與目標(biāo)基因大小一致,說明重組誘餌質(zhì)粒載體pGBKT7-GhMADS43和陽性對照質(zhì)粒pGBKT7-53轉(zhuǎn)化酵母成功。缺陷固體培養(yǎng)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)有重組誘餌載體在SD/-Trp平板上和轉(zhuǎn)有對照的平板上菌落密集程度相似,生長正常,菌落大小均介于2～3 mm(圖4-B)。重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GhMADS43和陽性對照質(zhì)粒pGBKT7-53的菌液過夜培養(yǎng)后,OD600的檢測值分別為1.002和1.121,均超過標(biāo)準(zhǔn)值0.8,說明重組誘餌蛋白對酵母菌Y2HGold 生長無毒性,可進(jìn)行自激活活性檢測。

圖4 誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母PCR檢測(A)和毒性檢測(B)

2.5 X-α-Gal驗證誘餌載體自激活活性

通過LacZ報告基因的表達(dá)來檢測誘餌載體的自激活活性。陽性酵母單克隆轉(zhuǎn)移至SD/X-α-Gal/-Trp篩選培養(yǎng)基上,待酵母細(xì)胞生長3～5 d后,觀察酵母細(xì)胞顏色變化情況,陽性對照的酵母細(xì)胞變?yōu)樗{(lán)色,陰性對照始終不變藍(lán),而誘餌質(zhì)粒的酵母細(xì)胞的藍(lán)色較弱(圖5)。

圖5 X-α-Gal驗證誘餌蛋白自激活結(jié)果

2.6 不同濃度3-AT檢測誘餌載體自激活活性

進(jìn)一步通過His3報告基因的表達(dá)與否檢測誘餌載體的自激活活性。His3編碼的酶參與組氨酸的生物合成,其功能可被特異性競爭抑制劑3-AT所抑制。若誘餌載體本身有激活作用,His3報告基因的轉(zhuǎn)錄被激活,則轉(zhuǎn)化后的酵母菌能夠在缺陷型平板SD/-Trp/-His/-Ade上生長。將陽性酵母菌株接種至分別添加0,5,10,25,50,75,100 mmol/L的3-AT三缺SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上。從圖6可以看出,誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的酵母菌在不同濃度三缺培養(yǎng)基中,菌落均不生長,表明誘餌質(zhì)粒在此濃度下對宿主酵母菌無自激活作用,后續(xù)可用于篩選酵母雙雜交文庫(圖6)。

圖6 不同 3-AT濃度檢測誘餌蛋白自激活結(jié)果

3 討論與結(jié)論

棉花是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物,棉花機械化種植生產(chǎn)關(guān)乎棉農(nóng)的切身利益。在綜合性狀發(fā)展的前提下,早熟也是棉花品種培育的一個重要目標(biāo)[21-22]。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族與植物葉片、莖尖和花分生組織發(fā)育相關(guān)[23]。其中FUL基因具有更廣泛的功能,它既能影響葉片和莖尖的發(fā)育,又能在花發(fā)育的早期促進(jìn)花序分生組織的形成,并在晚期心皮和角果等花器官發(fā)育中行使功能[24-26]。

本研究從棉花栽培種中克隆到FUL的同源基因GhMADS43,發(fā)現(xiàn)它在棉花的根和頂芽中表達(dá)量較高,而在成熟的花器官中表達(dá)量較低,推測該基因的功能可能與根尖和莖尖分生組織的發(fā)育和花蕾的前期形成有關(guān)。金魚草中FUL的同源基因DEFH28,可以在花序頂端分生組織中表達(dá),從而誘導(dǎo)花序分生組織轉(zhuǎn)化成花分生組織[27]。AP1和FUL都在花分生組織的發(fā)育中起著重要的作用,兩類基因的功能有重疊也有差異,其功能的分歧可能是由于序列的改變,FUL基因的功能主要參與莖葉和果實的發(fā)育[24]。FUL蛋白負(fù)調(diào)控莖尖分生組織中APETALA2基因的表達(dá),導(dǎo)致分生組織和植物花序生長停滯,促進(jìn)果實和種子出現(xiàn)[28-29]。在擬南芥果莢發(fā)育過程中,FUL能控制角果的生長,并促進(jìn)果莢開裂[30]。棉花中GhMADS43在無限果枝中棉所50中的表達(dá)量高于一式果枝早鈴1號,隨著取樣時間的延長表達(dá)量也呈增加趨勢,那么該基因是否與棉鈴的成熟和開裂有關(guān),仍值得繼續(xù)深入研究。

近年來,酵母雙雜交技術(shù)在植物蛋白質(zhì)互作研究中已成為一種重要手段,在探討植物正常生理功能的分子機制等方面發(fā)揮很大的作用[31]。在利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選文庫的過程中,誘餌蛋白表達(dá)及自激活活性分析至關(guān)重要。一些轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄自激活,嚴(yán)重影響后續(xù)的篩選工作。因此,將克隆到的GhMADS43基因構(gòu)建到了酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7。分析發(fā)現(xiàn),該蛋白質(zhì)無自激活活性,可用于后續(xù)酵母雙雜交文庫的篩選,為研究該基因在莖尖分生組織發(fā)育過程中的功能及調(diào)控機理提供一定的基礎(chǔ)。